市售國產(chǎn)醬油中大豆、小麥過敏原分析

姜小燕，高美須*，王夢莉，支玉香

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100081；2.北京市協(xié)和醫(yī)院，北京 100193）

食物過敏是人們攝入某種食物后產(chǎn)生的一種不良反應(yīng)，其臨床癥狀主要有口腔過敏綜合癥、蕁麻疹、腸道疾病、哮喘及過敏性鼻炎，嚴重時可導致過敏性休克甚至死亡。近年來，食物過敏己成為全球性不可回避的食品安全問題之一[1]。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（food and agriculture organization of the united nations，F(xiàn)AO）認定，牛奶、花生、堅果、蛋類、大豆、小麥、魚蝦和水生貝殼類是常見的引起食物過敏反應(yīng)的八大類食物，在過敏反應(yīng)中，有90%以上是由這八類食物所引起[2-3]。我國的過敏問題也越來越受到重視，為此，正在修訂的GB7718《食品安全國家標準預包裝食品標簽通則》（征求意見稿）中要求將原標準鼓勵標注過敏食物改為強制標準，嚴格的過敏食品標簽管理將為過敏病人的生活提供方便。

醬油味道鮮美，口感醇厚，是中國餐桌上必不可少的調(diào)味料。釀造醬油是以大豆、小麥或麩皮為原料，經(jīng)微生物天然發(fā)酵而成的[4]，醬油的釀造方式主要有高鹽稀態(tài)和低鹽固態(tài)兩種方式，這兩種工藝在發(fā)酵溫度、鹽水濃度及發(fā)酵時間等方面存在區(qū)別。醬油在釀造過程中大分子蛋白被降解成小分子的氨基酸和多肽，并以氨基酸態(tài)氮的含量作為醬油的分級標準之一。作為醬油生產(chǎn)原料的大豆和小麥均被聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）認定為過敏食物，根據(jù)國際免疫學會聯(lián)合會過敏原命名分會官方網(wǎng)站，截至2012年9月24日已批準7類大豆過敏原，分別是Gly m 1（疏水蛋白）、Gly m 2（防御蛋白）、Gly m 3（細胞溶質(zhì)蛋白）、Gly m 4（病程相關(guān)蛋白）、Glym5（7S球蛋白）、Glym 6（11S球蛋白）、Glym 7（種子生物素化蛋白）。截至2015年2月12日已批準9類食源性小麥過敏原，分別是Tri a 12（抑制蛋白）、Tri a 14（非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白1）、Tri a 18（同工麥胚凝集素1）、Tri a 19（ω5-麥醇溶蛋白）、Tri a 20（γ-麥醇溶蛋白）、Tri a 25（硫氧還蛋白）、Tri a 26（高分子量麥谷蛋白）、Tri a 36（低分子質(zhì)量麥谷蛋白GluB3-23）、Tri a 37（α-嘌呤硫素）[5]。

在醬油的釀造過程中，原料大豆、小麥經(jīng)過蒸煮、制曲、長時間的發(fā)酵、加熱滅菌以及過濾處理，原料中蛋白質(zhì)的降解發(fā)生在整個醬油的制備過程中。雖然經(jīng)過發(fā)酵降解，但國內(nèi)外仍然有不少醬油過敏的報道，且過敏人群以嬰幼兒為主。目前關(guān)于醬油中過敏原的檢測報道較少。KOBAYASHI M等[6]報道在日本生產(chǎn)的10個商業(yè)醬油樣品中未檢測到小麥過敏原。KOBAYASHI M等[7]用病人血清未檢測到日本醬油中的小麥過敏原，在生醬油中檢測到大豆過敏原，但經(jīng)過熱處理和過濾過程的熟醬油中大豆過敏原已檢測不到。國內(nèi)目前邵碧英等[8]采用大豆和小麥過敏原檢測試劑盒對烤鰻醬油中過敏蛋白進行了檢測，絕大部分烤鰻醬油樣品中檢測不到大豆過敏原，檢測到的含量也很低；檢測到小麥過敏原含量很低或沒有。目前我國眾多種類和級別的醬油中過敏原情況尚不清楚，很有必要了解市售國產(chǎn)醬油的過敏原分布情況。

