側柏葉、何首烏復合提取物防脫發(fā)功效研究

馬世宏，單承鶯，聶韡，束成杰

(南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 211110)

脫發(fā)是一種常見現象，分為生理性脫發(fā)和病理性脫發(fā)兩種。生理性脫發(fā)指頭發(fā)正常的脫落，而病理性脫發(fā)則是一種常見的毛發(fā)疾病。據不完全統(tǒng)計，目前中國約有2.5億脫發(fā)人群，其中男女比例約為3∶2，且脫發(fā)群體的年輕化趨勢越發(fā)明顯[1]。脫發(fā)雖不屬于嚴重疾病，但對人們的精神狀態(tài)和心理健康會產生較大的影響。雄激素源脫發(fā)(Androgenetic Alopecia，AGA)是脫發(fā)常見的誘因之一，以頭皮油膩、瘙癢、頭屑增多、脫發(fā)等為主要表現，男女均會發(fā)生；其發(fā)病機制與雄激素分泌、遺傳以及精神緊張、疲勞、熬夜等不良生活習慣有關，其中雄激素為主要誘因[2]。頭部毛發(fā)生長嚴格地受雄激素的影響，雄性激素中的睪酮在毛囊處經5α-還原酶催化，變成活性更高的5α-二氫睪酮(DHT)，并且這種變化是不可逆的。DHT是引起脫發(fā)的重要原因，它能與毛囊細胞內特定受體蛋白結合，將特定基因活化，誘導生成特定蛋白質，從而阻礙毛發(fā)生長，進而產生永久性脫發(fā)[3]。

側柏葉是柏科植物側柏(Platycladusorientalis(L.) Franco)的干燥嫩枝葉，作為一味常見中藥可用于治療脫發(fā)?！吨腥A本草》中有記載，用側柏葉乙醇提取物涂擦毛發(fā)脫落部位，治療160例，總有效率達77.5%[4]。這類傳統(tǒng)中醫(yī)藥方或偏方中，一般采用外部涂抹等手段，通過促進頭皮部位血液微循環(huán)，增加細胞養(yǎng)分、刺激毛囊生長等手段，達到治療脫發(fā)的作用。近年來，已有不少相關報道以側柏葉及其他藥材作為復方制劑在治療脫發(fā)方面的研究[5-7]，但對于其作用機理仍然少有報道。

何首烏為蓼科植物何首烏(PolygonummultiflorumThunb.)的干燥塊根，自古有“烏須發(fā)”的功效，歷來為治療白發(fā)與脫發(fā)的重要藥物。載自《積善堂方》的七寶美髯丹即含有何首烏[8]。有學者研究發(fā)現首烏生發(fā)丸治療白發(fā)與脫發(fā)的療效優(yōu)于101章光生發(fā)液，并且無明顯毒副作用[9]。有報道以首烏生發(fā)顆粒治療斑禿、脂溢性脫發(fā)患者，總有效率97.6%，明顯優(yōu)于同類臨床常用中成藥[10]。何紅梅等[11]研究指出何首烏提取物能誘導C57BL /6J 小鼠毛發(fā)生長，使毛囊細胞從休止期進入生長期，從而加速毛發(fā)生長。Zheng等[12]研究發(fā)現何首烏提取液能夠明顯促進體外培養(yǎng)的頭皮毛囊細胞的生長。

本文以側柏葉、何首烏為主要原料，參考傳統(tǒng)藥方制備其復合提取物，利用體外和體內試驗方法，對其防脫發(fā)功效進行評估并闡明其可能的作用機制，為后續(xù)開發(fā)含有側柏葉、何首烏成分的防脫生發(fā)個人護理產品提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL /6J 雄性小鼠(18-23 g)，SD雄性大鼠(250-300 g)，均為SPF 級，由上海杰思捷實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SYXK(滬)2017-0003。試驗動物由本單位動物實驗室飼養(yǎng)，飼喂常規(guī)飼料及飲用水，5～7 d待小鼠適應后，開始試驗操作。

