食品中甲醛的穩(wěn)定碳同位素特征分析及其在甲醛源解析中的應(yīng)用

韓 莉 余婷婷 劉 迪 楊 青 高 芳 王會霞

(1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430075; 2.湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075)

甲醛(Formaldehyde，F(xiàn)A)被廣泛用于醫(yī)療、衛(wèi)生和農(nóng)業(yè)等多個行業(yè)。甲醛暴露引發(fā)的人體健康風(fēng)險持續(xù)被國際關(guān)注[1]。美國環(huán)境保護(hù)署規(guī)定每天攝入的量不超過0.2 mg/kg 體重[2]。2008年，中國衛(wèi)生部印發(fā)的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)》(食品整治辦[2008]3號)的通知中，明令禁止在食品中以任何形式添加甲醛，其限量規(guī)定為“不得檢出”。目前，由甲醛引起的食品安全事件仍屢見不鮮，在新近公布的食藥安全犯罪典型案例中，就有2起案例是非法使用工業(yè)用甲醛[3]。然而，監(jiān)管實(shí)踐以及研究[4-6]發(fā)現(xiàn)許多食品存在一定量的內(nèi)源性甲醛；水發(fā)水產(chǎn)品中甲醛平均值為50.35 mg/kg，海水魚類平均值為8.85 mg/kg，蝦蟹類、貝類、淡水魚中甲醛含量依次減少[7]。香菇引發(fā)的甲醛問題也引起了人們的廣泛關(guān)注，香菇甲醛是自身酶促反應(yīng)的代謝產(chǎn)物[8]。日本農(nóng)產(chǎn)品中干香菇和鮮香菇的甲醛含量分別為244，54 mg/kg，這些甲醛都是香菇生長、保鮮和干燥過程中自然產(chǎn)生。果蔬中的甲醛本底可達(dá)0.79～2.52 mg/kg[9]。小麥粉中甲醛的本底均值為3.85 mg/kg[10]。李薇霞等[6,11]研究發(fā)現(xiàn)，奶糖中主要物質(zhì)奶粉中酪蛋白和乳糖的美拉德反應(yīng)是奶糖中甲醛生成的主要原因。目前食品中甲醛的檢測方法如分光光度法[12-13]、氣相色譜法[14-15]、液相色譜法[16-18]和熒光法[19]等，主要以定量分析為主，難以識別食品中甲醛的來源。

相比“分子”尺度上的含量分析方法，單體穩(wěn)定同位素分析技術(shù)(Compound-specific Stable Isotope Analysis,CSIA)在“原子”尺度上探尋物質(zhì)的來源和相關(guān)的遷移、轉(zhuǎn)化規(guī)律，具有更為獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。利用不同來源物質(zhì)中同位素豐度存在差異的原理，可甄別環(huán)境與食品中污染物來源。Marisa等[20]指出通過檢測葡萄酒中Pb的同位素比率可判斷鉛的污染源是自然污染還是土壤污染；通過測定食品中的13C值可以識別食品中多環(huán)芳烴和多氯聯(lián)苯的來源[21-22]。

由于甲醛分子具有強(qiáng)極性，在色譜柱上難以保留，測試靈敏度太低，大多數(shù)甲醛相關(guān)的檢測分析都是建立在甲醛衍生化后對甲醛衍生物的分析上[23-25]。碳同位素組成檢測過程中，對于檢測靈敏度不夠的有機(jī)物質(zhì)，也可以對待測物進(jìn)行衍生反應(yīng)，衍生物的同位素組成可經(jīng)質(zhì)量作用定律從理論上計算出待測物的碳同位素組成[26-27]。余應(yīng)新[28]利用GC/C/IRMS技術(shù)，采用2,4-二硝基苯肼柱衍生化并對衍生物的穩(wěn)定碳同位素進(jìn)行測定，間接得到了大氣甲醛的穩(wěn)定同位素組成及特征，且衍生化過程不存在同位素分餾。文章擬驗(yàn)證衍生化—?dú)庀嗌V—燃燒—同位素比質(zhì)譜法測定食品中甲醛的穩(wěn)定碳同位素組成的可行性，并用此方法分析水產(chǎn)品、果蔬、蔬菜制品3類典型食品中甲醛的穩(wěn)定同位素組成及分布特征，通過模擬試驗(yàn)分析內(nèi)外源甲醛的貢獻(xiàn)率，驗(yàn)證甲醛來源定量解析模型的可行性，為建立完善的食品安全溯源制度體系、食品中有毒有害物質(zhì)的防控及食品安全監(jiān)管提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醛水溶液、2,4-二硝基苯肼(DNPH)、鹽酸、氯化鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