本研究選取了14種具有代表性的市售國產(chǎn)醬油產(chǎn)品進行其過敏原的定性定量分析，為我國的醬油過敏性分析研究提供科學數(shù)據(jù)，并為過敏病人選擇醬油提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

14種不同釀造工藝不同等級的國產(chǎn)醬油（編號為1～14，其中1～2為低鹽固態(tài)三級醬油；3～5（三級）、6～8（二級）、9～11（一級）、12～14（特級）為高鹽稀態(tài)醬油）：市售；乙醇、鹽酸、甲醇等（均為分析純）：北京瀚城生物有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）干粉2L（pH 7.2～7.4）裝、脫脂奶粉、含0.05%吐溫20的Tris-HCl緩沖鹽（Tris-HCl buffer saline with 0.05%Tween 20，TBST）洗滌液、Tris-HCl（Tris-HCl buffered saline，TBS）緩沖液（pH7.2～7.4）、蛋白Marker、30%凝膠儲液、Bradford蛋白測定試劑盒、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine，TMB）雙組分顯色液、酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）終止液、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒、酶標二抗辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、兔血清免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（效價1∶10 000）、HRP-人血清免疫球蛋白E（IgE）（效價1∶1 000）：北京索萊寶技術(shù)有限公司；96孔酶標板：美國Corning公司；抗大豆兔多克隆抗體：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全收貯運管控重點實驗室自制；抗小麥兔多克隆抗體：中國海洋大學食品安全實驗室李振興教授提供；大豆、小麥過敏病人血清：北京協(xié)和醫(yī)院提供的大豆或小麥過敏原檢測為陽性結(jié)果的血清。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16A高速冷凍離心機：長沙平凡儀器廠；WD-9405B型水平搖床、DYCN-24D型垂直電泳槽、DYCZ-40D轉(zhuǎn)印芯：北京六一儀器廠；I-mark 型酶標儀、1575型洗板機：美國BIO-RAD公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 Tris-tricine-十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳

按照LAEMMLI BUK等[9]的方法，采用不連續(xù)垂直凝膠電泳，凝膠厚度1 mm，選用質(zhì)量分數(shù)為16.5%分離膠，10%夾層膠，4%濃縮膠，將提取液稀釋至1 mg/mL，用2×Tricine緩沖液稀釋樣品，上樣量為10 μL，Marker上樣量為5 μL。設(shè)定電泳條件為60 V預電泳10 min，再將樣品加入點樣孔后60 V電泳30 min，150 V電泳至溴酚藍到達膠底部后停止電泳（約1.5 h），進行剝膠、考馬斯亮藍R250染色、脫色后拍照。

1.3.2 醬油中蛋白的免疫印跡分析

蛋白樣品進行Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳分離后，夾心法轉(zhuǎn)膜，恒流90 mA電轉(zhuǎn)移120 min，轉(zhuǎn)移完成后取出硝酸纖維素（nitrocellulose filter membrane，NC）膜。已轉(zhuǎn)印的NC膜用封閉液（含5%的脫脂奶粉的TBST溶液）于室溫條件下封閉2 h，取出后用TBST洗滌液洗滌5次，每次5～10 min。加入用封閉液1∶1 000稀釋的兔抗大豆蛋白多克隆抗體，室溫孵育1.5 h，用TBST洗滌5次，每次5～10 min。加入1∶5 000稀釋的HRP標記羊抗兔室溫孵育1.5 h后，用TBST洗膜5次，每次5～10 min，后用TBS洗滌兩次，每次5 min。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）避光顯色1 min，以蒸餾水洗滌3次，每次5 min以終止反應(yīng)。顯色之后，及時拍照。

