他汀基團(tuán)修飾的新型自組裝短肽對ox-LDL誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng)及分子機制

龔劍萍 朱凌波 羅忠禮 倪市毛 季寧寧 龔心琰

動脈粥樣硬化是心腦血管疾病發(fā)生的重要病理、生理基礎(chǔ)[1-2]，而氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[3-4]，該分子能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損傷，使得脂質(zhì)成分、炎癥細(xì)胞在損傷局部區(qū)域浸潤并逐步形成粥樣斑塊。因此，減輕ox-LDL引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是目前公認(rèn)的動脈粥樣硬化干預(yù)靶點[5-6]。新型自組裝短肽（self-assembling peptide，SAP）是一種新興的多功能生物材料，可通過形成三維結(jié)構(gòu)，在炎性細(xì)胞的黏附、遷移及血管形成等生理、病理過程中發(fā)揮重要作用[7]。他汀類藥物（3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑）是目前臨床上最有效的降脂藥物之一，能抑制動脈粥樣硬化與血栓形成[8-9]。相較于傳統(tǒng)的他汀類藥物，他汀類藥物基團(tuán)修飾的新型自組裝短肽（statins self-assembling peptide，statins-SAP）對ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷保護(hù)作用的效能是否存在差異以及其分子作用機制如何，目前鮮有報道。因此，本研究通過體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC），以探討statins-SAP對ox-LDL誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng)及分子機制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑HUVEC細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心（國家實驗細(xì)胞資源共享平臺）。statins-SAP由重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院羅忠禮課題組合成。ox-LDL（批號：20605ES05）、Annexin V-Alexa Fluor 488/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號：40305ES20）、Mouse二抗抗體（批號：33201ES60）均購自上海翊圣生物科技有限公司。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）/Notch信號通路抑制劑LY450139（美國化學(xué)文摘服務(wù)社編號：425386-60-3）購自美國MCE公司。細(xì)胞計數(shù)試劑（cell counting kit-8，CCK-8；批號：C0043）、TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TdT mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）試劑盒（批號：C1090）均購自Beyotime生物技術(shù)有限公司。B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2；批號：ab32124）、血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2；批號：ab237634）、Bax（批號：ab32503）、Notch1的一抗抗體（批號：ab52627）均購自英國Abcam公司，洛伐他汀原料藥（美國化學(xué)文摘服務(wù)社編號：1370600）、β-肌動蛋白（β-actin）的一抗抗體（批號：A5441）均購自美國Sigma公司。Bcl-2、VEGF、VEGFR-2、Bax、Notch1、DLL4引物由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱為Thermo-Fisher Forma 311；共聚焦顯微鏡（型號：Zeiss LSM 880）購自德國蔡司公司；光學(xué)顯微鏡（型號：DM il）購自上海Leica公司；流式細(xì)胞儀（型號：FACS CaliburⅢ）購自美國BD Falcon公司；多功能酶標(biāo)儀（型號：Synergy LX）購自美國Bio-Tek公司；蛋白質(zhì)印跡電泳系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號：e-Blot 100）購自德國易勃特生物科技有限公司；超微量分光光度計（型號：Nan-oDrop-One）購自美國Thermo公司；聚核酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀（型號：Life ECO）購自杭州博日公司；實時熒光定量聚核酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）儀（型號：ABI7500）購自美國ABI公司。

表1 各基因引物序列

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理HUVEC傳代、擴增得到足夠數(shù)量的細(xì)胞后分為5組，并給予相應(yīng)的處理：（1）對照組用含磷酸鹽緩沖液的DMEM完全培養(yǎng)基（含ox-LDL、statins-SAP及Notch信號通路的阻斷劑）培養(yǎng)；（2）ox-LDL組用含200 mg/L ox-LDL的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；（3）洛伐他汀組用含200 mg/L ox-LDL+10 mg/L洛伐他汀原料藥的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；（4）statins-SAP組用含200 mg/L ox-LDL+150 mg/L statins-SAP的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；（5）信號通路組用含200 mg/L ox-LDL+150 mg/L statins-SAP+25 μmol/L LY450139的DMEM完全培養(yǎng)基處理。經(jīng)預(yù)實驗顯示，各實驗組處理48 h時各表型均較為顯著。

