優(yōu)化CD115穩(wěn)定性因素以精確檢測(cè)小鼠單核細(xì)胞及其亞群

劉怡寧, 宋濬哲, 蔣曉, 陳超, 周圓, 邢文

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所)，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300020

單核細(xì)胞(monocyte)在抵御病原微生物入侵和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在傷口愈合以及肝臟、肺臟、腎臟等組織器官纖維化過程中，單核細(xì)胞及其分化而來的巨噬細(xì)胞或纖維細(xì)胞發(fā)揮關(guān)鍵作用[2-5]；其在骨髓纖維化過程中的作用也屢有報(bào)道[6-8]。此外，在血液系統(tǒng)疾病如真性紅細(xì)胞增多癥中，除了紅細(xì)胞和血小板明顯增多外，單核細(xì)胞增多也時(shí)有發(fā)生[9]。因此，利用新方法或新技術(shù)對(duì)單核細(xì)胞進(jìn)行深入研究，不僅可以進(jìn)一步揭示其在基礎(chǔ)免疫和微生物學(xué)中的作用，也可進(jìn)一步闡明其在某些疾病發(fā)生和轉(zhuǎn)歸中的作用。

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)是當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)之一。通過熒光標(biāo)記的特異性抗體與抗原結(jié)合，可快速測(cè)定單個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)特性，并從群體中分類和收集特定細(xì)胞，因此，F(xiàn)CM在細(xì)胞生物學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)等研究中應(yīng)用廣泛[10]。小鼠是研究人類疾病的重要模式動(dòng)物，但是小鼠與人單核細(xì)胞特異性標(biāo)志并不完全相同。人單核細(xì)胞主要根據(jù)CD14和CD16的表達(dá)情況進(jìn)行分類；而小鼠單核細(xì)胞則主要是CD11b和CD115雙陽性細(xì)胞[11]。CD115是集落刺激因子1[colony-stimulating factor-1，CSF-1；又稱巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)]受體，主要表達(dá)在單核/巨噬細(xì)胞和部分樹突狀細(xì)胞及其前體細(xì)胞表面。M-CSF作用于CD115，在巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生、分化和發(fā)揮功能等方面具有重要作用[12]。然而，在標(biāo)本處理過程中，CD115常因各種原因丟失或內(nèi)化[11,13]，進(jìn)而影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性[14]。

為了提高小鼠單核細(xì)胞特異性抗原CD115的穩(wěn)定性，確保流式檢測(cè)小鼠單核細(xì)胞及其亞群比例的準(zhǔn)確，首先對(duì)溫度、時(shí)間和固定因素對(duì)CD115的穩(wěn)定性影響進(jìn)行了詳細(xì)研究。由于小鼠外周血比較容易獲取，且無需處死小鼠，所以以此進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。在此優(yōu)化方法基礎(chǔ)上，通過結(jié)合流式抗體CD11c、CD49b、Ly6G、Ter119、CD3e和 B220等去除小鼠骨髓及外周血中樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞、粒細(xì)胞、不成熟的紅細(xì)胞、T和B等細(xì)胞[15-18]，并使用Ly6C對(duì)單核細(xì)胞不同亞群進(jìn)行區(qū)分，以期更加精準(zhǔn)地分析小鼠單核細(xì)胞及其亞群，了解其比例隨疾病發(fā)生、發(fā)展的動(dòng)態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)別C57BL6小鼠，2月齡，性別不限，均來自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)本單位倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS；以色列Biological Industries公司)；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS；北京索萊寶科技有限公司)；ACK紅細(xì)胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司)；PBE[含2 μmol·L-1乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraethylene acid，EDTA；賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)的PBS]；FPBE[含2% FBS(以色列Biological Industries公司)的PBE)]；4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，美國(guó)Sigma公司)；流式抗體(均為大鼠來源的抗小鼠抗體，美國(guó)eBioscience公司)包括：CD11b-FITC、CD115-APC、Ly6C-PerCP以及APC e-Fluor780標(biāo)記的Lineage(Lin)抗體：CD11c、CD49b、Ly6G、Ter119、CD3e和B220。