用小麥兔多克隆抗體實驗時，抗體1∶800稀釋，其余步驟同上。

1.3.3 醬油中蛋白的免疫原性與過敏原性的測定

采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附（間接競爭ELISA）法測定醬油樣品中大豆、小麥蛋白的免疫原性，測定參照王夢莉[10]的方法。抗原性測定中，大豆、小麥蛋白抗原的包被質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL，2種抗原對應(yīng)的兔抗血清稀釋比例分別為1∶10 000和1∶8 000。在過敏原性的測定中，大豆蛋白、小麥蛋白抗原的包被質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL，2種抗原對應(yīng)的兔抗人血清稀釋比例分別為1∶2 000和1∶800。樣品的抗原性及過敏原性方面根據(jù)標準曲線計算得出的抗原等價質(zhì)量濃度（μg/mL）來表示。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

間接競爭ELISA分析每個處理重復3次，數(shù)據(jù)分析采用Excel 2016統(tǒng)計分析軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tricine-SDS-PAGE分析醬油中的大豆、小麥過敏原情況

由于醬油中的大分子蛋白經(jīng)過長時間發(fā)酵后被降解為分子質(zhì)量較小的蛋白，采用普通的SDS-PAGE難以將其分開，故本研究采用小分子蛋白電泳（Tricine-SDS-PAGE）[11]。結(jié)果表明，市售的14種國產(chǎn)醬油進行蛋白電泳分析，染色后，所有醬油樣品在凝膠上均沒有大豆、小麥蛋白條帶出現(xiàn)。分析原因可能是在醬油的整個釀造過程中，原料大豆、小麥經(jīng)過蒸煮、制曲、長時間的發(fā)酵、加熱滅菌以及過濾處理，原料中的蛋白質(zhì)逐步降解，原料中的大豆、小麥蛋白經(jīng)過這一系列的降解過程，殘留在醬油成品里的過敏原已經(jīng)極其微量，在電泳的檢測限以下，最終導致在凝膠電泳圖上沒有蛋白條帶出現(xiàn)。

2.2 免疫印跡分析國產(chǎn)市售醬油中的大豆、小麥過敏原情況

用大豆、小麥蛋白的兔血清、對大豆、小麥過敏的病人血清的免疫印跡結(jié)果分析國產(chǎn)市售醬油中的大豆、小麥過敏原情況，結(jié)果見圖1。由圖1可知，只有大豆過敏蛋白兔血清分析14種市售國產(chǎn)醬油免疫印跡結(jié)果出現(xiàn)過敏蛋白條帶，其他3種血清的免疫印跡結(jié)果均無過敏蛋白條帶出現(xiàn)。

圖1 國產(chǎn)市售醬油樣品大豆兔血清免疫印跡分析結(jié)果Fig.1 Western blotting analysis results of bean rabbit serum of domestic commercial soy sauce samples

大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白是大豆蛋白中兩種最主要的過敏蛋白，分別占大豆總球蛋白的40%和30%，能引起較嚴重的過敏癥狀。其中，β-伴大豆球蛋白是由3種亞基組成，包括α'亞基（～71 kDa）、α亞基（～67 kDa）和β亞基（～50 kDa）；大豆球蛋白是一種六聚體，由5五種亞基組成：G1、G2、G3、G4和G5，每個亞基由堿性A多肽鏈（35 kDa）和酸性B多肽鏈（20 kDa）通過二硫鍵進行連接[12-13]。雖然電泳圖沒有呈現(xiàn)條帶，但用大豆兔血清對14種市面上在售的醬油成品進行靈敏度更高的免疫印跡分析時，發(fā)現(xiàn)醬油中殘留的大豆過敏原是分子質(zhì)量為50 kDa的β-伴大豆球蛋白的β亞基，和分子質(zhì)量約20 kDa的大豆球蛋白的堿性亞基中的一種或兩種。其中，兩種亞基都含有的是低鹽固態(tài)三級醬油（1號和2號泳道）；沒有過敏蛋白亞基條帶是部分高鹽稀態(tài)三級醬油以及部分高鹽稀態(tài)特級醬油（3號、6號和13號泳道）；其余幾種醬油只有大豆球蛋白的堿性亞基的免疫印跡條帶。