1.2.2 細(xì)胞活力檢測HUVEC接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，8 h后鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況；加入ox-LDL、statins-SAP、洛伐他汀原料藥、LY450139等試劑后，分別于0、24、36、48、72 h加入CCK-8（10 μL/孔）；然后置于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h；使用多功能酶標(biāo)儀上測定波長450 nm處的吸光度（OD450）值，減去空白孔（僅加入DMEM和CCK-8）的OD450值，繪制各時間點不同處理組OD450值變化曲線圖。

1.2.3 細(xì)胞遷移能力檢測采用劃痕法。HUVEC接種、貼壁且融合度約為95%后開始劃痕，在劃痕兩側(cè)劃線標(biāo)記細(xì)胞遷移起始位置。加入ox-LDL、statins-SAP、洛伐他汀原料藥等試劑處理48 h后行結(jié)晶紫染色。4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞20 min，加入結(jié)晶紫染色液（400 μL/孔）孵育3 min，ddH2O洗滌，找到劃痕起始線的位置，使用顯微鏡自帶的成像系統(tǒng)開始拍攝。每孔隨機選擇3個視野，每組選擇3個培養(yǎng)孔，按照片標(biāo)尺與劃痕起始線計算遷移距離。

1.2.4 細(xì)胞凋亡率檢測采用TUNEL法。HUVEC接種、貼壁且融合度為80%后，加入ox-LDL、statins-SAP、LY450139等試劑處理48 h；按TUNEL試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)流程處理各組，加入抗熒光猝滅液進(jìn)行封片，在共聚焦熒光顯微鏡下使用550 nm的激發(fā)光（Cy3激發(fā)波長550 nm，發(fā)射波長570 nm）進(jìn)行觀察，在高倍視野下計數(shù)凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)并拍照留存，計算凋亡率。

1.2.5 蛋白表達(dá)檢測采用蛋白質(zhì)印跡法。HUVEC接種、貼壁且融合度為60%后，加入ox-LDL、statins-SAP、LY450139等試劑處理48 h；加入250 μL含1 mM苯甲基磺酰氟的蛋白裂解液，使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量[稀釋10倍，使用酶標(biāo)儀測定波長562 nm處的吸光度（OD562）值]；配制對應(yīng)濃度的聚丙烯酰胺凝膠（SDS蛋白膠）、蛋白marker和待檢測樣品并點入凝膠內(nèi)，采用70～120 V的恒壓模式進(jìn)行電泳，待目的條帶電泳至分離膠中間結(jié)束電泳。300 mA恒電流120～160 min進(jìn)行聚偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)印結(jié)束后做好標(biāo)記；加入Bcl-2、VEGFR-2、Bax、Notch1、β-actin一抗；次日回收一抗，加入各自對應(yīng)的二抗；回收二抗，洗膜后每張膜加入混合好的化學(xué)發(fā)光液，在e-Blot成像儀中曝光得到蛋白條帶（壓片式）。使用Image-J軟件掃描各條帶灰度值，根據(jù)灰度值計算蛋白相對表達(dá)量。

1.2.6 基因表達(dá)檢測采用qPCR。HUVEC接種、貼壁且融合度為80%后，加入ox-LDL、statins-SAP、LY450139等試劑處理48 h；Trizol法提取細(xì)胞總RNA，瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。使用超微量分光光度計檢測RNA濃度及A260/A280。確認(rèn)各樣本RNA合格后，依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作流程進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，將得到的cDNA進(jìn)行qPCR。以β-actin為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計算各基因（Bcl-2、VEGF、VEGFR-2、Bax、Notch1、DLL4）相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 20.0和Graph-Pad Prism 8.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采取LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各實驗組細(xì)胞活力比較各實驗組細(xì)胞活力比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與對照組比較，ox-LDL組細(xì)胞活力明顯下降（P＜0.05）；與ox-LDL組比較，洛伐他汀組和statins-SAP組細(xì)胞活力均明顯升高（均P＜0.05），且statins-SAP組高于洛伐他汀組（P＜0.05）；與statins-SAP組比較，信號通路組組細(xì)胞活力明顯下降（P＜0.05）；在48 h時變化較為明顯，見表2。

