冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液醇提物對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7免疫調(diào)節(jié)的影響

范冬月，李 倩，鄒先偉，張君毅*

（1.華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021；2.清華大學(xué)工程物理系，北京 100084）

冠突散囊菌（Eurotiunm cristatum）屬于發(fā)菌科散囊菌屬，長(zhǎng)期以來(lái)一直被認(rèn)定為評(píng)價(jià)茯磚茶品質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。與其他種類的茶相比，以冠突散囊菌為主要微生物的茯磚茶具有更多獨(dú)特的風(fēng)味和功效[1-2]。除茯磚茶外，冠突散囊菌廣泛存在于康磚茶、綠茶、六寶茶、蟲(chóng)草、土壤和木片[3-4]。

冠突散囊菌多糖和次生代謝產(chǎn)物具有良好的免疫增強(qiáng)活性、抗氧化活性和抗腫瘤活性[5]。由于具有易于培養(yǎng)和快速繁殖的特性，冠突散囊菌已成為重要的益生菌。近年來(lái)，冠突散囊菌的潛在藥用和抗菌特性已成為研究熱點(diǎn)。為了進(jìn)一步開(kāi)發(fā)冠突散囊菌的生物活性，冠突散囊菌與其他菌種共同發(fā)酵產(chǎn)物的研究也得到進(jìn)一步研究。研究表明，混合發(fā)酵體系可以產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，增加產(chǎn)物香氣，而這些代謝產(chǎn)物很難通過(guò)單一真菌發(fā)酵獲得[6-7]。冠突散囊菌與黑曲霉（Aspergillus niger）共同發(fā)酵可顯著改善綠茶的品質(zhì)[8]，與金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）共同發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物可顯著抑制肝癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[9]。

因此，本研究將冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵，通過(guò)不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)混合發(fā)酵液化學(xué)活性部位進(jìn)行追蹤，并結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)活性部位化合物組成進(jìn)行分析，通過(guò)四氮甲基唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法、中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法分別研究冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液活性部位對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖、吞噬以及分泌細(xì)胞因子的能力的影響，評(píng)價(jià)其是否具有良好的免疫調(diào)節(jié)功能。為進(jìn)一步挖掘冠突散囊菌的生物活性，制備安全價(jià)格低廉的免疫調(diào)節(jié)劑提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與試劑

冠突散囊菌（Eurotiunm cristatum）、木霉菌株（Tricho dermasp.）：清華大學(xué)工程物理系粒子技術(shù)與輻射成像教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株：國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)；胎牛血清：以色列BI公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、MTT、脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）（源自大腸桿菌）、蘆丁、沒(méi)食子酸、福林酚、碳酸鈉、無(wú)水葡萄糖、硫酸、苯酚：美國(guó)Sigma公司；二辛可寧酸（bicinchonininc acid，BCA）試劑盒、一氧化氮（NO）檢測(cè)試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素6酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒（mouse interleukin-6 enzyme-linked immunosorbent assaykit，Mouse IL-6 ELISA Kit）、小鼠腫瘤壞死因子-α酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒（mouse tumor necrosis factor-α enzyme-linked immunosorbent assay kit，Mouse TNF-α ELISA Kit）。所用試劑均為分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）：以色列BI公司。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基[10]：葡萄糖50 g/L、蛋白胨2.5 g/L、KH2PO43 g/L、MgSO4·7H2O 0.15 g/L、FeSO4·7H2O 0.25 g/L、維生素B 0.11 g/L，調(diào)節(jié)液體發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值至6.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀、HERAcell細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo公司；Venticell強(qiáng)對(duì)流精密烘箱：德國(guó)MMM公司；HZQ-F100恒溫振蕩培養(yǎng)箱：北京天林恒泰科技有限公司；UV-1780紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；TH4-200型倒置顯微鏡：美國(guó)OLYMPUS公司；SVE-4A1垂直流超凈工作臺(tái)：新加坡ESCO公司；Ultimate 3000/Q-Exactive超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（ultra-high performance liquid chromatographymass spectrum，UHPLC-MS）儀：美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 冠突散囊菌與木霉分別發(fā)酵和深層混合發(fā)酵

