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    甘薯塊根淀粉酶特性及糖化效應(yīng)研究

    2021-06-04 01:43:26沈升法吳列洪羅志高
    中國(guó)糧油學(xué)報(bào) 2021年5期
    關(guān)鍵詞:塊根甘薯淀粉酶

    項(xiàng) 超 沈升法 吳列洪 李 兵 羅志高

    (浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所,杭州 310021)

    甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]是中國(guó)重要的糧食作物[1]。近年來,隨著人們生活水平的提高和對(duì)消費(fèi)需求的不斷改變,鮮食的消費(fèi)比例持續(xù)增加,甘薯加工產(chǎn)品呈現(xiàn)多樣化、營(yíng)養(yǎng)化、細(xì)分化以及休閑食品銷量逐步上升等趨勢(shì),對(duì)優(yōu)質(zhì)鮮食甘薯和加工專用品種的需求日益增長(zhǎng)[2]。甘薯塊根富含淀粉和淀粉酶,α-淀粉酶和β-淀粉酶是促進(jìn)淀粉分解的主要酶[3,4]。其中,α-淀粉酶將淀粉分子的α-1,4糖苷鍵任意切斷成長(zhǎng)短不一的短鏈糊精及少量的麥芽糖和葡萄糖,β-淀粉酶可以從淀粉的非還原性末端降解α-1,4糖苷鍵,生成麥芽糖[4]。淀粉酶的活性是決定淀粉糖化程度主要因素,也是甘薯品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[5]。

    甘薯品種的糖化特性存在基因型差異,具體表現(xiàn)在淀粉率、可溶性糖含量、還原糖含量和淀粉酶活性等指標(biāo)的差異[3-9]。史春余等[4]研究表明食用型品種塊根膨大后期,由于淀粉酶的作用導(dǎo)致薯塊總淀粉含量較低、可溶性總糖含量較高。陳顯讓等[6]研究發(fā)現(xiàn)在塊根膨大后期,β-淀粉酶和總淀粉含量多數(shù)呈顯著的負(fù)相關(guān),可以為選擇提取β-淀粉酶的優(yōu)質(zhì)甘薯來源提供參考。陸國(guó)權(quán)等[7]研究表明不同干率類型的甘薯品種間淀粉酶活性存在差異,高干型、低干型與中干型品種淀粉酶活性存在極顯著差異。謝逸萍等[8]報(bào)道了不同基因型品種淀粉率在整個(gè)貯藏期均有所下降, 不同淀粉含量品種的淀粉酶活性存在明顯差異。不同品種間塊根淀粉酶活性的差異可能預(yù)示著其塊根中淀粉水解所需的最低淀粉酶活性是不同的,這與淀粉糊化和相關(guān)淀粉酶活性保持條件有關(guān)[4, 10-14]。Mensah等[12]研究發(fā)現(xiàn)β-淀粉酶活性受溫度、基因型、加熱時(shí)間以及基因型與溫度交互作用影響,升溫和延長(zhǎng)加熱時(shí)間通常會(huì)降低β-淀粉酶的活性并導(dǎo)致糖分的變化。

    隨著鮮食甘薯消費(fèi)需求和加工原料需求的變化,提前在夏季或高溫季節(jié)陸續(xù)進(jìn)行甘薯收獲,但一般此時(shí)鮮薯糖分結(jié)累少、甜度低,其淀粉酶活性可能還不足以促進(jìn)淀粉的迅速水解[4]。關(guān)于夏季或高溫季節(jié)收獲的甘薯淀粉酶糖化特性及不同類型內(nèi)源淀粉酶活性保持條件的研究鮮有報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定甘薯在蒸煮熟化前后其塊根中可溶性糖、還原糖含量以及不同類型淀粉酶活性變化,開展淀粉酶對(duì)甘薯淀粉的酶解特性研究,并進(jìn)行生淀粉體外糖化的分析,不僅為系統(tǒng)了解加工過程中甘薯淀粉酶特性及糖化效應(yīng),而且為篩選鮮食或加工專用品種,有效開發(fā)甘薯資源,提高其加工產(chǎn)品質(zhì)量、功能及其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    供試甘薯材料為浙薯13、浙薯75和浙薯33;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 mg/mL)、硫酸銅、亞甲藍(lán)、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、鹽酸,均為分析純;超純水;α-淀粉酶測(cè)定的K-CERA試劑盒、β-淀粉酶測(cè)定的K-BETA3試劑盒。

