乳酸菌BN1005富硒發(fā)酵條件優(yōu)化

鄧詩貴，許贛榮，倪冬姣*，邢宏博，邢孔萍，賓金榮，鄒新華

（1.播恩集團(tuán)股份有限公司，江西 贛州 341000；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部生物飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 贛州 341000；3.佛山播恩生物科技有限公司，廣東 佛山 528100）

硒（Se）是人體必需微量元素之一，成人推薦攝入量為60 μg/d，最高耐受量為400 μg/d[1]。硒主要以硒蛋白分布于人體與動(dòng)物所有組織中[2]，包括谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還蛋白還原酶、碘甲狀腺素脫碘酶、硒蛋白P、硒蛋白W和硒蛋白S[3-4]。硒代蛋氨酸（selenomethionine，SeMet）可以競(jìng)爭(zhēng)蛋氨酸而參與蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)合成[3]，硒代半胱氨酸（selenocysteine，SeCys）是由通常認(rèn)為的終止密碼子UGA編譯而參與硒蛋白多肽鏈的延伸[5]。硒蛋白可以抗氧化并維持機(jī)體免疫力，還具有抗癌、解毒、保肝等多種生理功能[6-7]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)居民每天硒平均攝入量為44.4 μg/g[8]，遠(yuǎn)沒有達(dá)到國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)推薦的攝入量。硒缺乏會(huì)引起克山病[1]、心血管疾病、癌癥以及神經(jīng)和內(nèi)分泌功能紊亂[9]。

近年來已興起了通過富硒土壤或施用富硒肥料種植富硒茶葉、富硒蔬菜、富硒水稻等[10]農(nóng)作物，通過給養(yǎng)殖畜禽飼喂富硒飼料，增加農(nóng)作物、蛋類和肉制品的硒含量，以提高人體的硒攝入量。然而，富硒益生菌及其發(fā)酵制品生產(chǎn)的有機(jī)硒在機(jī)體內(nèi)表現(xiàn)出更加顯著的抗氧化性、抗菌活性和抗癌活性[11]。BENKO I等[12]通過小鼠實(shí)驗(yàn)證明無機(jī)硒毒性最大，納米硒毒性次之，富硒益生菌安全性最好，其中富硒乳酸菌最安全。

乳酸菌保健功能和安全性已經(jīng)被廣大消費(fèi)者認(rèn)可，其發(fā)酵制品的風(fēng)味和適口性俱佳。本實(shí)驗(yàn)旨在優(yōu)化乳酸菌BN1005的富硒發(fā)酵條件，以期為今后利用富硒乳酸菌規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)富硒產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

乳酸菌（Lactobacillussp.）BN1005：從本實(shí)驗(yàn)室自制富硒酸菜中篩選，由公司實(shí)驗(yàn)室分離保存（-20 ℃冰箱中保藏備用）。

1.1.2 試劑

亞硒酸鈉：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；硒單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）080215）：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、瓊脂：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；葡萄糖、三水乙酸鈉、檸檬酸三銨、CaCO3、NaCl、MgSO4·7H2O、K2HPO4、MnSO4·4H2O：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；吐溫-80、溴甲酚紫：天津大茂化學(xué)試劑廠；以上試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

液體MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母粉5 g、葡萄糖20.0 g、三水乙酸鈉5.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、吐溫-80 1.08 g、K2HPO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·4H2O 0.05 g，去離子水1 000 mL，pH調(diào)至6.2。固體MRS培養(yǎng)基：液體MRS培養(yǎng)基中添加15.0 g/L的瓊脂。

基礎(chǔ)富硒培養(yǎng)基：液體MRS培養(yǎng)基添加5 mg/L亞硒酸鈉。

所有培養(yǎng)基均在121 ℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

MGC微需氧產(chǎn)氣袋、2.5 L立式培養(yǎng)袋：三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HNY-2102D立式恒溫培養(yǎng)振蕩器：天津歐諾儀器股份有限公司；AF640A原子熒光光譜儀：北京北分瑞麗分析儀器（集團(tuán)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株液態(tài)發(fā)酵