將冠突散囊菌、木霉和混合菌株分別以1×106個(gè)/mL接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL，于28 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵8 d（D8）、10 d（D10）、12 d（D12）及14 d（D14）時(shí)收集樣品，取1 mL發(fā)酵液置于2 mL離心管中，置于55 ℃恒溫強(qiáng)對(duì)流精密烘箱至干燥，備用。

1.3.2 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液與單菌發(fā)酵液免疫活性比較

將冠突散囊菌與木霉的混合發(fā)酵液及單菌發(fā)酵液分別用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋至2 mg/mL，采用MTT法[11]檢測(cè)不同樣品對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖率的影響。將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7以1×106個(gè)/mL的密度接種于96孔板中，每孔接種200 μL，在37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。調(diào)零組不接種細(xì)胞，陰性對(duì)照組每孔加PBS溶液20 μL，陽(yáng)性對(duì)照組每孔加2.5 μg/mL LPS，實(shí)驗(yàn)組每孔給藥質(zhì)量濃度為200 μg/mL。培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT溶液，置于37 ℃，4 h后棄上清液，并加入100 μL DMSO溶液，振蕩5 min后，置于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增值率，其計(jì)算公式如下：

式中：A是實(shí)驗(yàn)組或陽(yáng)性對(duì)照組吸光度值；B是陰性對(duì)照組吸光度值；C是調(diào)0組吸光度值。

1.3.3 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液免疫活性物質(zhì)的分離

稱取10 g冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液干燥后的粉末以1∶10（g∶mL）的料液比加入水，充分溶解后分別加入體積分?jǐn)?shù)分別為70%和90%的乙醇，充分振蕩30 min，分別收集乙醇層樣品和不溶于乙醇的沉淀，蒸發(fā)干燥。其中由體積分?jǐn)?shù)70%乙醇沉淀的樣品標(biāo)記為ETW1，體積分?jǐn)?shù)90%乙醇沉淀的樣品標(biāo)記為ETW2，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇提取的樣品標(biāo)記為ETE1，體積分?jǐn)?shù)90%乙醇提取的樣品標(biāo)記為ETE2。分別取樣品ETW1、ETW2、ETE1、ETE2 2 mg加PBS溶液配置成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液。采用MTT法檢測(cè)不同樣品對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖率的影響，對(duì)樣品的免疫活性進(jìn)行篩選。

1.3.4 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液醇提物化學(xué)成分分析

總糖含量：采用硫酸-苯酚法檢測(cè)[12]；總蛋白含量：采用二辛可寧酸（bicinchonininc acid，BCA）試劑盒檢測(cè)；總多酚含量：采用福林酚比色法檢測(cè)[13]；總黃酮含量：采用分光光度法檢測(cè)[14]；活性成分采用UHPLC-MS分析[15]。

1.3.5 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液醇提物內(nèi)毒素的檢測(cè)

為避免熱原對(duì)結(jié)果的影響，通過(guò)內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒對(duì)冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液醇提物及LPS中的熱原進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.6 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液醇提物對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖能力的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則圓形的RAW264.7細(xì)胞，以1×106個(gè)/mL的細(xì)胞密度，每孔200 μL接種于96孔板上，在37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入20 mL PBS溶液（陰性對(duì)照組），100 μg/mL、300 μg/mL、500 μg/mL的冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液醇提物，2.5 μg/mL LPS（陽(yáng)性對(duì)照組），每組設(shè)6個(gè)重復(fù)。24 h后棄上清液，采用MTT法測(cè)定冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液醇提物對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖能力的影響。