超純水為實(shí)驗(yàn)室自制一級水；

甲醛2,4-二硝基苯腙(FA-DNPH)標(biāo)準(zhǔn)品：純度為99.8%，美國CATO公司；

甲醛水溶液標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量濃度為10 mg/L，中國First Standard公司；

同位素標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)[乙醇溶液(δ13C=-26.72‰，BCR-660)，咖啡因(δ13C=-19.357‰，IAEA-600)]：國際原子能機(jī)構(gòu)。

1.2 儀器與設(shè)備

氣體穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀：DeltaV型，美國賽默飛世爾科技公司；

氣相色譜儀：Trace GC Ultra型，美國賽默飛世爾科技公司；

元素分析儀：Flash 2000HT型，美國賽默飛世爾科技公司；

高效液相色譜儀：e2695型，美國Waters公司；

冷凍離心機(jī)：Allegra 64R型，美國貝克曼公司；

恒溫水浴搖床：WNE29型，德國memmert公司；

分析天平：ME204/02型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

超聲儀：S180H型，德國Elma公司；

氮吹儀：N-EVAP112型，美國Organomation Associates Inc公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

(1) 樣品制備：水產(chǎn)品、蔬菜制品、果蔬樣品切碎后研磨成泥或粉末，魷魚樣品分開內(nèi)臟和其余肌肉部分，水產(chǎn)品和果蔬-20 ℃密封保存，蔬菜制品干燥密封常溫保存。衍生試劑2,4-二硝基苯肼用色譜純的乙腈重結(jié)晶兩次后用高效液相色譜檢驗(yàn)其純度。將過量的純化后的DNPH溶于24 mL鹽酸，并定容至100 mL，配制成飽和的DNPH衍生溶液。

(2) 甲醛源解析模擬試驗(yàn)：選取龍頭魚中含量較高的樣品進(jìn)行外源性加標(biāo)模擬試驗(yàn)并測定其甲醛含量及δ13C值。本底測試：龍頭魚中4個平行批次；外源性甲醛加標(biāo)測試：龍頭魚中3個水平的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液加標(biāo)，每個水平2平行；甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液測試：空白無基質(zhì)樣品中4個水平的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液加標(biāo)，每個水平2平行。甲醛標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度為1.155 6 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，龍頭魚中添加3個不同濃度水平(添加體積為30，150，200 μL)的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

(3) 衍生產(chǎn)物甲醛2,4-二硝基苯腙含量和δ13C值測定：準(zhǔn)確稱取1～2 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 水，超聲提取30 min，4 ℃、9 000 r/min離心10 min，使樣品及油脂和水充分分離，將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈離心管，加入1 mL DNPH衍生溶液(若樣品中FA含量過高，可增加衍生溶液的添加量至反應(yīng)完全)，迅速蓋上蓋子，于60 ℃搖床衍生反應(yīng)1 h，取出后迅速用流水冷卻，過0.22 μm濾膜，測定衍生物含量。向衍生后溶液中加入15 mL正己烷，翻轉(zhuǎn)搖勻充分萃取，4 ℃、4 000 r/min 離心3 min，取上層正己烷于50 mL離心管中，向殘留水溶液中再加入15 mL正己烷，重復(fù)萃取2～3次，合并正己烷層，將萃取液置于氮吹儀吹干，用甲醇定容至1 mL，通過GC/C/IRMS測定甲醛2,4-二硝基苯腙的穩(wěn)定碳同位素值，以δ13CPDB值為-26.72‰的乙醇溶液矯正的CO2為內(nèi)標(biāo)，得到相對于箭石化石標(biāo)準(zhǔn)(PDB)的同位素組成。

(4) 衍生劑2,4-二硝基苯肼的δ13C值測定：稱取處理后的2,4-二硝基苯肼粉末0.1～2.0 mg，用錫杯包裹住粉末，置于自動進(jìn)樣盤，通過元素分析—同位素比值質(zhì)譜法(EA-IRMS)測定2,4-二硝基苯肼的穩(wěn)定碳同位素值。以δ13CPDB值為-27.771‰的咖啡因矯正的CO2為內(nèi)標(biāo)，得到相對于PDB的同位素組成。