將保藏于冰箱的乳酸菌BN1005接種于MRS液體培養(yǎng)基中活化，活化后的菌液以10%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，裝液量為60 mL/250 mL，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，每隔12 h取樣，測(cè)定發(fā)酵液中乳酸菌BN1005生物量、富硒量和富硒率。

1.3.2 富硒培養(yǎng)條件的優(yōu)化

以液體MRS培養(yǎng)基中添加5 mg/L亞硒酸鈉為基礎(chǔ)富硒培養(yǎng)基，分別考察搖床轉(zhuǎn)速（0、50 r/min、100 r/min、150 r/min、200 r/min）、發(fā)酵時(shí)間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h）、亞硒酸鈉添加時(shí)間（0、4 h、6 h、8 h、10 h）對(duì)乳酸菌BN1005富硒的影響，以優(yōu)化搖瓶發(fā)酵工藝條件。

1.3.3 基礎(chǔ)富硒培養(yǎng)基的優(yōu)化

因CaCO3可以中和菌液中的有機(jī)酸，使乳酸菌產(chǎn)酸更加持續(xù)；NaCl可以改變細(xì)胞膜的通透性，會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的有機(jī)硒的跨膜運(yùn)輸。

單因素試驗(yàn)：在1.3.2優(yōu)化后富硒培養(yǎng)條件基礎(chǔ)上，分別考察葡萄糖添加量（20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L、40 g/L、45 g/L）、復(fù)合有機(jī)氮源（蛋白胨∶牛肉膏∶酵母粉=2∶2∶1）添加量（10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L）、檸檬酸三銨添加量（1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L、3.5 g/L）、亞硒酸鈉添加量（3 mg/L、5 mg/L、7 mg/L、9 mg/L、11 mg/L）、CaCO3添加量（0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L）、NaCl添加量（0、1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L、9 g/L）6個(gè)因素對(duì)乳酸菌BN1005富硒的影響。

響應(yīng)面試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)乳酸菌BN1005富硒量影響較顯著的3個(gè)因素亞硒酸鈉添加量（A）、NaCl添加量（B）、葡萄糖添加量（C）為考察變量，以富硒量（Y）為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析優(yōu)化富硒培養(yǎng)基。應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