側柏葉、何首烏生藥材(南京先聲藥業(yè)有限公司)；米諾地爾搽劑(有效成分含量2%，四川美大康華康藥業(yè)有限公司)；非那雄胺片(杭州默沙東制藥有限公司)；睪酮、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(美國Sigma公司)；NADPH、丙基羥苯酸酯、甲醇(色譜純)、二氯甲烷(色譜純)(國藥集團化學試劑有限公司)；丙酸睪酮注射液(寧波第二激素廠)；注射用大豆油(鐵嶺北亞藥用油有限公司)；小鼠睪酮酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、小鼠雌二醇酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(南京生物工程研究所)。

紫外分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；冷凍低溫離心機(美國Thermo Fisher公司)；高效液相色譜儀(美國安捷倫Agilen公司)；酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；旋轉蒸發(fā)儀(北京大龍RE100-Pro)。

1.2 試驗方法

1.2.1 側柏葉、何首烏復合提取物的制備

取干燥的側柏葉、何首烏藥材，粉碎，過20目篩，按質量比1∶1分別準確稱取100 g，按照1∶15的料液比加入3000 g 濃度為50%(V/V)的乙醇溶液，加熱回流提取3～4 h，趁熱過濾，將收集的濾液用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至浸膏狀，干燥稱重，得76.44 g 復合提取物；將此提取物復溶于去離子水，配置成質量濃度200 mg/mL 的溶液，離心后取上清液經膜過濾，即得側柏葉、何首烏復合提取物受試液母液，冷藏備用。

1.2.2 清除DPPH自由基試驗

將DPPH配制成0.2 mmol /L溶液(即配即用)，然后吸取250 μL受試溶液于eppendorf管中，加入750 μL DPPH溶液，于室溫下黑暗處反應，時間分別設定為30 min、60 min，于517 nm處測定光吸收值(A值)，n=3。

DPPH自由基清除率=1-(A樣品-A空白)/A對照×100%

1.2.3 體外5α-還原酶抑制試驗[13]

5α-還原酶的制備：取SD雄性大鼠6只，禁食12 h后處死，于低溫解剖臺上取出大鼠前列腺，剪碎并稱重。按質量比1∶5的比例加入提前預冷的緩沖液(含0.32 mol/L蔗糖、0.1 mmol/L 二硫蘇糖醇、1 mmol/L乙二胺四乙酸和0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液)，于勻漿器中快速制成勻漿，使用冷凍離心機離心(13000 r/min，10 min)，取離心后上清液(須棄去最上層脂肪層)，加入緩沖液定容至20 mL，分裝至eppendorf管中，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

5α-還原酶活性測定：依次加入0.5 mL磷酸鹽緩沖液、0.2 mL受試溶液、200 μL睪酮溶液(300 mg/L)和200 μL NADPH溶液(0.8 g/L)于具塞試管中，最后加入0.5 mL 5α-還原酶提取物，于37℃下反應30 min；反應結束后加入3 mL二氯甲烷停止反應并萃取睪酮，再加入0.25 mL丙基羥苯酸酯(100 mg/L)作為內標，離心(5000 r/min，10 min)。棄去上層水相，移取約1 mL有機相，蒸干，將殘留物溶于1.5 mL甲醇中，吸取10 μL用高效液相法測定殘留睪酮含量。陽性對照為0.05 mg/L非那雄胺組，同時設定5α-還原酶反應管和5α-還原酶空白管。

5α-還原酶抑制率=(R樣品-R反應)/(R空白-R反應)×100%

式中，R為目標峰面積與內標峰面積之比。

1.2.4 小鼠防脫發(fā)試驗

1.2.4.1 動物造模及分組給藥[14]