(5) 甲醛(FA)的δ13C值測定：5 mL樣品頂空瓶中吸取1 mL FA水溶液(37%)，加入2 g氯化鈉，65 ℃反應(yīng)箱平衡90 min，用5 mL氣密性氣體進(jìn)樣針抽取2 mL FA頂空氣體進(jìn)樣，通過GC/C/IRMS測定FA水溶液中FA的δ13C值，以δ13CPDB值為-26.72‰的乙醇溶液矯正的CO2為內(nèi)標(biāo)，得到相對于PDB的同位素組成。

1.3.2 計算方法

(1) 甲醛的δ13C值：參照余應(yīng)新等[28-29]的方法，按式(1)計算FA的穩(wěn)定碳同位素比值。

fFAδ13CFA+fDNPHδ13CDNPH=δ13CFA-DNPH，

(1)

式中：

fFA、fDNPH——FA、DNPH在衍生物中的碳原子占比(fFA+fDNPH=1)。

(2) 外源性甲醛添加貢獻(xiàn)率：按式(2)計算人為添加甲醛的貢獻(xiàn)率，結(jié)合式(3)、式(4)得到人為添加貢獻(xiàn)率Xanthropogenic和δ13C值的關(guān)系式。

(2)

(3)

(4)

式中：

Xanthropogenic——人為添加甲醛對樣品甲醛的貢獻(xiàn)率；

1.4 數(shù)據(jù)處理

甲醛的穩(wěn)定碳同位素組成數(shù)據(jù)由Isodat Acquisition采集軟件采集，Isodat Workspace定量分析軟件分析數(shù)據(jù)。甲醛的含量由Empower軟件采集并分析。數(shù)據(jù)匯總后通過Microsoft Office Excel進(jìn)行相關(guān)計算處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相衍生化過程同位素效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，理論值和測定值最大偏差為0.344‰，可以認(rèn)為甲醛的衍生化反應(yīng)符合質(zhì)量平衡方程。根據(jù)Rieley[30]提出的同位素效應(yīng)理論，一個化學(xué)反應(yīng)中同位素是否發(fā)生分餾，取決于決定反應(yīng)速率的那一級反應(yīng)是否存在與碳原子相連的化學(xué)鍵的斷裂和生成。DNPH在反應(yīng)過程中沒有碳原子參與的化學(xué)鍵斷裂與生成，因此甲醛的衍生化反應(yīng)沒有發(fā)生碳同位素分餾。

表1 液相衍生化過程結(jié)果表Table 1 Results of liquid phase derivatization process ‰

2.2 水產(chǎn)品中甲醛含量及其碳同位素組成

由表2可知，魷魚樣品中甲醛含量為0.341～24.185 mg/kg，δ13C值為-48.167‰～-24.514‰，龍頭魚中甲醛含量為54.555～121.416 mg/kg，δ13C值為-45.430‰～-27.468‰；日常監(jiān)督抽檢的淡水魚中甲醛均為未檢出；龍頭魚中的甲醛含量遠(yuǎn)高于魷魚，研究[31]表明，氧化三甲胺酶(TMAOase)存在于魷魚、鱈魚、甲殼類動物等水產(chǎn)品的內(nèi)臟組織和肌肉中，這種酶的作用底物是氧化三甲胺(TMAO)，可催化使其分解產(chǎn)生二甲胺和甲醛(見圖1)。魷魚和龍頭魚中的氧化三甲胺酶對甲醛的生成起主要作用，氧化三甲胺可在酶的作用下分解成甲醛和二甲胺，因此海水魚中氧化三甲胺及酶的存在是其體內(nèi)甲醛本底產(chǎn)生的主要原因，不同海水魚中酶的濃度、生存環(huán)境差異使得不同種類和地域的魚體內(nèi)產(chǎn)生的甲醛含量不一，甲醛中穩(wěn)定碳同位素組成也呈種類差異和地域差異；淡水魚中可能缺乏氧化三甲胺酶，不具備甲醛的生成條件，所以一般很少在淡水魚中檢出甲醛。

表2 水產(chǎn)品中甲醛含量及δ 13C值?Table 2 Formaldehyde mass fraction and δ 13C value in aquatic products