1.3.4 測(cè)定方法

乳酸菌生物量的測(cè)定：取一定量的菌液于65 ℃烘至質(zhì)量恒定，計(jì)算菌液中菌體細(xì)胞干質(zhì)量（g/L）。

硒含量的測(cè)定：參照參考文獻(xiàn)[13]的方法，富硒量和富硒率計(jì)算公式如下[14]：

2 結(jié)果與分析

2.1 富硒培養(yǎng)條件的優(yōu)化

由圖1A可知，靜置培養(yǎng)并不適合乳酸菌BN1005生長(zhǎng)，可能是亞硒酸鈉等物質(zhì)混合不夠均勻；當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min時(shí)，菌體干質(zhì)量、富硒率和富硒量分別達(dá)到3.5 g/L、26.49%和378.24 μg/g，三者同時(shí)達(dá)到最大值，說明乳酸菌BN1005為兼性厭氧菌，靜置和高轉(zhuǎn)速都不利于其生長(zhǎng)，因此搖床轉(zhuǎn)速確定為100 r/min。由圖1B可知，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間在0～36 h時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其生物量和富硒能力顯著增加，36～48 h其生物量和富硒能力增加不顯著，當(dāng)60 h時(shí)其生物量和富硒能力有所下降，因此培養(yǎng)時(shí)間確定為36 h，此時(shí)乳酸菌BN1005培養(yǎng)液的菌體干質(zhì)量、富硒率和富硒量分別達(dá)到3.57 g/L、27.42%和383.54 μg/g。高濃度的亞硒酸鈉對(duì)菌株生長(zhǎng)有一定抑制作用[15]，推遲亞硒酸鈉添加至培養(yǎng)基中的時(shí)間，有助于乳酸菌BN1005的生長(zhǎng)。由圖1C可知，在培養(yǎng)8 h時(shí)添加亞硒酸鈉5 mg/L，培養(yǎng)至36 h時(shí)取樣測(cè)得菌體干質(zhì)量、富硒率和富硒量分別達(dá)到3.74 g/L，30.01%和401.13μg/g；相對(duì)于其他時(shí)間添加達(dá)亞硒酸鈉，乳酸菌BN1005的富硒量達(dá)到最大值。因此確定亞硒酸鈉的添加時(shí)間為培養(yǎng)8 h。有機(jī)硒主要以硒代氨基酸（硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸等）、硒蛋白（酶類）和硒多糖存在于微生物和動(dòng)植物體內(nèi)[16-17]，當(dāng)亞硒酸鈉在菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)添加至培養(yǎng)基有助于菌體胞內(nèi)有機(jī)硒的積累[18]，對(duì)數(shù)期微生物代謝旺盛，旺盛的酶系反應(yīng)和氨基酸代謝有利于微生物提高對(duì)硒的轉(zhuǎn)化利用[19-20]。

圖1 搖床轉(zhuǎn)速（A）、培養(yǎng)時(shí)間（B）、亞硒酸鈉添加時(shí)間（C）對(duì)乳酸菌BN1005富硒能力的影響Fig.1 Effect of rotate speed (A),culture time (B) and sodium selenite addition time (C) on selenium enrichment of lactic acid bacterium BN1005

綜上，乳酸菌BN1005富硒培養(yǎng)條件優(yōu)化后確定為接種量10%，裝液量為60 mL/250 mL，恒溫37 ℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，亞硒酸鈉添加時(shí)間為培養(yǎng)8 h。

2.2 富硒培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)

由圖2A可知，當(dāng)葡萄糖添加量為35g/L時(shí)，乳酸菌BN1005富硒量和富硒率達(dá)到最大值。低濃度的葡萄糖延緩了菌株的生長(zhǎng)代謝，高濃度的葡萄糖導(dǎo)致菌株快速生長(zhǎng)，種內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)加劇，某些富硒因子供給不足，從而引起乳酸菌BN1005生物量、富硒量和富硒率的下降。因此選擇葡萄糖添加量為35 g/L。由圖2B可知，當(dāng)復(fù)合有機(jī)氮源添加量為15 g/L時(shí)，乳酸菌BN1005富硒量和富硒率達(dá)到最大值。復(fù)合有機(jī)氮源對(duì)乳酸菌BN1005富硒影響結(jié)果相類似，但影響的機(jī)制或不相同。培養(yǎng)基中復(fù)合有機(jī)氮源較低時(shí)，營(yíng)養(yǎng)因子匱乏導(dǎo)致生長(zhǎng)受阻，從而影響其富硒能力；當(dāng)復(fù)合有機(jī)氮源濃度過高時(shí)，復(fù)合有機(jī)氮源中的蛋氨酸和半胱氨酸會(huì)與硒代氨基酸等競(jìng)爭(zhēng)而參與硒蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致有機(jī)硒的生物合成被降低[21]。因此選擇復(fù)合有機(jī)氮源添加量為15 g/L。由圖2C可知，當(dāng)檸檬酸三銨添加量為1.5 g/L時(shí)，乳酸菌BN1005的生物量、富硒量和富硒率為最大值，相對(duì)于低濃度的檸檬酸三銨，高濃度（≥2.5 g/L）的檸檬酸三銨對(duì)乳酸菌BN1005富硒能力的抑制作用更加顯著，可能是由于乳酸菌利用無機(jī)氮源的能力比較弱。因此選擇檸檬酸三銨添加量為1.5g/L。由圖2D可知，低濃度的亞硒酸鈉對(duì)乳酸菌BN1005生長(zhǎng)影響較小，無機(jī)硒是自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的[22]，細(xì)胞外亞硒酸鈉的濃度低，則擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)的速度緩慢，有機(jī)硒轉(zhuǎn)化的底物不足，有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率下降；高濃度的亞硒酸鈉存在細(xì)胞毒性和基因組損傷[23-24]，嚴(yán)重影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝。因此選擇亞硒酸鈉添加量為5 mg/L。由圖2E可知，一定濃度的CaCO3對(duì)乳酸菌BN1005的富硒量和富硒率有顯著的提高。徐穎等[14]通過調(diào)整培養(yǎng)基初始pH值到6.4時(shí)，培養(yǎng)48 h，鼠李糖乳桿菌富硒量和富硒率達(dá)到最大值，過低或過高的pH都不利于鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）的富硒，并認(rèn)為可能是硒蛋白轉(zhuǎn)化的酶系反應(yīng)對(duì)pH值有一定要求。乳酸菌產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，培養(yǎng)基中加入一定濃度CaCO3有助于穩(wěn)定pH值，以保證有機(jī)硒轉(zhuǎn)化反應(yīng)環(huán)境的穩(wěn)定。因此選擇CaCO3添加量為15g/L。由圖2F可知，當(dāng)NaCl添加量從1 g/L增加至3 g/L時(shí)，菌株生物量影響并不顯著，但對(duì)乳酸菌BN1005富硒量和富硒率的提高是極顯著的，富硒量和富硒率分別從529.82 μg/g、49.26%提高至604.88 μg/g、53.81%，說明低濃度的NaCl可以促進(jìn)乳酸菌BN1005有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化；但高濃度的NaCl會(huì)顯著降低細(xì)胞富硒能力。細(xì)胞內(nèi)外NaCl的高濃度差會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜組成（脂質(zhì)多糖和脂肪酸殘基）的改變，膜的滲透性發(fā)生變化，細(xì)胞內(nèi)水分外流，細(xì)胞體積減小[25]。因此選擇NaCl添加量為3 g/L。

