雪蓮菌發(fā)酵豇豆工藝優(yōu)化及其揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

王玉瑋 岳田利

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 咸陽 712100)

雪蓮菌又稱藏靈菇、西藏雪蓮、開菲爾粒，是一種乳白色或淺黃色的膠質(zhì)狀顆粒，形狀無規(guī)律像蒸熟的米粒，具有彈性及黏稠感[1-2]；富含乳酸菌、乙酸細(xì)菌和酵母菌[3]，被認(rèn)為是一種益生菌資源，這主要是因?yàn)槌俗陨淼臓I養(yǎng)價(jià)值外，其代謝產(chǎn)物還能提供各種健康益處，包括抗誘變、抗結(jié)腸炎、抗菌和抗氧化等[4]，所發(fā)酵的產(chǎn)品也具有獨(dú)特的風(fēng)味。豇豆富含蛋白質(zhì)、維生素和微量元素，利用乳酸菌發(fā)酵的酸豆角，清爽解膩、酸香可口，可以促進(jìn)人體消化，備受大眾喜愛。因此利用雪蓮菌發(fā)酵豇豆，開發(fā)風(fēng)味較好的功能性泡菜具有重要意義。

雪蓮菌發(fā)酵的產(chǎn)品風(fēng)味獨(dú)特，如發(fā)酵的酸奶有著特有的酸味和香味，并且具有起泡性和醇香味[5]；生產(chǎn)的干酪表面有光澤，不僅具有干酪特有的風(fēng)味，還具有適宜醇香[6]；發(fā)酵面包，面包在貯藏過程中揮發(fā)性的香氣能夠保持更加持久[7]。當(dāng)前，泡菜主要是通過自然發(fā)酵或純種乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生，發(fā)酵過程中微生物代謝貫穿整個(gè)代謝過程，其中包含了復(fù)雜的物理變化和生物化學(xué)反應(yīng)[8]。研究[9-11][12]20-58發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵條件的不同會(huì)影響酸菜的品質(zhì)和風(fēng)味特征。張郁松[13]通過單因素和正交試驗(yàn)確定了接種乳酸菌發(fā)酵泡菜的最佳工藝；黃慧福等[14-16]研究發(fā)現(xiàn)與自然發(fā)酵相比，接種發(fā)酵有利于改善泡菜的品質(zhì)和風(fēng)味。目前關(guān)于雪蓮菌發(fā)酵泡菜的研究較少[17]，而關(guān)于雪蓮菌發(fā)酵蔬菜工藝優(yōu)化及發(fā)酵后泡菜的風(fēng)味研究尚未見報(bào)道。

研究擬利用雪蓮菌發(fā)酵豇豆，以感官評分和總酸含量為評價(jià)指標(biāo)，研究鹽添加量、雪蓮菌接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對雪蓮菌發(fā)酵豇豆品質(zhì)的影響。在最優(yōu)發(fā)酵工藝下對豇豆進(jìn)行發(fā)酵，并采用高效液相色譜(HPLC)法和氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析發(fā)酵前后風(fēng)味物質(zhì)的變化，旨在為開發(fā)營養(yǎng)、健康風(fēng)味良好的功能型泡菜提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雪蓮菌：取自甘南牧民家中，保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)健康食品制造與安全控制實(shí)驗(yàn)室；

發(fā)酵袋：常德市臨澧縣德特實(shí)驗(yàn)用品經(jīng)營部；

豇豆、食鹽：市售；

氫氧化鈉：分析純，西安化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：120150-T230型，日本島津公司；

生化培養(yǎng)箱：ZXDP-B1160型，上海智誠分析儀器制造有限公司；

自動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器：50/30 μm PDMS/DVB，美國SUPELCO公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜的制備 將新鮮豇豆除去不可食用部分，再經(jīng)清洗、瀝干和切分后，稱取200 g裝入1 000 mL的厭氧發(fā)酵袋中，加入400 mL鹽水，加入雪蓮菌，密封后放入恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵。自然發(fā)酵組不接種雪蓮菌。