1.3.7 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液醇提物對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬中性紅的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則圓形的RAW264.7細(xì)胞，用吸管將細(xì)胞輕輕吹落，以5×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度，每孔100 μL接種于96孔板上，在37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入20 mL PBS溶液，100 μg/mL、300 μg/mL、500 μg/mL的冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液醇提物，2.5 μg/mL LPS，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)。24 h后棄上清液，向每孔中加入100 μL 0.1%的中性紅溶液，培養(yǎng)1 h后，棄中性紅溶液，PBS緩沖液沖洗3次后，向每孔加入100 μL由無(wú)水乙醇和冰醋酸體積比為1∶1配制的細(xì)胞裂解液靜置1.5 h，在波長(zhǎng)540 nm處用酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品吸光度值[16]。

1.3.8 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液醇提物對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌NO、IL-6、TNF-α的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則圓形的RAW264.7細(xì)胞，以5×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板，每孔接種100 μL，在37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入20 μL PBS溶液，100 μg/mL、300 μg/mL、500 μg/mL的冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液醇提物，2.5 μg/mL LPS，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)。24 h后取不同體積的細(xì)胞上清液，采用Griess試劑盒[17]和ELISA試劑盒[18]根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，顯著水平差異表現(xiàn)為P＜0.05，極顯著水平差異為P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液與單菌發(fā)酵液免疫活性

發(fā)酵8 d時(shí)，冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液與單菌發(fā)酵液對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖能力的影響見(jiàn)表1。

由表1可知，與陰性對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞的增殖有極顯著的促進(jìn)作用，增殖率達(dá)30.60%；發(fā)酵8 d時(shí)，木霉發(fā)酵液對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞的增殖具有微弱的促進(jìn)作用，增殖率達(dá)到5.74%；冠突散囊菌發(fā)酵液對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞也有一定促進(jìn)作用，增殖率達(dá)到17.31%；但兩菌混合發(fā)酵后其混合發(fā)酵液對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞增殖效果最好，增殖率達(dá)59.51%。

表1 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液及單菌發(fā)酵液對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖能力的影響Table 1 Effect of Eurotiunm cristatum and Trichoderma sp.co-fermentation liquid and single strain fermentation liquid on the proliferation rate of mouse macrophages RAW264.7

研究不同發(fā)酵時(shí)間冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖能力的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同發(fā)酵時(shí)間冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖能力的影響Table 2 Effect of Eurotiunm cristatum and Trichoderma co-fermentation liquid with different fermentation time on the proliferation rate of mouse macrophages RAW264.7

由表2可知，與陰性對(duì)照組相比，冠突散囊菌與木霉的混合發(fā)酵液對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖有促進(jìn)作用，且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖率呈下降趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵第8天時(shí)，小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖率最高，為59.51%，說(shuō)明冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液對(duì)巨噬細(xì)胞有激活作用，且發(fā)酵第8天時(shí)，激活作用最好。

2.2 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液免疫活性物質(zhì)的分離與分析

對(duì)冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵的產(chǎn)物進(jìn)行免疫活性追蹤研究，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖率為30.60%，冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液各分離組分中，小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖率均顯著高于陰性對(duì)照組，其中ETE1組，小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖率最高，達(dá)到47.39%，說(shuō)明各分離組分對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7有很好的激活作用，其中體積分?jǐn)?shù)70%乙醇提取物激活細(xì)胞作用最好，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究。

表3 冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液不同體積分?jǐn)?shù)乙醇分離成分對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖率的影響Table 3 Effect of different volume fraction ethanol isolation components of Eurotiunm cristatum and Trichoderma co-fermentation liquid on proliferation rate of mouse macrophages RAW264.7

分別利用硫酸-苯酚法、BCA法、福林酚法、分光光度法對(duì)ETE1分離組分中的總糖、總蛋白、總多酚、總黃酮含量進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 ETE1分離組分中化學(xué)成分的分析Table 4 Analysis of chemical compositions in isolation component ETE1