圖1 內(nèi)源性甲醛生成途徑Figure 1 Formation pathway diagram of endogenous formaldehyde

由圖2可知，一般魷魚樣品的內(nèi)臟部分甲醛含量高于肌肉部分，氧化三甲胺在酶的作用下轉(zhuǎn)化為甲醛過程可能主要在魷魚的內(nèi)臟部分產(chǎn)生，繼而代謝至肌肉部分，1號魷魚樣品的肌肉部分甲醛含量高于內(nèi)臟部分，可能是肌肉部分的魷魚除了來自于內(nèi)臟自身代謝，還有一部分來自于外源性甲醛帶入。

由圖3可知，龍頭魚中肌肉部分的甲醛含量高于內(nèi)臟部分。在對龍頭魚進(jìn)行切分制樣過程中發(fā)現(xiàn)，龍頭魚的進(jìn)食方式是直接大量吞食小魚，內(nèi)臟中有大量未經(jīng)消化完全的小魚殘渣，而內(nèi)臟部分的制樣是采取全部內(nèi)臟混勻均質(zhì)制樣，這些小魚占內(nèi)臟的質(zhì)量比重較高，使得內(nèi)臟部分甲醛含量偏低。

各樣品種甲醛含量測量值的RSD均<10%圖2 魷魚中甲醛含量示意圖Figure 2 Schematic diagram of formaldehyde mass fraction in squid

各樣品中甲醛含量測量值的RSD均<10%圖3 龍頭魚中甲醛含量示意圖Figure 3 Schematic diagram of formaldehyde mass fraction in dragon fish

為探究水產(chǎn)品貯藏過程中甲醛含量及穩(wěn)定碳同位素比值的變化，30 d后再次對甲醛含量較高的魷魚樣品1～5號和龍頭魚樣品1～6號進(jìn)行甲醛含量和δ13C值測定，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，魷魚和龍頭魚的甲醛含量在30 d后均大量提高，其含量最高分別增加了35.956，224.416 mg/kg，且甲醛的δ13C 值也隨之逐漸偏負(fù)，說明貯藏過程中，魷魚和龍頭魚體內(nèi)的氧化三甲胺在酶的作用下反應(yīng)活躍，甲醛不斷產(chǎn)生，酶促反應(yīng)中，氧化三甲胺轉(zhuǎn)化而來的甲醛中碳原子偏輕，導(dǎo)致魷魚、龍頭魚中甲醛的穩(wěn)定碳同位素比值逐漸偏負(fù)。

2.3 蔬菜制品中甲醛含量及其碳同位素組成

選取日常監(jiān)督抽檢中常有的蔬菜制品類別如干香菇、黃花菜、茶樹菇、木耳、銀耳進(jìn)行甲醛含量測定，不同種類蔬菜制品中甲醛含量如圖5所示。由圖5可知，干香菇中甲醛含量普遍較高，最高可達(dá)212.741 mg/kg；黃花菜中甲醛未檢出；茶樹菇、木耳、銀耳中甲醛均有檢出，但含量較低，不超過3 mg/kg。香菇在生長和貯藏過程中，香菇體內(nèi)的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和半胱氨酸亞砜裂解酶可將香菇酸(γ-谷氨酰半胱氨酸亞砜)轉(zhuǎn)化成甲醛，因此香菇本體會產(chǎn)生大量的內(nèi)源性甲醛，并且隨著貯藏時間的加長其含量不斷增加(見表3)，香菇中甲醛的δ13C值在90 d后逐漸偏正，可能在γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和半胱氨酸亞砜裂解酶作用下，香菇酸中更多13C原子轉(zhuǎn)化為甲醛。

表3 貯藏期香菇干制品甲醛含量變化Table 3 Changes of formaldehyde mass fraction in dried lentinus edodes products during storage

1～5.魷魚樣品 6～11.龍頭魚樣品各樣品種甲醛含量測量值RSD均<10%，δ 13C值測量值SD均<0.5‰圖4 貯藏過程中甲醛含量及碳同位素比值變化示意圖Figure 4 Schematic diagram of the change of formaldehyde mass fraction and carbon isotope ratio during storage

各樣品種甲醛含量測量值RSD均<10%，δ 13C值測量值SD均<0.5‰圖5 蔬菜制品中甲醛含量示意圖Figure 5 Schematic diagram of formaldehyde mass fraction in vegetable products

2.4 果蔬中甲醛含量及其碳同位素組成

對關(guān)注度較高的一些果蔬進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，果蔬中檢出的甲醛含量較低，蘋果中含量最高為2.478 mg/kg，鮮香菇中甲醛含量較高，高達(dá)38.036 mg/kg，但低于干香菇，因?yàn)楦上愎街兴稚?，一般貯藏時間長，甲醛殘留量較高。