1.3 主要儀器及器材

流式細(xì)胞儀 BD FACS Canto Ⅱ(美國(guó)Becton Dickinson公司)；小型低溫離心機(jī)(美國(guó)Eppendorf公司)；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板(美國(guó)Drew Scientific公司)。

1.4 小鼠外周血單細(xì)胞懸液的制備

固定小鼠，用毛細(xì)吸管取尾靜脈血30 μL，置于1 mL PBE中，混勻。1 500 r·min-1，4 ℃離心5 min，棄上清。向細(xì)胞沉淀中加入3 mL ACK紅細(xì)胞裂解液并再次混勻，冰上裂解8 min。再次離心，細(xì)胞沉淀用3 mL PBS 洗滌，最后用100目的尼龍膜過濾除去細(xì)胞團(tuán)塊。

1.5 溫度、放置時(shí)間和固定等因素對(duì)CD115穩(wěn)定性的影響

1.5.1溫度和放置時(shí)間對(duì)CD115與抗體結(jié)合前穩(wěn)定性的影響 取小鼠外周血，分12份至EP管中(冰上放置)。取2份立即制備單細(xì)胞懸液(方法見1.4)，其中1份作為陰性對(duì)照；另1份加入CD11b和CD115抗體，檢測(cè)其雙陽性細(xì)胞比例，作為本次實(shí)驗(yàn)的初始值。將剩余10份外周血，繼續(xù)分為冰上和室溫2組，分別放置0.25、0.5、1、2和6 h后，制備單細(xì)胞懸液；離心，棄上清，先加50 μL FPBE至各管中，混勻；再加入CD11b和CD115抗體各1 μL?；靹蚝?，4 ℃孵育30 min。單陽管中只加1種抗體；陰性對(duì)照管則不加任何抗體。上機(jī)檢測(cè)前用PBS洗滌，離心棄上清。最后加入400 μL PBE重懸細(xì)胞，并加入1 mg·mL-1的DAPI，用以標(biāo)記死細(xì)胞。上述過程均應(yīng)控制溫度，全程冰上操作。

流式檢測(cè)時(shí)，使用陰性管和單陽管調(diào)節(jié)各熒光通道的電壓和補(bǔ)償后，先通過前向角和側(cè)向角圈出有核細(xì)胞群、去除黏連細(xì)胞；接著圈出DAPI陰性的活細(xì)胞群和Lin陰性細(xì)胞群；檢測(cè)CD11b和CD115雙陽性細(xì)胞比例變化。

1.5.2溫度和放置時(shí)間對(duì)CD115與抗體結(jié)合后穩(wěn)定性的影響 取小鼠尾靜脈血5份，制備單細(xì)胞懸液(冰上放置，方法見1.4)。1份作為陰性對(duì)照；其余4份加入CD11b和CD115抗體進(jìn)行標(biāo)記。然后取1份，立即檢測(cè)其雙陽性細(xì)胞比例，作為本次實(shí)驗(yàn)的初始值；剩余3份樣本分別在冰上、室溫和37 ℃(模擬細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境)，繼續(xù)放置0.5、1、2、4和6 h后，檢測(cè)其雙陽性細(xì)胞比例變化(方法見1.5.1)。

1.5.3PFA固定對(duì)CD115穩(wěn)定性的影響 在室溫和冰上放置2組實(shí)驗(yàn)中，每組各取1份小鼠外周血單細(xì)胞懸液，加入1%的PFA進(jìn)行固定放置不同時(shí)間后，檢測(cè)其雙陽性細(xì)胞比例的變化(方法見1.5.1)。

