白小蓮, 愛軍
內(nèi)蒙古師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古自治區(qū)綠色催化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,呼和浩特 010022
近年來,預(yù)防食源性致病菌污染的安全問題已成為當(dāng)今世界性的公共衛(wèi)生熱點(diǎn)??梢l(fā)食源性疾病的微生物種類繁多,其中,沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157∶H7、金黃色葡葡萄球菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌是引發(fā)食物中毒的主要致病菌,嚴(yán)重威脅著人類的健康[1]。其中,腸出血性大腸桿菌O157∶H7是引發(fā)人類出血性結(jié)腸炎、溶血性尿毒癥、血栓性血小板減少性紫癜等疾病的一種致病因素[2]。受動(dòng)物糞便污染的食物和水是大腸桿菌O157∶H7的主要來源,大腸桿菌O157∶H7的低劑量和高毒力往往使感染嚴(yán)重,危及生命,特別是對(duì)幼兒、老年人和免疫系統(tǒng)減弱的人[3]。自美國(guó)1982年首次爆發(fā)流行以來,世界上許多國(guó)家均相繼發(fā)生了大腸桿菌O157∶H7的感染流行,其中發(fā)病較多的國(guó)家主要有美國(guó)、加拿大和日本等[4-7];我國(guó)自1986年首次報(bào)告大腸桿菌O157∶H7的感染病例以來,已先后有十幾個(gè)省市發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157∶H7感染的散發(fā)病例,存在潛在的流行威脅[8-9]。大腸桿菌O157∶H7感染具有高流行性、高發(fā)病率與病死率,因而受到國(guó)內(nèi)外研究人員和世界各國(guó)衛(wèi)生組織的廣泛關(guān)注。
開展致病菌的檢測(cè)是保障食品安全和公共衛(wèi)生的重要手段。由此可見,只有對(duì)大腸桿菌O157∶H7進(jìn)行及時(shí)的檢測(cè)和預(yù)防才能夠有效的避免大腸桿菌O157∶H7的感染,進(jìn)而有效保障人們的健康。大腸桿菌O157∶H7中O是指O抗原,也就是體系細(xì)胞抗原,指包埋在細(xì)菌細(xì)胞壁中的脂多糖類;H是指H抗原,也稱之為鞭毛抗原,屬于蛋白質(zhì)類,因其結(jié)構(gòu)具有免疫能力。除常見的兩類抗原之外,還有K抗原、指莢膜抗原,大部分是多糖;還有M抗原,類似于粘蛋白、多糖類。主要通過這4類不同抗原類型來進(jìn)行血清學(xué)上的分類來分析大腸桿菌[10]。大腸桿菌O157∶H7檢測(cè)方法相對(duì)豐富,主要方法包括傳統(tǒng)分離鑒定法、分子生物學(xué)法和免疫學(xué)法等,但是它們?cè)谑褂蒙先匀淮嬖诤臅r(shí)長(zhǎng)、特異選擇性薄弱、靈敏度低等不確定性因素。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,生物傳感器逐漸進(jìn)入研究人員的視野。生物傳感器是一種對(duì)生物物質(zhì)敏感并將其濃度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)的儀器,是由固定化的生物敏感材料作為識(shí)別元件(包括酶、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、組織、核酸等生物活性物質(zhì))、適當(dāng)?shù)睦砘瘬Q能器(如氧電極、光敏管、場(chǎng)效應(yīng)管和壓電晶體等)及信號(hào)放大裝置構(gòu)成的分析工具或系統(tǒng),具有接受器與轉(zhuǎn)換器的功能[11]。生物傳感器在致病菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域因具有效率高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而取得了長(zhǎng)遠(yuǎn)的發(fā)展。基于此,本文對(duì)大腸桿菌O157∶H7的檢測(cè)方法及其演變進(jìn)行了梳理和比較分析,并著重綜述了生物傳感器在大腸桿菌O157∶H7檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展,以期為大腸桿菌O157∶H7快速、準(zhǔn)確和可商業(yè)化的檢測(cè)方法的研發(fā)提供參考。
對(duì)于大腸桿菌O157∶H7的檢測(cè)技術(shù),從最傳統(tǒng)的發(fā)酵法和濾膜法到當(dāng)下結(jié)合各類生物技術(shù)的檢測(cè)方法離不開研究人員的不斷改進(jìn)[12],在此總結(jié)了大腸桿菌O157∶H7檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展歷程(圖1)。
圖1 大腸桿菌O157∶H7檢測(cè)技術(shù)發(fā)展