1.3.2 雪蓮菌的準(zhǔn)備 將雪蓮菌從牛奶中濾除，用已滅菌的生理鹽水洗凈備用。

1.3.3 感官評分 根據(jù)文獻(xiàn)[12]20，由10人組成的評判小組(5男5女，包括2名專家)，按照泡菜感官評分原則對泡菜的色澤、香氣、滋味和脆性4個(gè)方面進(jìn)行評分。

1.3.4 總酸含量測定 按GB/T 12456—2008執(zhí)行。

1.3.5 揮發(fā)性物質(zhì)測定 參照Wei等[18]的方法。利用GC-MS自帶軟件，通過與NIST14比對對揮發(fā)性化合物進(jìn)行鑒定，物質(zhì)濃度用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行半定量。

1.3.6 雪蓮菌發(fā)酵豇豆單因素試驗(yàn)

(1) 鹽添加量：固定雪蓮菌接種量1.5%，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間4 d，考察鹽添加量(2%，3%，4%，5%，6%)對豇豆感官評分和總酸含量的影響。

(2) 雪蓮菌接種量：固定鹽添加量4%，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間4 d，考察雪蓮菌接種量(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%)對豇豆感官評分和總酸含量的影響。

(3) 發(fā)酵時(shí)間：固定鹽添加量4%，雪蓮菌接種量1.5%，發(fā)酵溫度25 ℃，考察發(fā)酵時(shí)間(2，3，4，5，6 d)對豇豆感官評分和總酸含量的影響。

(4) 發(fā)酵溫度：固定鹽添加量4%，雪蓮菌接種量1.5%，發(fā)酵時(shí)間4 d，考察發(fā)酵溫度(15，20，25，30，35 ℃)對豇豆感官評分和總酸含量的影響。

1.3.7 雪蓮菌發(fā)酵豇豆正交優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素的基礎(chǔ)上，以鹽添加量、雪蓮菌接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間為因素，對豇豆進(jìn)行感官評分并測定總酸含量，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較(P<0.05)，使用Excel 2019軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 各因素對雪蓮菌豇豆發(fā)酵品質(zhì)的影響

2.1.1 鹽添加量 由圖1可知，隨著鹽添加量的增加，總酸含量下降，是因?yàn)榘l(fā)酵過程中乳酸菌活性受到了鹽的抑制，鹽添加量越高對乳酸菌活性的抑制作用越明顯。隨著鹽添加量的增加，感官評分存在顯著性差異(P<0.05)，當(dāng)鹽添加量為4%時(shí)，感官評分最高為91.5分。綜上，選擇鹽添加量為3%，4%，5%為正交試驗(yàn)中的3個(gè)水平。

圖1 鹽添加量對豇豆發(fā)酵品質(zhì)的影響Figure 1 Effect of salt concentration on the fermentation quality of cowpea

2.1.2 雪蓮菌接種量 由圖2可知，隨著雪蓮菌接種量的增加，總酸含量不斷增加；感官評分則先升高后下降，可能是雪蓮菌接種量過低，短時(shí)間內(nèi)沒有形成較適的發(fā)酵環(huán)境，容易產(chǎn)生污染，影響風(fēng)味；雪蓮菌接種量過高，發(fā)酵速度快致使細(xì)胞衰老，出現(xiàn)自溶，影響風(fēng)味[19]。當(dāng)雪蓮菌接種量為1.5%時(shí)，感官評分最高。故選擇雪蓮菌接種量1.0%，1.5%，2.0% 3個(gè)水平進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 雪蓮菌接種量對豇豆發(fā)酵品質(zhì)的影響Figure 2 Effect of inoculation amount of kefir grains on the fermentation quality of cowpea

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間 由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，總酸含量不斷上升，主要是因?yàn)槿樗峋L代謝所致。隨著酸的積累，泡菜的風(fēng)味逐漸增強(qiáng)，感官評分也升高，第4天時(shí)感官評分最高為82分，總酸含量為3.64 g/kg；但發(fā)酵時(shí)間過長，酸積累過量會(huì)使得豇豆變黏變軟，感官評分下降。尚英等[16]研究發(fā)現(xiàn)，接種濕法發(fā)酵酸豆角總酸含量為0.35%時(shí)達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，此時(shí)酸豆角品質(zhì)較高，且酸度符合消費(fèi)者的口感。因此，選擇發(fā)酵時(shí)間3，4，5 d進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對豇豆發(fā)酵品質(zhì)的影響Figure 3 Effect of fermentation days on the fermentation quality of cowpea