1.6 優(yōu)化條件下，小鼠流式抗體標(biāo)記方法及單核細(xì)胞分析

首先制備小鼠骨髓及外周血單細(xì)胞懸液。骨髓單細(xì)胞懸液制備方法如下：將小鼠脫頸、處死，放在75%酒精中，浸泡5 min。在無菌條件下分離股骨和脛骨，剪去骨兩端。用5 mL FPBE沖出骨髓，然后用注射器反復(fù)吹吸，將骨髓小粒打散。最后用100目尼龍膜過濾除去細(xì)胞團(tuán)塊。外周血單細(xì)胞懸液制備方法詳見1.4。

取3×106個(gè)骨髓細(xì)胞，置于1.5 mL EP管中；外周血單細(xì)胞則根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶⒓?xì)胞平均分配至相應(yīng)數(shù)量的EP管中。加入Lin抗體各0.5 μL，CD11b、CD115和Ly6C抗體各1 μL?？贵w標(biāo)記及洗抗等操作方法見1.5.1。

流式檢測(cè)方法與1.5.1所述方法基本相同，不過需從DAPI陰性的活細(xì)胞群中圈出Lin陰性細(xì)胞群后，再得到CD11b和CD115雙陽性單核細(xì)胞群；最后根據(jù)Ly6C的表達(dá)情況繼續(xù)將單核細(xì)胞分為不同亞群。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

流式數(shù)據(jù)使用FlowjoV10軟件進(jìn)行分析；流式分析結(jié)果使用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度和放置時(shí)間對(duì)CD115與抗體結(jié)合前穩(wěn)定性的影響

獲取小鼠外周血這一過程時(shí)常在室溫條件下進(jìn)行，標(biāo)本存放溫度和時(shí)間也各不相同。Breslin等[14]發(fā)現(xiàn)，小鼠外周血在4～8 ℃儲(chǔ)存時(shí)，CD115穩(wěn)定性可保持4 h，而在室溫條件下，4 h后即明顯下降。結(jié)果表明，當(dāng)小鼠外周血樣本在冰上放置6 h，其CD11b和CD115雙陽性細(xì)胞的比例，僅從初始值的1.75%下降到1.63%，仍維持在93%以上；若放置時(shí)間延長(zhǎng)至8 h，雙陽性細(xì)胞比例僅維持在初始值的84%(圖1)。而在室溫條件下，其穩(wěn)定性僅僅維持0.5 h；在1 h后即大幅下降，僅剩初始值的57%。這說明，在應(yīng)用流式檢測(cè)小鼠單核細(xì)胞時(shí)，必須將樣本在低溫或冰上儲(chǔ)存，上機(jī)檢測(cè)時(shí)間不超過6 h；而在室溫中超過0.5 h的樣本，其檢測(cè)結(jié)果可能偏低。

A：本次實(shí)驗(yàn)中，小鼠外周血中CD11b+CD115+所占比例的初始值；B：冰上和室溫放置不同時(shí)間，CD11b+CD115+比例變化；C：冰上和室溫放置時(shí)，流式圖顯示各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)CD11b+CD115+比例

2.2 溫度和放置時(shí)間對(duì)CD115與抗體結(jié)合后穩(wěn)定性的影響

對(duì)CD115穩(wěn)定性的影響因素，目前研究主要集中在前期，即CD115與抗體結(jié)合前放置時(shí)間和溫度的影響。研究顯示，CD115抗體能與CD115抗原結(jié)合，除了應(yīng)用于流式檢測(cè)外[19]，還可作為中和抗體，阻止相關(guān)配體結(jié)合。CD115與抗體結(jié)合后，其穩(wěn)定性是否受其他因素影響目前未知。在本研究中，將獲得的小鼠外周血先與抗體結(jié)合(操作在冰上進(jìn)行，大約2 h)，然后在不同溫度下，放置一段時(shí)間，觀察CD11b和CD115雙陽性細(xì)胞比例的變化，結(jié)果如圖2所示。與抗體結(jié)合后，繼續(xù)在冰上放置4 h(加上前期操作的2 h，共計(jì)6 h)，CD11b和CD115雙陽性細(xì)胞的比例并無明顯變化，這與前述結(jié)果類趨勢(shì)一致；相反，在室溫放置0.5 h，其比例即降至50%以下；而在37 ℃放置0.5 h則下降到10%。這說明，溫度升高可降低CD115的穩(wěn)定性；CD115與抗體結(jié)合后，其穩(wěn)定性并沒有變化，在冰上操作時(shí)也可穩(wěn)定6 h。