由表4可知，在ETE1分離組分中，總蛋白（0.04 mg/g）和總多酚（31.41 μg/g）含量較高，總黃酮（0.08 μg/g）和總糖（0.13 mg/g）含量較低，黃酮類化合物屬于多酚類化合物[19]。由于真菌混合發(fā)酵液成分復(fù)雜，UHPLC-MS聯(lián)用技術(shù)能夠在缺少標(biāo)準(zhǔn)品的條件下，對(duì)單組分進(jìn)行定性分析。因此，采用該技術(shù)對(duì)真菌混合發(fā)酵液進(jìn)行進(jìn)一步分析，UHPLC-MS總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 ETE1分離組分超高液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ions chromatogram of isolation component ETE1 analyzed by UHPLC-MS

由圖1可知，通過(guò)UHPLC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)出了保留時(shí)間為1.523min、16.615 min、17.061min、18.547 min、18.904 min、21.733 min、22.06 min、36.194 min、49.649 min的強(qiáng)峰。根據(jù)Compound Discover 3.1.0.305和mzcloud和mzVault數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果分析得到相關(guān)化合物信息，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，從ETE1分離組分中檢測(cè)出了5-羥甲基糠醛、生物素、麥芽酚、3-羥基苯甲酸、2,6-二甲基-γ-吡喃酮、二芐胺、芥子堿、大黃素、十三嗎啉。其中大黃素是常見(jiàn)的中藥活性成分，具有廣泛的藥理作用如抗炎，抗腫瘤，抗細(xì)菌等[20]。芥子堿為常見(jiàn)的天然抗氧化劑，具有抗炎的作用，常見(jiàn)于十字花科藥用植物[21]。

表5 ETE1分離組分UHPLC-MS分析結(jié)果Table 5 Analysis results of isolation component ETE1 by UHPLC-MS

2.3 ETE1分離組分中內(nèi)毒素的檢測(cè)

細(xì)菌內(nèi)毒素存在于革蘭氏陰性菌的外壁，主要成分為脂多糖，是菌體中存在的毒性物質(zhì)，具有致熱性也稱為“熱原”，內(nèi)毒素能夠?qū)е戮奘杉?xì)胞的激活[22]，如果樣品中含有熱原，會(huì)在一定程度上影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為了避免熱原對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，本研究利用顯色鱟試劑盒對(duì)ETE1分離組分中的內(nèi)毒素含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，質(zhì)量濃度為0.01 μg/mL的LPS中內(nèi)毒素含量為（1.36±0.35）EU/mL，是質(zhì)量濃度為1000μg/mL的ETE1分離組分[（0.39±0.01）EU/mL]的3倍，由此可知，ETE1分離組分對(duì)于巨噬細(xì)胞的增殖作用不是因?yàn)闊嵩鸬?，?duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7有良好的激活作用。

表6 ETE1分離組分中內(nèi)毒素含量檢測(cè)結(jié)果Table 6 Determination results of endotoxin content in isolation component ETE1

2.4 ETE1分離組分對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖的影響

有關(guān)巨噬細(xì)胞防御的研究對(duì)于先天免疫和適應(yīng)性免疫很重要。巨噬細(xì)胞分布在人體的各個(gè)器官和組織上，在人體不同的微環(huán)境中顯示出明顯的功能差異[23]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT 法研究不同質(zhì)量濃度ETE1 對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖作用，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、不同質(zhì)量濃度的ETE1分離組分對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖均具有極顯著的促進(jìn)作用（P＜0.01），且隨著ETE1質(zhì)量濃度的升高，促進(jìn)作用越好。

圖2 不同質(zhì)量濃度的ETE1對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖能力的影響Fig.2 Effect of different mass concentrations of ETE1 on the proliferation rate of mouse macrophages RAW264.7