按照試驗設計，將60只C57BL /6J小鼠隨機分為6組，分別為正常組、模型組、陽性組以及復合提取物高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組各10只。試驗前將丙酸睪酮注射液和注射用大豆油按1∶5(V/V)進行稀釋，配制成濃度為5 g /L的丙酸睪酮溶液備用；正常組小鼠在身體背部皮下注射注射用大豆油，每日1次；其余各組在小鼠身體背部皮下均注射丙酸睪酮溶液造模，劑量為5 mg /(kg·d)。造模同時各組小鼠背部毛發(fā)區(qū)給予相應受試液涂抹：陽性組給予米諾地爾搽劑0.3 mL涂抹；復合提取物高、中、低劑量組給予質量濃度40、100 、200 mg/mL的復合提取物溶液0.3 mL涂抹；正常組及模型組給予0.3 mL蒸餾水涂抹，注射丙酸睪酮溶液和涂抹給藥須連續(xù)進行10 w。

1.2.4.2 觀察指標及測定結果

小鼠狀態(tài)及脫發(fā)情況觀察：觀察各時間段各組小鼠的常規(guī)狀態(tài)。從第5 w開始至試驗結束，每天收集各組小鼠脫落毛發(fā)；在固定時間段用相同篦子梳理每只小鼠背部的毛發(fā)，脫落的毛發(fā)用鑷子收集并稱重，用于小鼠脫發(fā)程度的考察。

小鼠血清中睪酮、雌二醇的測定：試驗10 W后，所有受試小鼠眼眶后取血， 4℃下離心(13000 r/min，10 min)，獲取血清后分裝，置于-80℃冰箱備用。使用ELISA試劑盒測定小鼠血清中睪酮、雌二醇含量(按試劑盒要求操作)。

所有試驗數據均采用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，每兩組間數據比較采用t檢驗，P<0. 05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與討論

2.1 抗氧化測試

將側柏葉、何首烏復合提取物母液，按照質量濃度梯度配置為4、20、40、100、200 mg/mL的受試液，DPPH自由基清除結果見圖1。由圖1可以看出，受試液在反應維持30 min和60 min 時，均具有明顯的自由基清除率，且效果隨受試液濃度增加而增加，呈現出明顯劑量效應關系；同一質量濃度下，反應60 min 時清除效果優(yōu)于30 min。

有研究表明側柏葉提取物、何首烏提取物都具有一定的抗氧化能力[3,7]。本研究在 DPPH 自由基清除試驗中，側柏葉、何首烏復合提取液也顯示出較強的抗氧化能力，并且兩者之間可能產生了一定的協(xié)同增效作用。生發(fā)與脫發(fā)過程是頭皮細胞被氧化與抗氧化程度動態(tài)平衡的結果，一方面，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)有促進毛囊細胞增殖的作用[15]；另一方面，氧化應激反應又被認為是導致心理性脫發(fā)的主要原因之一[16]。DPPH自由基清除率是一種被廣泛認可的物質抗氧化能力的評價指標。本試驗結果顯示側柏葉、何首烏復合提取物在不同作用時長下，DPPH的清除率均隨溶液質量濃度增加而升高，表明該復合提取物具有較好的抗氧化能力。

圖1 不同質量濃度受試液對 DPPH 自由基清除率Fig.1 DPPH scavenge of samples with different concentration

2.2 對5α-還原酶的抑制作用

將側柏葉、何首烏復合提取物母液按照質量濃度梯度配置為4、20、40、100 mg/mL的受試液。試驗結果表明，不同質量濃度的受試液對5α-還原酶活性均表現出一定的抑制作用，且具有出明顯的劑量效應關系，隨受試液質量濃度升高其抑制率也隨之升高。在100 mg/mL質量濃度下，抑制率達到52.74%，陽性對照非那雄胺(0.05 mg/L)表現出極高的抑制率(91.47%)，因為非那雄胺是一種公認的5α-還原酶的競爭型抑制劑。結果見圖2。

圖2 樣品對 5α-還原酶的抑制效果Fig. 2 Inhibition of 5α-reductase activity

有相關研究表明，現有脫發(fā)人群中約九成屬于雄激素源性脫發(fā)。陽性對照藥物非那雄胺為一種甾體類固醇，其作為II型5α-還原酶抑制劑可以有效抑制血液循環(huán)，抑制頭部皮膚毛囊內睪酮向二氫睪酮轉換這一過程，從而達到治療脫發(fā)的目的，是目前國內外治療雄激素源脫發(fā)的一線用藥[2,7]。