A：本次實(shí)驗(yàn)中，小鼠外周血中CD11b+CD115+所占比例的初始值；B：冰上、室溫和37 ℃放置不同時(shí)間，CD11b+CD115+比例變化(△：從外周血獲取到標(biāo)抗結(jié)束約2 h)；C：冰上、室溫和37 ℃條件下，流式圖顯示各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)CD11b+CD115+比例

2.3 PFA固定對(duì)CD115穩(wěn)定性的影響

研究顯示，PFA可保存白細(xì)胞抗原，是流式檢測(cè)中常用的固定液[20-21]。為探究PFA固定對(duì)于CD115穩(wěn)定性的影響，本研究對(duì)小鼠外周血樣本用抗體標(biāo)記，再用1% PFA進(jìn)行固定后，對(duì)其CD11b和CD115雙陽性細(xì)胞的比例進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，樣本在4 ℃放置時(shí)，其比例隨時(shí)間變化不明顯，可達(dá)3 d，遠(yuǎn)長(zhǎng)于未固定標(biāo)本的6 h(圖3A)；而在室溫放置時(shí)，其比例在0.5 h即明顯下降，僅為初始值的80%左右，其后仍有緩慢下降(圖3B)。

A：在冰上放置不同時(shí)間，CD11b+CD115+比例變化；B：在室溫放置不同時(shí)間，CD11b+CD115+比例變化(△：從外周血獲取到標(biāo)抗結(jié)束約2 h)

2.4 應(yīng)用組合抗體檢測(cè)小鼠骨髓和外周血中的單核細(xì)胞及其亞群

為進(jìn)一步精確分析小鼠單核細(xì)胞及其亞群，取骨髓和外周血樣本，另外加入Lin抗體和Ly6C抗體，全程冰上操作，6 h內(nèi)進(jìn)行流式上機(jī)檢測(cè)；或使用1% PFA固定，72 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，每個(gè)抗體的單陽管都有明顯的陽性和陰性細(xì)胞，說明其他抗體穩(wěn)定性良好，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]。繼續(xù)分析結(jié)果(圖4)，在骨髓和外周血中，可以看到明顯的Lin-CD11b+CD115+的單核細(xì)胞群；根據(jù)Ly6C信號(hào)強(qiáng)弱，可繼續(xù)將其分為3個(gè)亞群。這也進(jìn)一步說明，優(yōu)化后的方法可以較為準(zhǔn)確地檢測(cè)小鼠單核細(xì)胞及其亞群。

圖4 流式分析小鼠骨髓和外周血中單核細(xì)胞及其亞群

3 討論

單核細(xì)胞作為機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分，在抵御病原微生物入侵和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。單核細(xì)胞數(shù)量發(fā)生改變與機(jī)體炎癥或其他疾病狀態(tài)密切相關(guān)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核細(xì)胞占比變化，有助于揭示單核細(xì)胞在疾病發(fā)生和轉(zhuǎn)歸中的作用。小鼠單核細(xì)胞特異性抗原CD115的穩(wěn)定性較差，在標(biāo)本處理過程中，常因各種原因丟失或內(nèi)化，影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。本研究進(jìn)一步確定了溫度、放置時(shí)間和固定因素對(duì)CD115穩(wěn)定性的影響，并應(yīng)用此優(yōu)化條件，利用抗體組合，更精確地分析小鼠單核細(xì)胞及其亞群，為進(jìn)一步研究單核細(xì)胞生物學(xué)特性及其在疾病中的作用打下基礎(chǔ)。