2.5 ETE1分離組分對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬能力的影響

巨噬細(xì)胞對(duì)異物的吞噬能力，也一定程度上反應(yīng)了巨噬細(xì)胞的活力[24]。巨噬細(xì)胞在外界異物刺激后進(jìn)入活化狀態(tài)，激活的巨噬細(xì)胞胞飲作用速度也進(jìn)一步增加[25]。中性紅是一種堿性染色劑，能夠被巨噬細(xì)胞攝入，通過(guò)測(cè)量吞噬中性紅后裂解的巨噬細(xì)胞的吸光度值，對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬能力進(jìn)行評(píng)價(jià)[26]。不同質(zhì)量濃度的ETE1對(duì)吞噬中性紅后巨噬細(xì)胞RAW264.7形態(tài)的影響見(jiàn)圖3，對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬中性紅能力的影響見(jiàn)圖4。

由圖3可知，隨著ETE1質(zhì)量濃度的升高，小鼠RAW264.8細(xì)胞的分化程度逐漸加強(qiáng)，形變程度增加。由圖4可知，與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及不同質(zhì)量濃度的ETE1（除500 μg/mL）均可顯著促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬中性紅能力（P＜0.05）。且除質(zhì)量濃度500 μg/mL，隨著ETE1質(zhì)量濃度的升高，促進(jìn)作用越好。

圖3 不同質(zhì)量濃度的ETE1對(duì)吞噬中性紅后小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7形態(tài)的影響Fig.3 Effect of different concentrations of ETE1 on the morphology of mouse macrophages RAW264.7 after phagocytosis of neutral red

圖4 不同質(zhì)量濃度的ETE1對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬中性紅能力的影響Fig.4 Effect of different concentrations of ETE1 on the phagocytosis of neutral red in mouse macrophages RAW264.7

2.6 ETE1分離組分對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌NO、TNF-α及IL-6能力的影響

活化的巨噬細(xì)胞能夠通過(guò)釋放一氧化氮（NO）對(duì)病原體進(jìn)行抑制，有一定的殺菌作用[27]。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）TNF-α屬于單核因子主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)癌變的細(xì)胞和被病毒感染的細(xì)胞由細(xì)胞毒作用，能夠正向調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞的吞噬作用，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的胞飲能力，能夠增強(qiáng)淋巴細(xì)胞對(duì)外界病原微生物的響應(yīng)[28]。白介素（interleukin，IL）IL-6）是由多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生，介導(dǎo)白細(xì)胞發(fā)揮作用，促進(jìn)B細(xì)胞分化的一類細(xì)胞因子[29]。不同質(zhì)量濃度的ETE1對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞分泌NO、TNF-α及IL-6的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及不同質(zhì)量濃度的ETE1能顯著促進(jìn)小鼠細(xì)胞分泌NO、TNF-α及IL-6的能力（P＜0.01），且隨著ETE1質(zhì)量濃度的升高，NO、TNF-α及IL-6的分泌量越來(lái)越高，但均低于陽(yáng)性對(duì)照組。SCHEPETKIN I A等[30]研究發(fā)現(xiàn)，具有多重藥理活性的杜松能夠促進(jìn)TNF-α、IL-6的分泌，由此推測(cè)ETE1也可能具有一定的藥理活性。

圖5 不同質(zhì)量濃度的ETE1對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌NO（A）、TNF-α（B）及IL-6（C）能力的影響Fig.5 Effect of different concentrations of ETE1 on NO（A），TNF-α（B）and IL-6（C）secretion ability of mouse macrophages RAW 264.7

3 結(jié)論

將冠突散囊菌與木霉共同發(fā)酵，采用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇提取的部位有較好的免疫活性，通過(guò)UHPLC-MS聯(lián)用技術(shù)分析，該部位含有大黃素、芥子堿等生物活性成分。通過(guò)四氮甲基唑藍(lán)（MTT）比色法、中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法分別研究冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液活性部位對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖、吞噬以及分泌細(xì)胞因子的能力的影響。結(jié)果表明，與陽(yáng)性對(duì)照組脂多糖相比，500 μg/mL冠突散囊菌與木霉混合發(fā)酵液的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇提物能夠使小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖率提高12%，增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬中性紅的能力，并能促進(jìn)NO及細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的分泌。