2.3 間接競爭ELISA測定市售國產(chǎn)市售醬油中的大豆過敏原含量

醬油經(jīng)過長時間的發(fā)酵，其中的大豆過敏蛋白被降解成小分子的肽段和氨基酸，導致抗原表位被破壞而使其免疫原性和過敏原性變得較低。一般來說用大豆全蛋白制備的兔血清的結(jié)果表明樣品中的蛋白免疫原性，病人血清的結(jié)果表明樣品中蛋白的過敏原性。間接競爭ELISA方法檢測14種國產(chǎn)醬油中大豆過敏原的濃度結(jié)果見表1。由表1可知，在兔血清檢測免疫原性方面，低鹽固態(tài)的兩種醬油中大豆過敏原含量均遠大于1 μg/mL，高鹽稀態(tài)醬油中僅有部分（三級、二級以及一級各1例）醬油（5號、8號和11號泳道）中大豆過敏原含量略大于1 μg/mL，其余醬油樣品中大豆過敏原含量均小于1 μg/mL。高鹽稀態(tài)醬油中大豆過敏原的含量總體上較低鹽固態(tài)醬油低，且高鹽稀態(tài)醬油中等級較高的醬油整體上也比等級較低的醬油所含的大豆過敏原少。

表1 市售國產(chǎn)醬油樣品中大豆過敏原含量ELISA測定結(jié)果Table 1 Determination results of soybeans allergens in domestic commercial soy sauce samples by ELISA

正常人的血清中Ig E含量極低，而在過敏患者體內(nèi)特異性Ig E的含量會很高。因此Ig E檢測成為目前公認的檢測Ⅰ型速發(fā)型超敏反應(yīng)的最有效的方法之一[14]。試驗通過大豆過敏患者血清制備血清池，測定醬油樣品與大豆過敏患者血清Ig E的特異性結(jié)合情況。由表1可知，在人血清測定的過敏原性方面，1號、6號、10號3種醬油大豆過敏原含量略高，均大于1 μg/mL，其余醬油產(chǎn)品中可檢測到大豆過敏原的含量極低甚至檢測不到。根據(jù)過敏原性測得的大豆過敏原含量與釀造方式和等級沒有太大的關(guān)系。

2.4 間接競爭ELISA測定市售國產(chǎn)市售醬油中的小麥過敏原含量

間接競爭ELISA方法檢測14種國產(chǎn)醬油中小麥過敏原的濃度結(jié)果見表2。由表2可知，在兔血清測定的抗原性方面，不同釀造方式以及不同等級的醬油之間，檢測到的小麥過敏原的含量都很低，均遠遠小于20 mg/kg。在人血清測定的過敏原性方面，所有醬油產(chǎn)品都未檢測到小麥過敏原。國際食品法典委員會（Codex Alimentarius Commission，CAC）對無麩質(zhì)食品規(guī)定其麩質(zhì)含量不能超過20 mg/kg。醬油中小麥過敏原的含量遠遠小于20 mg/kg的標準，因此醬油可以視為無麩質(zhì)食品。

表2 市售國產(chǎn)醬油樣品中小麥過敏原含量ELISA測定Table 2 Contents of wheat allergens in domestic commercial soy sauce samples analysis by ELISA