體外試驗結果表明，受試液樣品在4、20、40、100 mg/mL質量濃度下對5α-還原酶活性均具有抑制作用，抑制率分別為6.86%、14.39%、22.51%和52.74%。雖然效果不如陽性對照非那雄胺顯著，但在100 mg/mL質量濃度下抑制率也能超過50%，可推測本受試液在體外也具有抑制雄性激素脫發(fā)的作用。

2.3 小鼠防脫發(fā)試驗

2.3.1 一般狀態(tài)觀察

造模組小鼠注射丙酸睪酮溶液后，有些小鼠出現躁動現象并互相廝打。2 w后，小鼠毛發(fā)順滑程度下降；4～5 w后，小鼠背部毛發(fā)逐漸干枯失去光澤，7 w左右小鼠逐漸出現背部毛發(fā)脫落現象。側柏葉、何首烏復合提取物溶液高、中劑量組比模型組脫落現象有改善，尤以高劑量組較為明顯。各組小鼠毛發(fā)脫落情況比較見圖3及表1。

圖3 各組小鼠實驗照片Fig. 3 Mice anti-hair loss experiment photos注：a-正常組，b-模型組，c-陽性組，d-低劑量組，e-中劑量組，f-高劑量組

2.3.2 血清睪酮、雌二醇

測定結果見表2。

表1 小鼠脫毛重量

表2 小鼠血清 T、E2 含量

雄激素在毛發(fā)生長過程中起到重要作用，能夠促進毛發(fā)由新生狀態(tài)向成熟狀態(tài)轉化。已有研究指出，雄激素如果異常增多，會導致 T /E2 比例失調，從而導致雄激素源性脫發(fā)(AGA )疾病的發(fā)生[17]。通過本試驗研究，發(fā)現該復合提取物可降低體內睪酮含量，這與其具有抑制5α-還原酶活性也符合，提示了其可能的作用機理，進而推測該復合提取物應用于人體也具有防脫作用。

AGA發(fā)病率較高且發(fā)病機制仍未完全明確，本試驗采用的AGA鼠類模型，是目前較受認可的一個動物模型，具有較明顯的優(yōu)勢。其一，該造模過程與AGA的病理生化改變過程相似。其二，小鼠基因組與人類高度接近，毛發(fā)生長變化周期與人類也相似[18]；其三，C57BL/6J 小鼠毛發(fā)黑色，其顏色變化有利于判斷毛發(fā)的生長狀態(tài)，為動物實驗最常用的小鼠品系之一[19]。本試驗采用這種小鼠模型，結果表明側柏葉、何首烏復合提取物能明顯改善小鼠的脫發(fā)現象。

本團隊的早期試驗結果表明側柏葉醇提物和揮發(fā)油可以適當延緩脫毛，對小鼠化療性毛囊損傷具有一定的保護作用并能有效改善其脫發(fā)現象[5]；還有相關研究則表明側柏葉醇提物對防治脂溢性脫發(fā)也具有一定的效果[20]，而本試驗結果則表明側柏葉、何首烏復合醇提取物具有明顯的5α-還原酶抑制活性，能顯著改善小鼠雄激素源性脫發(fā)。

3 結 論

本文采用體外和體內試驗對側柏葉、何首烏復合醇提取物的防脫發(fā)功效進行評價，試驗證明了該復合提取物具有清除DPPH自由基從而起到抗氧化的作用；在體外具有抑制5α-還原酶活性，且AGA小鼠模型試驗表明其可以顯著改善 C57BL/6小鼠雄激素源性脫發(fā)現象。

采用中國傳統(tǒng)藥用植物治療脫發(fā)具有全面兼顧、副作用小、消費者接受程度高等優(yōu)勢；本試驗通過體外和體內試驗結果充分證明了側柏葉、何首烏復合醇提取物具有明確的防治雄激素源性脫發(fā)功效，且提示了其發(fā)揮作用的可能機理與抑制5α-還原酶活性有關。該提取物可應用于研發(fā)更安全更有效的防脫生發(fā)相關個人護理類日化產品，具有廣闊的市場前景。