傳統(tǒng)的檢測(cè)方法所面臨的問題有耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低以及特異性、選擇性薄弱等不充分的因素,近年來,在傳統(tǒng)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上研究出了更為準(zhǔn)確、快速的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù),包括酶聯(lián)免疫分析法、免疫磁珠分離體檢測(cè)技術(shù)、雙功能抗體檢測(cè)技術(shù)、膠體金檢測(cè)技術(shù)等[13],PCR技術(shù)也在大腸桿菌的檢測(cè)領(lǐng)域受到青睞和認(rèn)可,從常規(guī)PCR優(yōu)化逐步地發(fā)展到熒光定量PCR、多重PCR、基因重組系列PCR等[14]。但是,目前的主流檢測(cè)依舊是傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離鑒定的方法。表1對(duì)近年來常用方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)等進(jìn)行了比較分析。
表1 大腸桿菌O157∶H7常用檢測(cè)分法分析
生物傳感器在致病菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域因具有高效、特異、結(jié)構(gòu)小巧、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等諸多優(yōu)點(diǎn)取得了長(zhǎng)遠(yuǎn)的發(fā)展?;诿庖咦R(shí)別的生物傳感器可快速檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7,主要包括兩類檢測(cè)方法:一類是免標(biāo)記生物傳感器直接檢測(cè),另一類是帶標(biāo)記生物傳感器間接檢測(cè)[15]。此外,近年來,核酸適配也被廣泛用于生物傳感器探針分子檢測(cè)[16-17]。因優(yōu)勢(shì)突出,生物傳感器在大腸桿菌O157∶H7檢測(cè)中發(fā)揮著日益重要的作用。
近年來,生物傳感器技術(shù)依托于自身經(jīng)濟(jì)實(shí)用、結(jié)構(gòu)小巧、特異性強(qiáng)及高效便捷等優(yōu)勢(shì)在致病菌菌株檢測(cè)方面取得了巨大的進(jìn)步[24-26],已經(jīng)成為一種備受大眾認(rèn)可的通用分析工具。生物傳感器技術(shù)原理在于制備或選擇出可與待測(cè)物特異性結(jié)合的適配體作為識(shí)別原件,然后選擇一類納米粒子作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件相結(jié)合,形成適配體生物傳感器[27]。通常習(xí)慣以轉(zhuǎn)換平臺(tái)為基礎(chǔ)進(jìn)行分類,將其分成表面增強(qiáng)拉曼、熒光、比色、光學(xué)、電化學(xué)、試紙條六大類(圖2)[28]??傮w來看,生物傳感器技術(shù)在大腸桿菌O157∶H7檢測(cè)中的應(yīng)用經(jīng)歷了由點(diǎn)至面的過程,從小范圍應(yīng)用向大范圍應(yīng)用不斷擴(kuò)展。隨著生物傳感器技術(shù)的不斷更新,其在大腸桿菌O157∶H7檢測(cè)方面發(fā)揮了日益重要的作用。
圖2 病原體檢測(cè)常用傳感器示意圖[28]
表面增強(qiáng)拉曼散射(surface enhanced Raman scattering, SERS)主要是通過與粗糙金屬表面的相互作用,使信號(hào)分子放大分析容性以及SERS檢測(cè)所具有的獨(dú)特的物理、化學(xué)和光學(xué)性質(zhì),可通過修改結(jié)構(gòu)組成、表面和顆粒大小提高表面增強(qiáng)拉曼散射強(qiáng)度。如利用適體和納米粒子結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼散射來識(shí)別大腸桿菌O157∶H7。最開始運(yùn)用的傳統(tǒng)連接法有物理吸附,雖然簡(jiǎn)單有效但是吸附適體不穩(wěn)定,容易發(fā)生非特異性位移導(dǎo)致假陽性結(jié)果[29-30]。另一種方法是共價(jià)結(jié)合,將帶有硫醇、氨基和其他基團(tuán)的適體共價(jià)連接到納米粒子的表面,不過該方法費(fèi)用高,而且一旦遇到更具競(jìng)爭(zhēng)性的試劑結(jié)合基團(tuán)就可能被去除[31-32]。后來,隨著需求的推動(dòng)和技術(shù)的發(fā)展,開始嘗試用嵌入連接法改善上述問題,有效彌補(bǔ)了傳統(tǒng)連接法的不足。