3 討論

凝膠電泳、免疫印跡以及酶聯(lián)免疫是過敏原試驗中三個常用方法。凝膠電泳法在過敏原檢測方面應(yīng)用較廣泛，常被用來定性或定量檢測過敏原蛋白，電泳法簡單快速，對蛋白影響小，但靈敏度相對較低[15]。醬油原料中的大豆、小麥中的蛋白經(jīng)過層層降解，含量已經(jīng)極少，導致電泳無法檢測出。免疫印跡是一種將高分辨率的凝膠電泳與免疫化學分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)，經(jīng)過PAGE分離后的蛋白，轉(zhuǎn)移并以非共價鍵的形式吸附到固相載體上，該法能保持電泳分離后得到的多肽其生物學活性不變，是現(xiàn)今過敏原鑒定的主要方法之一[16]。而且免疫印跡靈敏性要高于凝膠電泳，因此免疫印跡結(jié)果圖上有免疫印跡條帶出現(xiàn)。ELISA是一種用酶標抗體進行抗原-抗體反應(yīng)，以酶作用底物后的顯色深淺來反應(yīng)待測樣品中抗原或抗體的含量，是目前食物過敏原檢測范圍最廣的檢測方法，具有特異性高、靈敏性強、快速方便、費用低等優(yōu)點，可以實現(xiàn)較精確的定量檢測[17]。原料大豆、小麥中的蛋白雖然降解得較為徹底，但食物過敏反應(yīng)并不是由蛋白本身引起的，而是蛋白上的某段抗原表位在起作用，表位通常由5～15個氨基酸殘基組成，雖然電泳已經(jīng)無法檢測出，但表位存在依然可以發(fā)生免疫反應(yīng)[18]，因此用ELISA來半定量樣品中的過敏原含量。但由于樣本、試劑以及操作等因素造成蛋白成分的破壞，會導致出現(xiàn)假陽性結(jié)果[19]。所以即使是同一釀造方式、同一等級的醬油可能存在個別樣品在定量結(jié)果上有所差別。

14種市售國產(chǎn)醬油中殘留的大豆過敏原是β-伴大豆球蛋白的β亞基和大豆球蛋白的堿性亞基中的一種或兩種。這兩種亞基屬于大豆過敏原中較難降解的過敏原亞基，王錦欣等[20]用胃蛋白酶和黑曲霉酸性蛋白酶處理β-伴大豆球蛋白，ELISA結(jié)果表明約有89.5%的β-伴大豆球蛋白被去除，處理后的β-亞基仍比較完整。LEE U W等[21]用胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶研究發(fā)現(xiàn)，大豆11S球蛋白中的堿性亞基比酸性亞基較難水解。高鹽稀態(tài)醬油和低鹽固態(tài)醬油免疫條帶的結(jié)果存在差異，可能與釀造工藝以及所含的酶系不同有關(guān)。高鹽醬油發(fā)酵時間長，以耐鹽的酶為主，低鹽醬油發(fā)酵溫度高，生產(chǎn)周期短，以耐高溫的酶為主[22-23]。氨基酸含量作為醬油等級劃分的標準之一，其含量越高，醬油的等級越高。氨基酸態(tài)氮含量高也從表明原料中大分子的蛋白被酶解小分子的成氨基酸的程度高，這和本研究結(jié)果一致，等級越高的醬油過敏原含量相對越低。

小麥過敏原含量極低甚至檢測不到，這一點與KOBAYASHI M等[24]研究的結(jié)果相一致，通過免疫印跡，抑制ELISA和直接ELISA，在日本生產(chǎn)的十個商業(yè)醬油樣品中未檢測到小麥過敏原。而且小麥在醬油原料中比大豆用量少，醬油原料用的是小麥面粉相較大豆豆粕更易反應(yīng)降解，最終導致小麥過敏原檢測不到。

4 結(jié)論

在14種市售國產(chǎn)醬油樣品中，大豆過敏原含量與醬油釀造工藝與醬油等級有關(guān)，低鹽固態(tài)醬油中檢測到的大豆過敏原含量高于高鹽稀態(tài)醬油，醬油的等級越高，所含過敏原含量相對越低。檢測到大豆過敏原，為β-伴大豆球蛋白的β亞基和大豆球蛋白的堿性亞基中的一種或兩種。小麥過敏原含量極低或檢測不到，符合無麩質(zhì)食品的標準。建議對醬油中殘留的大豆過敏原采取進一步酶解、加熱或過濾等方法生產(chǎn)完全脫敏的醬油。