2.5 食品中甲醛源解析模擬試驗(yàn)及定量源解析模型分析

2.5.1 食品中甲醛來源分析模擬批試驗(yàn)及結(jié)果 選取龍頭魚中含量較高的樣品進(jìn)行外源性加標(biāo)模擬試驗(yàn)并測定其甲醛含量及δ13C值，模擬試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。由表4 可知，龍頭魚中添加3個不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，加標(biāo)回收率均>90%，無基質(zhì)空白中添加4個不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，加標(biāo)回收率均>90%，不同濃度的空白加標(biāo)樣品中甲醛δ13C值標(biāo)準(zhǔn)偏差<0.5‰，甲醛含量對穩(wěn)定碳同位素測試的影響較小。外源性甲醛標(biāo)準(zhǔn)品的δ13C值比龍頭魚偏正，向龍頭魚中添加外源甲醛會使龍頭魚樣品中甲醛的δ13C值偏正，且添加量越大，δ13C值偏正越多。

各樣品甲醛含量測量值RSD均<10%圖6 果蔬中甲醛含量示意圖Figure 6 Schematic diagram of formaldehyde mass fraction in fruits and vegetables

表4 龍頭魚中外源性甲醛加標(biāo)模擬試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Simulation test results of exogenous formaldehyde in dragon fish

2.5.2 甲醛來源定量解析模型適用性分析 分別在龍頭魚樣品中加入3個濃度水平的外源性甲醛，其外源性甲醛貢獻(xiàn)率的理論值、測定值和由式(4)計算得到的計算值如圖7所示。由圖7可知，通過測定濃度得到的外源甲醛貢獻(xiàn)率測定值和理論值差異較小，由定量解析模型分析計算得到的人為添加外源甲醛貢獻(xiàn)率計算值比理論貢獻(xiàn)率偏大，甲醛添加量較低時，計算值與理論值偏差較大；甲醛添加量較高時，計算值與理論值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<15%?？傮w而言，通過甲醛來源定量分析模型來分析單一的外源性甲醛添加貢獻(xiàn)是可行的，但是如果實(shí)際樣品中外源性甲醛來源有多種，單純的定量分析模型難以對不同來源的甲醛進(jìn)行準(zhǔn)確的定量計算，還需綜合分析各來源甲醛的穩(wěn)定碳同位素特征。

圖7 外源性甲醛貢獻(xiàn)率示意圖Figure 7 Schematic diagram of exogenous formaldehyde contribution rate

3 結(jié)論

衍生化—?dú)庀嗌V—燃燒—同位素比質(zhì)譜法間接測定食品中甲醛的方法是可行的。水產(chǎn)品中甲醛含量為龍頭魚>魷魚>淡水魚，淡水魚中甲醛未檢出，其含量差異可能與水產(chǎn)品中氧化三甲胺酶存在與否和濃度高低有關(guān)，龍頭魚和魷魚中甲醛的δ13C值均在貯藏30 d后越來越負(fù)。蔬菜制品中干香菇中甲醛含量較高，其δ13C值隨貯藏時間的延長逐漸偏正，與水產(chǎn)品相反。這與香菇和水產(chǎn)品中不同的反應(yīng)基質(zhì)和酶有關(guān)，香菇中的酶促反應(yīng)可能更傾向于將偏正的13C原子轉(zhuǎn)化為甲醛。新鮮果蔬食品中甲醛含量較低，鮮香菇的甲醛含量較高，但遠(yuǎn)低于干香菇，鮮、干香菇的含量差異可能與水分含量、貯藏條件和時間有關(guān)。甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲醛的δ13C值比龍頭魚偏正，因此向龍頭魚中添加甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液會使其δ13C值偏正，不同加標(biāo)水平下測得的甲醛δ13C值及其貢獻(xiàn)率符合甲醛來源定量分析模型，該模型可用于單一來源外源添加甲醛的食品中貢獻(xiàn)率的分析計算。若外源性甲醛途徑較多，則需結(jié)合多種來源甲醛的穩(wěn)定碳同位素特征進(jìn)行綜合分析。后期需要建立食品中不同來源甲醛穩(wěn)定碳同位素組成特征數(shù)據(jù)庫，為食品中甲醛來源甄別解析提供科學(xué)依據(jù)。