在SERS傳感器中,金納米骨增強(qiáng)超靈敏表面增強(qiáng)拉曼散射適配傳感器出現(xiàn)的時(shí)間較早。研究表明,將適配體Apt-1和雷達(dá)歸航信標(biāo)嵌入金納米棒(gold nanorods,GNRs)表面,最后形成一種具有識(shí)別能力、信號(hào)穩(wěn)定的再生長(zhǎng)金納米骨NBs(GNRsApt-1+RhB)(Apt-1和Apt-2序列見表2)[29]。該傳感器是通過假設(shè)由適配傳感器和信號(hào)分子組成的核酸分子可以被開發(fā)成具有可控性的表面形態(tài),而提高信號(hào)強(qiáng)度和穩(wěn)定性。
表2 Apt-1和Apt-2序列和作用
利用開發(fā)的金納米骨SERS傳感器來檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7的主要過程為(圖3):先在磁性納米粒子上加入適配體Apt-2形成捕獲探針,而后加入需檢測(cè)的大腸桿菌O157∶H7,再加入上述所得信號(hào)探針,其信號(hào)探針內(nèi)適配體Apt-1的作用是為了保證高穩(wěn)定性、高識(shí)別性以及增強(qiáng)拉曼散射信號(hào)強(qiáng)度。在有磁場(chǎng)的情況下,用SERS觀察1 350 cm-1處的表面增強(qiáng)拉曼散射信號(hào)強(qiáng)度。1 350 cm-1處的拉曼信號(hào)強(qiáng)度和大腸桿菌濃度的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系(y=180.30x-61.49,R2=0.998 2),大腸桿菌濃度范圍為10~10 000 cfu·mL-1,檢出限(limit of detection,LOD)為3 cfu·mL-1。在完成實(shí)際樣品的回收試驗(yàn)后,用實(shí)際飲用水和萵苣樣品評(píng)價(jià)了開發(fā)的適體傳感器的準(zhǔn)確性和實(shí)際應(yīng)用情況。其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)不超過5.2,樣品回收率為96.95%~105.88%,適體傳感器的LOD、信號(hào)穩(wěn)定性、檢測(cè)時(shí)間和回收率證實(shí)了其優(yōu)良的定量檢測(cè)性能[33]。提示開發(fā)的適體傳感器SERS平臺(tái)在食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)和危害分析應(yīng)用方面有著廣闊的前景。
圖3 金納米骨適體傳感器檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7的示意圖[33]
熒光傳感器可以把生物檢測(cè)以電化學(xué)信號(hào)變化來顯示出來,并實(shí)現(xiàn)對(duì)生物、化學(xué)信息的定量分析。以碳納米復(fù)合材料為基礎(chǔ)的新型熒光傳感器能夠有效檢測(cè)牛奶中大腸桿菌O157∶H7。通過氧化還原反應(yīng)形成基于羰基鐵粉(carbonyl iron powder,CIP)和多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes,MWCNT)的磁韌帶。在酸性溶液中,CIP與H+反應(yīng)生成正電荷Fe2+,在反相電荷的吸引下,帶負(fù)電荷的MWCNT會(huì)與CIP顆粒結(jié)合,形成磁性納米復(fù)合物,吸附在納米粒子表面。由于π疊加作用,6-羧基熒光素(6-carboxy fluorescein group, FAM)標(biāo)記的適配體會(huì)隨機(jī)包裹在CIP@MWCNT的側(cè)壁上,而FAM分子接近CIP@MWCNT,有效地在大腸桿菌O157∶H7猝滅了染料的熒光,適配體離開CIP@MWCNT的側(cè)壁。因?yàn)檫m配體對(duì)大腸桿菌O157∶H7的親和力和特異性高于CIP@MWCNT,所以熒光被關(guān)閉時(shí),適配體仍然吸附在CIP@MWCNT上[34]。圖4體現(xiàn)了基于CIP@MWCNT的Advanced Packaging Tool(服務(wù)器系統(tǒng))傳感器上大腸桿菌O157∶H7的分析過程[35]。
圖4 基于CIP@MWCNT的檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7的傳感器示意圖[35]
反應(yīng)式:
CIP-Fe + H+→ CIP-Fe2+
MWCNT-COOH → MWCNT-COO-+ H+
CIP-Fe2++ MWCNT-COO-→ MWCNT-COOFe-CIP
開發(fā)的基于CIP@MWCNT的熒光檢測(cè)傳感器可成功地應(yīng)用于污染樣品基質(zhì)中大腸桿菌O157∶H7的診斷。在制備的適體傳感器下大腸桿菌O157∶H7的濃度可達(dá)到7.15×103cfu·mL-1。此外,根據(jù)性能分析,這種新型磁性納米復(fù)合材料修飾的適體傳感器具有可靠和穩(wěn)定的靶向能力[34]?;贑IP@MWCNT的適體傳感器在實(shí)際樣品中能快速、靈敏地檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7,具有廣闊的應(yīng)用前景。在未來,預(yù)計(jì)這種開發(fā)的適體傳感器將用于監(jiān)測(cè)真實(shí)樣品中多種類型的食源性病原體。