圖2 培養(yǎng)基不同組成成分對(duì)乳酸菌BN1005富硒能力的影響Fig.2 Effect of different medium composition on the selenium enrichment ability of lactic acid bacterium BN1005

綜上所述，乳酸菌BN1005富硒培養(yǎng)基優(yōu)化后確定其培養(yǎng)基組成為葡萄糖35 g/L，復(fù)合有機(jī)氮源15 g/L，檸檬酸三銨1.5 g/L，亞硒酸鈉5 mg/L，CaCO315 g/L，NaCl 3 g/L。

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到其二次多項(xiàng)回歸模型為Y=607.52+4.81A+4.52B+4.22C-0.75AB-3AC-2.38BC-25.68A2-42.80B2-2.53C2。由表2可知，模型P=0.000 1＜0.01，失擬項(xiàng)P=0.222 4＞0.05，說明該模型回歸顯著。當(dāng)模型的判定系數(shù)R2值越接近于1時(shí)表明實(shí)際值和預(yù)測(cè)值之間的相關(guān)性更好[26]，本模型判定系數(shù)R2=0.986 5，模型擬合性較好。調(diào)整判定系數(shù)R2Adj=0.969 1，表明96.91%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型解釋。

表1 乳酸菌BN1005富硒發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Design and results of response surface methodology for medium formula optimization of selenium enrichment fermentation of lactic acid bacterium BN1005

表2 模型回歸方程方差分析Table 2 Variance analysis of regression equations

各因素交互作用對(duì)乳酸菌BN1005富硒量的影響見圖3。由圖3可知，隨著亞硒酸鈉添加量的增加乳酸菌BN1005富硒量是呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，且存在極高值點(diǎn)；隨著NaCl添加量的增加乳酸菌BN1005富硒量是呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，且存在極高值點(diǎn)；隨著葡萄糖添加量的增加乳酸菌BN1005富硒量變化趨勢(shì)較小，結(jié)合方差分析中P值大小，在本試驗(yàn)各因素水平范圍內(nèi)影響乳酸菌BN1005富硒量的主次因素A＞B＞C，即亞硒酸鈉＞NaCl＞葡萄糖。各曲面圖上升和下降的波度較緩，且等高線疏密度變化不明顯，一次項(xiàng)A、B、C對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），二次項(xiàng)A2、B2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AB、AC、BC和二次項(xiàng)C2對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05），與模型方差分析一致。