    1.2 儀器與設(shè)備

    C21-SK2108多功能電磁爐(蒸煮模式,1 100 W),DKS-24恒溫水浴鍋,DS-1高速組織搗碎機(jī),Eppendorf Centrifuge 5810R離心機(jī),752紫外可見分光光度計(jì)。

    1.3 方法

    1.3.1 薯塊樣品處理

    薯塊于8月15日(夏季)收獲,生育期109 d。選取3個(gè)中等大小(250 g左右)的新鮮薯塊,每個(gè)薯塊為一個(gè)重復(fù),橫向中間對(duì)切,其中半個(gè)薯塊用電磁爐隔水蒸煮1 h,鮮薯蒸熟后冷卻至室溫,切除切面1 cm左右薯肉,從整個(gè)橫切面均勻刮取1.0 g薯泥樣品,用于熟薯糖分的測(cè)定;另外半個(gè)薯塊從橫切面均勻刮取兩份1.0 g薯泥樣品,分別用于淀粉酶及生薯糖分的測(cè)定。

    1.3.2 還原糖和可溶性糖含量的測(cè)定

    參照GB/T 5009.7—2016直接滴定,對(duì)生薯和熟薯樣品進(jìn)行還原糖和可溶性糖含量測(cè)定。取已備好的生薯和熟薯樣品各1.0 g,分別加水9 mL,置于60 ℃恒溫水浴中保溫2 h,冷卻后以1 789 g速度離心10 min,各吸取上清液6 mL,每份上清液平均分成兩份,一份用于還原糖含量測(cè)定,另一份加入6 mol/L鹽酸在68 ℃水解后用于可溶性糖含量測(cè)定。

    1.3.3 淀粉酶活性的測(cè)定

    采用K-CERA和K-BETA3試劑盒分別測(cè)定α-淀粉酶[14,15]和β-淀粉酶活性[14,16]。取1.0 g鮮薯樣品,加入1 mL提取緩沖劑進(jìn)行研磨,再加入4 mL提取緩沖劑分三次對(duì)研磨的鮮薯樣品進(jìn)行沖洗并轉(zhuǎn)移到15 mL塑料離心管中,以447 g速度離心10 min,吸取上清液0.2 mL,然后加入0.2 mL α-淀粉酶測(cè)定反應(yīng)底物,置于40 ℃恒溫水浴中保溫10 min,加3 mL終止液,在400 nm處測(cè)定吸光度值。取0.2 mL上清液,加入3 mL稀釋緩沖液進(jìn)行稀釋,從中吸取0.2 mL溶液,然后加入0.2 mL β-淀粉酶測(cè)定反應(yīng)底物,置于40 ℃恒溫水浴中保溫10 min,加3 mL終止液,在400 nm處測(cè)定吸光度值。其中待測(cè)酶液和底物,均事先置于40 ℃恒溫水浴中保溫5 min。測(cè)完后按照試劑盒提供的計(jì)算公式及稀釋倍數(shù),換算成以鮮薯計(jì)算的酶活性單位(U)。

    1.3.4 淀粉酶熱穩(wěn)定性的測(cè)定

    參考淀粉酶活性測(cè)定方法,分別測(cè)定樣品在50、60、70、80、90 ℃時(shí)的酶活性,由于品種間及不同溫度下酶活性差距大,需要調(diào)整適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù),確保吸光度在量程范圍內(nèi),再按各自的稀釋倍數(shù),統(tǒng)一轉(zhuǎn)換到淀粉酶活性測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)稀釋倍數(shù)下的吸光度。其中β-淀粉酶熱穩(wěn)定性測(cè)定增加75 ℃的處理。參考淀粉酶活性測(cè)定方法,在60 、70 、75 、80 ℃條件下測(cè)定20 min內(nèi)每2 min時(shí)的β-淀粉酶活性,以標(biāo)準(zhǔn)稀釋倍數(shù)下的吸光度來表示。

    1.3.5 生淀粉體外糖化的測(cè)定

    選取3個(gè)品種的新鮮薯塊,切絲后用高速組織搗碎機(jī)搗碎后,使用清水沖洗,180目篩網(wǎng)過濾2次,所得濾液以447 g速度離心10 min,棄上清液得到淀粉。稱取新鮮濕淀粉0.20 g置于15 mL塑料離心管,加入1.3.3中的上清液0.4 mL和5 mL蒸餾水,置于75 ℃水浴鍋,并控制水浴鍋在15 min左右升到85 ℃,期間不斷振蕩離心管。達(dá)到85 ℃后迅速取出,置入冷水中冷卻。以加入5.4 mL蒸餾水為對(duì)照,測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)生的還原糖含量,換算成以鮮薯計(jì)的還原糖含量。