2.2 各實驗組細(xì)胞遷移能力比較各實驗組細(xì)胞遷移能力比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與對照組比較，ox-LDL組細(xì)胞遷移能力明顯下降（P＜0.05）；與ox-LDL組比較，洛伐他汀組細(xì)胞遷移能力明顯增強（P＜0.05）；與洛伐他汀組比較，statins-SAP組細(xì)胞遷移能力明顯增強（P＜0.05），見圖1。

表2 各實驗組細(xì)胞活力（OD450）比較

圖1 各實驗組細(xì)胞遷移能力比較（ox-LDL為氧化低密度脂蛋白；statins-SAP為他汀類藥物基團(tuán)修飾的新型自組裝短肽；A：細(xì)胞遷移距離比較，與對照組比較，*P＜0.05；與ox-LDL組比較，△P＜0.05；與洛伐他汀組比較，▲P＜0.05；B：48 h時細(xì)胞劃痕恢復(fù)情況，×20）

2.3 各實驗組細(xì)胞凋亡率比較各實驗組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與對照組比較，ox-LDL組細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）；與ox-LDL組比較，statins-SAP組細(xì)胞凋亡率明顯下降（P＜0.05）；與statins-SAP組比較，信號通路組細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.05），見圖2。

圖2 各實驗組細(xì)胞凋亡率比較（ox-LDL為氧化低密度脂蛋白；statins-SAP為他汀類藥物基團(tuán)修飾的新型自組裝短肽；A：細(xì)胞凋亡率比較，與對照組相比，*P＜0.05；與ox-LDL組相比，△P＜0.05；與statins-SAP組相比，▲P＜0.05；B：48 h時細(xì)胞凋亡情況，×20）

2.4 各實驗組細(xì)胞中VEGF/Notch通路基因表達(dá)比較各實驗組細(xì)胞中VEGF/Notch通路基因表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與對照組比較，ox-LDL組細(xì)胞中Bcl-2、VEGF、VEGFR-2基因相對表達(dá)量均明顯降低（均P＜0.05）；與ox-LDL組比較，statins-SAP組細(xì)胞中Bax、Notch1、DLL4基因相對表達(dá)量均明顯升高（均P＜0.05）；與statins-SAP組比較，信號通路組細(xì)胞中Bcl-2、VEGF、VEGFR-2基因相對表達(dá)量均明顯降低（均P＜0.05），見圖3。

圖3 各實驗組細(xì)胞中VEGF/Notch通路基因表達(dá)比較（ox-LDL為氧化低密度脂蛋白；statins-SAP為他汀類藥物基團(tuán)修飾的新型自組裝短肽；Bcl-2為B淋巴細(xì)胞瘤-2；VEGF為血管內(nèi)皮生長因子；VEGFR-2為血管內(nèi)皮生長因子受體2；與對照組比較，*P＜0.05；與ox-LDL組比較，△P＜0.05；與statins-SAP組比較，▲P＜0.05）

2.5 各實驗組細(xì)胞中凋亡基因蛋白表達(dá)比較各實驗組細(xì)胞中凋亡基因蛋白表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與對照組比較，ox-LDL組細(xì)胞中Bax、Notch1的蛋白相對表達(dá)量均明顯降低（均P＜0.05），Bcl-2、VEGFR-2的蛋白相對表達(dá)量均明顯升高（均P＜0.05）；與ox-LDL組比較，statins-SAP組細(xì)胞中Bcl-2、VEGFR-2的蛋白相對表達(dá)量均明顯升高（均P＜0.05），Bax、Notch1的蛋白相對表達(dá)量均明顯降低（均P＜0.05）；與statins-SAP組比較，信號通路組細(xì)胞中Bax、Notch1的蛋白相對表達(dá)量均明顯降低（均P＜0.05），Bcl-2、VEGFR-2的蛋白相對表達(dá)量均明顯升高（均P＜0.05），見圖4。