圖3 亞硒酸鈉、NaCl與葡萄糖添加量交互作用對(duì)富硒量影響的響應(yīng)曲面與等高線Fig.3 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between sodium selenite,NaCl and glucose addition on selenium enrichment content

通過Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)回歸方程求解得到模型最大值，即亞硒酸鈉5.0 mg/L，NaCl 3.0 g/L，葡萄糖39.0 g/L，此時(shí)菌體富硒量預(yù)測(cè)值為609.37 μg/g。在預(yù)測(cè)最佳培養(yǎng)基配方條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，做3個(gè)重復(fù)，所得的實(shí)際菌體富硒量為607.52 μg/g，與預(yù)測(cè)值接近，說明該模型合理可行的。

3 討論

乳酸菌是公認(rèn)的益生菌，廣泛用于食品、飲料和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品的發(fā)酵生產(chǎn)。乳酸菌可以將有毒的無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為對(duì)人與動(dòng)物安全的菌體有機(jī)硒。LV C H等[27]在日均溫度38 ℃環(huán)境下，以飼喂基礎(chǔ)日糧和無機(jī)硒為對(duì)照，給斷奶仔豬飼喂益生菌和富硒益生菌（嗜酸乳桿菌和釀酒酵母）第28天和第42天時(shí)仔豬糞便中乳酸菌數(shù)量較高，而大腸桿菌數(shù)量較低；飼喂42 d時(shí)富硒益生菌組的仔豬體質(zhì)量以及血液的硒濃度、谷胱甘肽過氧化酶濃度均顯著高于其他3組；富硒益生菌相對(duì)于單純的益生菌表現(xiàn)出了對(duì)斷奶仔豬更好的抗熱應(yīng)激和生長(zhǎng)促進(jìn)作用。YANG J等[28]通過小鼠實(shí)驗(yàn)、牛津杯法和共培養(yǎng)法證明了富硒益生菌（包括產(chǎn)朊假絲酵母、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和嗜熱鏈球菌）在體內(nèi)體外均可有效抑制大腸桿菌生長(zhǎng)，富硒益生菌可改善機(jī)體抗氧化狀態(tài)，增強(qiáng)免疫力，改善腸道內(nèi)部環(huán)境。IBRAHIMHAM等[29]通過給高血脂癥雄性小鼠飼喂添加益生菌、無機(jī)硒或富硒益生菌的飼料發(fā)現(xiàn)富硒益生菌（富硒產(chǎn)朊假絲酵母和富硒嗜熱鏈球菌）組比益生菌組和無機(jī)硒組更有效地降低小鼠血脂水平。

4 結(jié)論

該試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了乳酸菌BN1005振蕩發(fā)酵培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，乳酸菌BN1005的富硒最優(yōu)培養(yǎng)基組成為葡萄糖39.0 g/L，復(fù)合有機(jī)氮源15.0 g/L，檸檬酸三銨1.5 g/L，吐溫-80 1.08 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，K2HPO42.0 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，CaCO315.0 g/L，NaCl 3.0 g/L；培養(yǎng)條件為接種量10%，裝液量60 mL/250 mL，恒溫37 ℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，亞硒酸鈉5.0 mg/L，亞硒酸鈉添加時(shí)間為8 h。在此條件下，乳酸菌BN1005富硒率從7.22%提高至53.81%；富硒含量由305.9 μg/g提升至607.52 μg/g。說明乳酸菌BN1005具有較好的富硒能力，在富硒食品與富硒益生菌發(fā)酵飼料的開發(fā)中具有較好的應(yīng)用前景。