2.1.4 發(fā)酵溫度 由圖4可知，總酸含量隨發(fā)酵溫度的升高而升高；感官評分隨發(fā)酵溫度的升高先升高后降低，當(dāng)發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)感官評分最高，為85分，總酸含量為3.40 g/kg。從感官評分上看，25 ℃時(shí)的感官評分與其他發(fā)酵溫度時(shí)的差異顯著(P<0.05)，可能是因?yàn)榘l(fā)酵溫度較低時(shí)，乳酸菌生長代謝均較慢，產(chǎn)酸積累較少，且雜菌容易生長繁殖，最終影響成品的整體風(fēng)味[20]。綜上，選擇發(fā)酵溫度20，25，30 ℃進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 發(fā)酵溫度對豇豆發(fā)酵品質(zhì)的影響Figure 4 Effect of fermentation temperature on the fermentation quality of cowpea

2.2 雪蓮菌發(fā)酵豇豆正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以感官評分、總酸含量為考察指標(biāo)，對鹽添加量、雪蓮菌接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度進(jìn)行正交試驗(yàn)以確定最優(yōu)的豇豆發(fā)酵條件。正交試驗(yàn)因素水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Orthogonal test design

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal test design and results

由表2可知，感官評分的最優(yōu)方案為A2B3C2D2，即鹽添加量4%、雪蓮菌接種量2.0%、發(fā)酵時(shí)間4 d、發(fā)酵溫度25 ℃，各因素對感官評分影響大小依次為D>A>C>B?？偹岷康淖顑?yōu)方案為A2B2C2D3，即鹽添加量4%、雪蓮菌接種量1.5%、發(fā)酵時(shí)間4 d、發(fā)酵溫度30 ℃，各因素對總酸含量影響大小依次為D>B>C>A。由表3可知，各因素對總酸含量影響均為極顯著(P<0.01)；除雪蓮菌接種量對感官評分影響為顯著外(P<0.05)，其他3個(gè)因素對感官評分影響均為極顯著(P<0.01)。綜合考慮，確定豇豆發(fā)酵最佳工藝條件為鹽添加量4%，雪蓮菌接種量1.5%，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間4 d。此條件下發(fā)酵豇豆的感官評分為87分，總酸含量為3.40 g/kg(n=3)，且發(fā)酵后的豇豆色澤均勻呈金黃色，脆性較好，香氣純正撲鼻，酸咸適口，滋味鮮美。

表3 正交試驗(yàn)方差分析表?Table 3 Variance analysis

2.3 發(fā)酵前后豇豆風(fēng)味變化

泡菜的風(fēng)味可以通過乳酸菌發(fā)酵進(jìn)行改善[21-22]。利用HS-SPME-GC-MS檢測發(fā)酵前后揮發(fā)性物質(zhì)含量的變化見表4。由表4可知，豇豆原料中共檢測出26種揮發(fā)性物質(zhì)，醛類和醇類是新鮮豇豆中的主要揮發(fā)性物質(zhì)，與劉洪[12]55的研究結(jié)果一致。發(fā)酵后共檢測到揮發(fā)性物質(zhì)72種，其中酯類、醇類、醛類、酮類、酸類、酚類、烷烴類、烯烴類分別為23，22，8，6，4，3，4，2種。產(chǎn)生的56種新物質(zhì)中醇類和酯類最多，約占總揮發(fā)性物質(zhì)的85%，使泡菜香氣更加豐富；其次是酮類和醛類。Park等[23]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵條件不同使得發(fā)酵后樣品中揮發(fā)性化合物的種類和含量不同。雪蓮菌發(fā)酵后各類物質(zhì)的含量與自然發(fā)酵相比均較高，有24種物質(zhì)在自然發(fā)酵中未檢測到，主要是因?yàn)榘l(fā)酵體系中菌種不同，其代謝速率不同，致使代謝產(chǎn)物積累的量不同。雪蓮菌發(fā)酵后揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量更加豐富[24-26]，可為泡菜提供濃郁的香氣。