在應(yīng)用流式檢測(cè)小鼠單核細(xì)胞時(shí)，主要依靠CD11b和CD115 2種細(xì)胞表面標(biāo)志[22]。由于CD115的穩(wěn)定性較差，溫度和放置時(shí)間對(duì)其影響較大，因此實(shí)驗(yàn)操作要求在冰上盡快進(jìn)行[11, 13]。Breslin等[14]發(fā)現(xiàn)，樣本在4～8 ℃和EDTA中存放，其CD115可穩(wěn)定4 h；而在室溫4 h后，其下降幅度則達(dá)33%。本研究發(fā)現(xiàn)，樣本在冰上放置時(shí)，CD115的穩(wěn)定時(shí)間可達(dá)6 h；而在室溫放置1 h后，CD115下降幅度即達(dá)40%。本研究結(jié)果顯示，CD115在冰上可放置更長(zhǎng)時(shí)間，原因可能是冰水溫度在0～4 ℃，略低于Breslin等[14]的樣本儲(chǔ)存溫度；本研究中CD115在室溫中放置時(shí)間則更短，可能與環(huán)境溫度偏高有關(guān)。室溫環(huán)境的一致性難以嚴(yán)格控制，這是本研究的一個(gè)局限因素。該推測(cè)也在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證：當(dāng)溫度達(dá)到37 ℃時(shí)，大部分CD115在0.5 h左右即消失。另外，體外單核細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，常在37 ℃孵箱內(nèi)進(jìn)行，面對(duì)CD115的下降或消失，M-CSF是如何發(fā)揮作用將有待于進(jìn)一步研究。

CD115抗體還可作為中和抗體，阻止相關(guān)配體與CD115的結(jié)合[19]，本研究發(fā)現(xiàn)，在抗體結(jié)合前后，CD115的穩(wěn)定性并沒有發(fā)生明顯變化。至于CD115與抗體結(jié)合后是否引起單核細(xì)胞信號(hào)通路的變化，需要進(jìn)一步研究。流式檢測(cè)樣本可用PFA進(jìn)行固定，從而保存白細(xì)胞抗原[20-21]。與此一致，本研究也發(fā)現(xiàn)，PFA固定可保持CD115抗原抗體的穩(wěn)定性，尤其在4 ℃條件下，其放置時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)3 d。固定后在室溫放置時(shí)，CD11b和CD115雙陽性細(xì)胞明顯下降，則可能與室溫條件下，熒光抗體不穩(wěn)定有關(guān)。

隨著流式技術(shù)的進(jìn)展，通過多種抗體組合，對(duì)某群特定細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)或分析成為可能。本研究利用多種抗體組合，進(jìn)一步對(duì)單核細(xì)胞及其亞群進(jìn)行分析，結(jié)果比較理想。利用該組合，還可分選到更加均一的單核細(xì)胞，進(jìn)行更為深入地研究。

單核細(xì)胞在機(jī)體防護(hù)、免疫及創(chuàng)傷愈合過程中起協(xié)同作用，檢查單核細(xì)胞計(jì)數(shù)是輔助診斷的重要方法之一。單核細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性對(duì)于疾病診斷的作用可見一斑。應(yīng)用本研究所得到的優(yōu)化條件處理樣本，全程冰上操作且6 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，或使用PFA固定等方法均能有效保證流式檢測(cè)單核細(xì)胞比例的準(zhǔn)確性。本研究從小鼠單核細(xì)胞特異性抗原CD115的穩(wěn)定性入手，探究不同因素對(duì)于流式檢測(cè)單核細(xì)胞比例準(zhǔn)確性的影響，為精準(zhǔn)檢測(cè)小鼠單核細(xì)胞提供了技術(shù)支持，也為臨床研究病人單核細(xì)胞生物學(xué)特性提供了新思路。