    1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,其中組間平均值比較采用Duncan分析(P<0.05)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 β-淀粉酶活性變化

    對(duì)3個(gè)甘薯品種的β-淀粉酶活性進(jìn)行多因素實(shí)驗(yàn)的方差分析(表1),結(jié)果表明,甘薯塊根中β-淀粉酶活性高低受品種、加熱溫度和保溫時(shí)間極顯著的影響,也取決于品種和反應(yīng)條件(包括溫度和時(shí)間)之間的相互作用。其中,加熱溫度占總方差比例最大。

    表1 加熱溫度和保溫時(shí)間對(duì)不同甘薯品種塊根中β-淀粉酶活性的影響

    當(dāng)加熱溫度高于酶的最適溫度時(shí),酶的活性就會(huì)逐漸失去;隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng),薯塊中淀粉酶的失活率升高,并且這個(gè)過程是不可逆的。因此,適宜的加熱溫度和保溫時(shí)間,在保持甘薯淀粉酶活性的穩(wěn)定性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。溫度對(duì)β-淀粉酶活性的影響由圖1所示,3個(gè)甘薯品種的β-淀粉酶活性在不同溫度條件下變化趨勢(shì)基本一致,變化的程度有所不同。當(dāng)溫度低于60 ℃時(shí),β-淀粉酶活性隨溫度的升高而增大;當(dāng)溫度高于60 ℃時(shí),β-淀粉酶活性隨著溫度的升高呈下降趨勢(shì)。供試品種在60 ℃溫度條件下可以較好地保持甘薯淀粉酶活性,與前人研究結(jié)果基本一致[14,17]。β-淀粉酶不能水解天然淀粉,能水解糊化的甘薯淀粉[14]。本研究中β-淀粉酶在75 ℃和80 ℃仍有較強(qiáng)的活性,80 ℃時(shí)其糖化能力已經(jīng)大大降低,說明其不能耐受80 ℃以上的高溫。在70~90 ℃范圍內(nèi),浙薯13的β-淀粉酶活性下降幅度顯著小于浙薯33,與浙薯75無顯著差異;說明浙薯13的β-淀粉酶熱穩(wěn)定性較強(qiáng)。當(dāng)反應(yīng)溫度一定時(shí),在保溫時(shí)間在20 min以內(nèi)時(shí),β-淀粉酶活性總體上都是隨保溫時(shí)間延長(zhǎng)而增大;當(dāng)溫度高于60 ℃時(shí),糖化速度隨保溫時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì),β-淀粉酶活性趨于平穩(wěn)(圖2)。另外,對(duì)3個(gè)甘薯品種之間比較分析發(fā)現(xiàn),浙薯33的淀粉酶活性在同樣反應(yīng)條件下最高,浙薯13次之,浙薯75最低。與保溫時(shí)間和品種兩個(gè)因素相比,溫度是影響β-淀粉酶活性的主要因素。因此,在甘薯蒸煮食用及其產(chǎn)品加工過程中應(yīng)嚴(yán)格控制加熱的溫度。

    圖1 不同溫度條件下β-淀粉酶活性變化

    圖2 不同溫度及不同加熱時(shí)間處理對(duì)三個(gè)品種甘薯β-淀粉酶熱穩(wěn)定性的影響

    3個(gè)甘薯品種中,浙薯13和浙薯33能夠很好地保持其中的淀粉酶活性,浙薯13的耐熱性更強(qiáng)。浙薯13和浙薯33因含有相對(duì)較高的β-淀粉水解潛力使其成為薯脯干加工的良好原料。

    2.2 α-淀粉酶活性變化

    方差分析結(jié)果表明,甘薯塊根中α-淀粉酶活性不僅受品種和加熱溫度極顯著的影響,而且受品種與加熱溫度之間互作效應(yīng)極顯著的影響(表2)。其中,加熱溫度占總方差比例最大。與品種相比,加熱溫度是影響α-淀粉酶活性的主要因素。溫度對(duì)α-淀粉酶活性的影響由圖3所示,α-淀粉酶活性隨溫度的升高而下降;當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí),其糖化能力已經(jīng)大大降低;在50~70 ℃范圍內(nèi),3個(gè)品種的α-淀粉酶活性均大幅下降,其中浙薯13的α-淀粉酶活性下降幅度最小且顯著低于浙薯75,與浙薯33下降幅度無明顯差異。當(dāng)溫度超過80 ℃時(shí),酶開始變性失活,從而抑制了糖化反應(yīng)的進(jìn)行。3個(gè)甘薯品種的α-淀粉酶活性在不同溫度條件下變化趨勢(shì)基本一致,變化的程度有所不同。對(duì)圖1和圖3的結(jié)果進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn),各品種塊根中α-淀粉酶活性都遠(yuǎn)低于β-淀粉酶活性,這與前人的研究結(jié)果一致。