表4 豇豆發(fā)酵前后揮發(fā)性物質(zhì)含量變化?Table 4 Changes of volatile compounds content in cowpea before and after fermentation mg/kg

續(xù)表4

續(xù)表4

豇豆發(fā)酵后醇類含量較高，主要是因?yàn)槠咸烟墙到夂桶被岱纸獯x所致[27]。大多數(shù)醇類都具有明顯的花果香味[28]。其中乙醇含量最高，分別為20.43，18.61 mg/kg。由于乙醇具有中性香氣，會(huì)直接影響泡菜的整體風(fēng)味，也會(huì)影響其他風(fēng)味化合物的保留[29]。此外，異戊醇和1-辛烯-3-醇含量較高，為泡菜香氣提供重要貢獻(xiàn)[30]。醇類與有機(jī)酸之間相互作用生成酯類物質(zhì)，其風(fēng)味閾值較低，對泡菜的風(fēng)味有較大的貢獻(xiàn)。酯類中乙酸乙酯(具有香蕉和蘋果香味)[31]的含量較高，雪蓮菌發(fā)酵后其含量為19.92 mg/kg。

新鮮豇豆中的醛類含量較高，為26.64 mg/kg，尤其是己醛。發(fā)酵后，泡菜中的醛類含量減少，但高于自然發(fā)酵的，尤其是E-2-庚烯醛含量較高。醛類物質(zhì)不穩(wěn)定，易被氧化為酸或還原為醇，且濃度較高會(huì)產(chǎn)生異味[32]。所以在泡菜的揮發(fā)性物質(zhì)中，醛類物質(zhì)含量較低。醛類的微量存在同樣對泡菜的風(fēng)味產(chǎn)生重要影響，是構(gòu)成泡菜獨(dú)特風(fēng)味的重要成分[20]。

酮類化合物在低濃度下仍會(huì)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的風(fēng)味[21]。發(fā)酵后，酮類含量上升，其中2-庚酮、1-戊烯-3-酮、香葉基丙酮和2-壬酮具有水果、花香等香氣[33]，僅在發(fā)酵后產(chǎn)生，其濃度低于閾值，但仍可以協(xié)同促進(jìn)泡菜的香氣。

發(fā)酵后，酸類、酚類、烷類和烯類含量升高，且種類和含量高于自然發(fā)酵的，其中異戊酸、辛酸、4-乙基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚含量較高，對泡菜香氣有重要貢獻(xiàn)。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得到了雪蓮菌發(fā)酵豇豆的最佳工藝條件，即鹽添加量4%，雪蓮菌接種量1.5%，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時(shí)間4 d，此條件下發(fā)酵豇豆感官評分為87分，總酸含量為3.40 g/kg。經(jīng)氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用檢測分析，雪蓮菌發(fā)酵豇豆后鑒定出72種揮發(fā)性物質(zhì)，除醛類外，其他物質(zhì)含量均升高，說明發(fā)酵后泡菜的揮發(fā)性物質(zhì)較豐富。與自然發(fā)酵相比，雪蓮菌發(fā)酵后的泡菜揮發(fā)性物質(zhì)種類與含量均較高，其中有24種物質(zhì)在自然發(fā)酵中未檢測到，這些物質(zhì)為泡菜的香氣提供了重要的貢獻(xiàn)。綜上，雪蓮菌發(fā)酵蔬菜具有可行性，可以改善泡菜的風(fēng)味，使得發(fā)酵后的泡菜香氣濃郁。泡菜發(fā)酵的特征風(fēng)味不僅與風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量有關(guān)，也取決于各物質(zhì)的閾值，以及各物質(zhì)對總體香氣的貢獻(xiàn)，后續(xù)可以通過氣相色譜—嗅聞—質(zhì)譜聯(lián)用法，確定雪蓮菌發(fā)酵豇豆的特征風(fēng)味。