圖4 各實驗組細(xì)胞中凋亡基因蛋白表達(dá)比較（ox-LDL為氧化低密度脂蛋白；statins-SAP為他汀類藥物基團(tuán)修飾的新型自組裝短肽；Bcl-2為B淋巴細(xì)胞瘤-2；VEGFR-2為血管內(nèi)皮生長因子受體2；與對照組比較，*P＜0.05；與ox-LDL組比較，△P＜0.05；與statins-SAP組比較，▲P＜0.05）

3 討論

動脈粥樣硬化可由ox-LDL刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞引起內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致?lián)p傷局部伴隨炎癥細(xì)胞浸潤、大量脂質(zhì)沉積，逐步形成粥樣斑塊[4-5]。因此，減輕ox-LDL引起的血管內(nèi)皮損傷對防治動脈粥樣硬化具有重要的意義。SAP具有良好的生物相容性、生物活性，易于修飾改造[10-11]，能夠通過非共價鍵相互作用形成功能性納米結(jié)構(gòu)，具有較好的藥物負(fù)載能力和環(huán)境響應(yīng)性，目前被廣泛用于藥物的精確遞送[12]。他汀類藥物能通過降低血脂水平起到有效治療動脈粥樣硬化性血管病的作用，但是分子結(jié)構(gòu)和理化特性對其在抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡等方面的作用造成了一定的局限性[8-9]。因此，可以將他汀類藥物基團(tuán)修飾在SAP上，借助SAP充分發(fā)揮藥物優(yōu)勢。為了明確statins-SAP在ox-LDL誘導(dǎo)血管內(nèi)皮損傷中的作用，本實驗以ox-LDL刺激的HUVEC作為體外實驗?zāi)Ｐ?，通過檢測細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移能力發(fā)現(xiàn)HUVEC在受ox-LDL刺激后，細(xì)胞活力和細(xì)胞遷移能力均明顯下降，說明ox-LDL能夠誘導(dǎo)HUVEC發(fā)生損傷。在ox-LDL作用的基礎(chǔ)上，筆者給予他汀類藥物和statins-SAP進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)與洛伐他汀組比較，statins-SAP在細(xì)胞活力及遷移能力方面顯示出更好的保護(hù)效應(yīng)，其逆轉(zhuǎn)ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷更顯著。

研究證實，VEGF是一種能在血管損傷和再生過程中發(fā)揮作用的生長因子[13-14]，主要通過VEGFR發(fā)揮作用；還可以介導(dǎo)Notch1/DLL4信號來促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分化為頂端細(xì)胞[15-17]，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、黏附及微血管網(wǎng)絡(luò)的生成[18]；還可以調(diào)控某些信號通路，如通過VEGF/Notch1信號通路來抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[19]。VEGF/Notch1信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、生長、增殖的重要信號通路，多種生長因子能夠刺激VEGF/Notch1信號通路中的Bax、Bcl-2發(fā)生磷酸化和甲基化，然后通過細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)信號的傳導(dǎo)使Bcl-2等抗凋亡基因表達(dá)增多，Bax等促凋亡基因表達(dá)減少，最終促進(jìn)細(xì)胞生長[20]。本實驗結(jié)果顯示，ox-LDL刺激后的HUVEC中Bax、Notch1表達(dá)明顯降低，而statins-SAP干預(yù)后，細(xì)胞中Bax、Notch1表達(dá)明顯升高，說明ox-LDL能夠抑制HUVEC中的VEGF/Notch1信號通路，而statins-SAP能激活該通路，這可能是statins-SAP發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用的機制與作用途徑。為了驗證這一設(shè)想，本實驗使用VEGF/Notch1信號通路抑制劑LY450139與statins-SAP聯(lián)合作用于HUVEC，結(jié)果顯示statins-SAP能增強細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡率，削弱調(diào)節(jié)基因表達(dá)的效應(yīng)，說明VEGF/Notch1信號通路的激活可介導(dǎo)statins-SAP減輕ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

綜上所述，statins-SAP通過激活VEGF/Notch信號通路減輕ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其作用效果較他汀類藥物單獨作用更顯著。今后可以進(jìn)一步開展體內(nèi)實驗來驗證statins-SAP對血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)及對動脈粥樣硬化的預(yù)防或延緩作用，有望為動脈粥樣硬化的臨床治療提供新的思路。