    表2 加熱溫度對(duì)不同甘薯品種塊根中α-淀粉酶活性的影響

    圖3 不同溫度條件下α-淀粉酶活性變化

    2.3 還原糖、可溶性糖含量變化

    β-淀粉酶催化可溶性淀粉向糖的轉(zhuǎn)化,從而增加了游離糖的組成和加工產(chǎn)品的甜度[12]。從圖4可以看出,不同品種在蒸煮之后的可溶性糖和還原糖含量均顯著增加,且還原糖含量的增幅較可溶性糖含量更大。不同品種間熟薯可溶性糖含量和還原糖含量均存在顯著差異;可溶性糖含量和還原糖含量的增量和增幅均是浙薯33最大,浙薯13次之,浙薯75最小。以上結(jié)果可以推斷,甘薯蒸煮過程中,達(dá)到淀粉糊化溫度后,β-淀粉酶仍存在較大活性,對(duì)糊化淀粉的糖化作用導(dǎo)致甘薯蒸煮過程中糖分的變化[5,18-20]。進(jìn)一步的生淀粉體外糖化實(shí)驗(yàn)證明,在75~85 ℃條件下,以還原糖含量為指標(biāo),含β-淀粉酶的甘薯提取液能使生淀粉在糊化的同時(shí)實(shí)現(xiàn)糖化。β-淀粉酶活性高的品種,其糖化產(chǎn)率,即還原糖含量也相應(yīng)較高。夏季或高溫季節(jié)進(jìn)行甘薯收獲時(shí),鮮薯糖分結(jié)累少,甜度低,而β-淀粉酶能在蒸煮過程中大幅度增加糖分,因此選擇β-淀粉酶活性高、熱穩(wěn)定性好的品種,適合夏季收獲,作為鮮食或加工品種應(yīng)用。

    注:同一類型的糖分柱上不同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖4 不同品種蒸煮前后糖分變化

    注:不同字母的表示處理間差異顯著(P< 0.05)。圖5 生淀粉體外糖化結(jié)果

    在適宜條件下,α-淀粉酶隨機(jī)作用于淀粉鏈內(nèi)部的α-1,4-糖苷鍵,產(chǎn)物是糊精及少量的麥芽糖和葡萄糖;β-淀粉酶可以從淀粉的非還原性末端降解α-1,4-糖苷鍵,生成麥芽糖[4]?;谝陨献饔脵C(jī)理,Mensah等[12]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,α-淀粉酶和β-淀粉酶水解淀粉存在很好的協(xié)同作用。甘薯塊根中含有一定量的α-淀粉酶,在高溫下,它的存在可能增強(qiáng)了淀粉向麥芽糖的轉(zhuǎn)化,而升溫和增加加熱時(shí)間通常會(huì)降低β-淀粉酶的活性并增強(qiáng)麥芽糖的形成[10]。本研究中β-淀粉酶的最佳溫度在60 ℃左右,加熱到75 ℃仍可保留相對(duì)較高比例的內(nèi)源淀粉酶[12,21]。因此,較高溫度下還原糖含量的差異可能是由于α-淀粉酶和β-淀粉酶的協(xié)同作用。

    3 結(jié)論

    甘薯塊根中β-淀粉酶活性受品種、加熱溫度和保溫時(shí)間極顯著的影響;與保溫時(shí)間和品種這兩個(gè)因素相比,溫度是影響β-淀粉酶活性的主要因素。甘薯塊根中α-淀粉酶活性受品種、加熱溫度以及兩者之間互作效應(yīng)極顯著的影響;與品種相比,加熱溫度是影響α-淀粉酶活性的主要因素。因此,在甘薯蒸煮食用及其產(chǎn)品加工過程中應(yīng)嚴(yán)格控制加熱的溫度。3個(gè)甘薯品種中,浙薯13和浙薯33能夠很好地保持其中的β-淀粉酶活性,浙薯13的耐熱性更強(qiáng)。β-淀粉酶活性高的品種,其糖化產(chǎn)率也相對(duì)較高。甘薯品種浙薯13和浙薯33因含有相對(duì)較高的β-淀粉水解潛力和耐熱性,適合在夏季或高溫季節(jié)收獲作為鮮食和加工的良好原料。

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