比色傳感器具備直觀讀出結(jié)果、使用方便、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),在檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7領(lǐng)域中備受關(guān)注[36]。其主要原理是將目標(biāo)信號(hào)轉(zhuǎn)化為顏色變化的過程,顯色底物和催化酶的選擇是比色法的關(guān)鍵。
在Wen等[37]成功組裝了適體傳感器后,比色傳感器檢測(cè)大腸桿菌的性能得到了質(zhì)的提升。大腸桿菌O157∶H7與適體在囊泡界面的分子識(shí)別,導(dǎo)致聚二乙炔(polydiacetylene,PDA)的藍(lán)-紅轉(zhuǎn)變,這種轉(zhuǎn)變?nèi)庋酆苋菀卓吹剑瑱z測(cè)原理見圖5。在研究中,用共聚焦激光掃描顯微鏡和透射電鏡證實(shí)了截短適體與大腸桿菌O157∶H7的特異性相互作用。電容器可在2 h內(nèi)檢測(cè)到104~108cfu·mL-1的細(xì)胞濃度,大腸桿菌O157∶H7的相應(yīng)檢出率為98.5%[37]。
圖5 比色傳感器檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7的原理[37]
化學(xué)發(fā)光為物質(zhì)在進(jìn)行某些化學(xué)反應(yīng)時(shí)伴隨產(chǎn)生的光輻射現(xiàn)象。目前常見的化學(xué)發(fā)光適配體傳感器(chemiluminescence aptasensor)是在體系中引入相關(guān)元件進(jìn)行發(fā)光反應(yīng),或是在核酸適配體上標(biāo)記化學(xué)發(fā)光因子[38]。此類傳感器具有重復(fù)利用率高、靈敏度強(qiáng)等特點(diǎn),正因如此,檢測(cè)大腸桿菌時(shí)往往會(huì)用到化學(xué)發(fā)光傳感器。
為了提升化學(xué)傳感器在檢測(cè)大腸桿菌當(dāng)中的性能與作用,Khang等[39]實(shí)現(xiàn)了技術(shù)上的突破,極大的提高了樣品中大腸桿菌O157∶H7的檢測(cè)效果,縮短了定量樣品中大腸桿菌O157∶H7所用的時(shí)間。大腸桿菌O157∶H7適體結(jié)合的FAM具有良好的特異性,當(dāng)混合物在37 ℃下培養(yǎng)1 h時(shí),能捕獲樣品中的大腸桿菌O157∶H7。根據(jù)游離適體與GO/鐵納米復(fù)合物π-π堆積相互作用的原理,用GO/鐵納米復(fù)合物去除培養(yǎng)后殘留在樣品中的游離大腸桿菌O157∶H7適體。當(dāng)樣品中加入鳥嘌呤化學(xué)發(fā)光試劑時(shí),樣品中與適體FAM結(jié)合的大腸桿菌O157∶H7會(huì)發(fā)出強(qiáng)光。隨著大腸桿菌O157∶H7濃度的增加,鳥嘌呤化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度成比例增加??傮w來看,此大腸桿菌O157∶H7生物傳感器的LOD低至4.5 cfu·mL-1,具有良好的準(zhǔn)確度、精密度和重現(xiàn)性,有望在食品安全和公共衛(wèi)生領(lǐng)域得到應(yīng)用。
電化學(xué)適體傳感器制備時(shí),會(huì)將電化學(xué)活性信號(hào)傳導(dǎo)元件和核酸適配體結(jié)合固定在電極表面,所測(cè)試靶標(biāo)存在時(shí),會(huì)與核酸適配體特異性結(jié)合,導(dǎo)致電極表面變化,通過檢測(cè)變化的電化學(xué)信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌的定性或定量檢測(cè)。
在電化學(xué)適體傳感器方面,Wang等[40]開發(fā)出了一種基于磁性納米粒子同軸毛細(xì)管、脲酶催化和多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls,PCBs)電極的電化學(xué)傳感器,用于快速、靈敏地檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7。利用免疫磁性納米粒子(magnetic nanoparticles, MNPs)的同軸毛細(xì)管實(shí)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)菌的特異性分離,脲酶與尿素放大阻抗信號(hào),PCB金電極測(cè)量阻抗變化。將鏈霉親和素修飾的MNPs與生物素化的多克隆抗體(polyclonal antibodies,PAbs)偶聯(lián)形成免疫M(jìn)NPs,并用高梯度磁場(chǎng)將其捕獲在同軸毛細(xì)管中,將細(xì)菌從大量樣品中分離出來。然后,用抗大腸桿菌和脲酶的適體修飾GNPs,將其注入毛細(xì)管與細(xì)菌反應(yīng),形成MNP-PAb-細(xì)菌適體-GNP-脲酶復(fù)合物[34]。最后,利用化合物上的脲酶催化尿素水解為毛細(xì)管中的銨離子和碳酸鹽離子,導(dǎo)致過氧化氫的阻抗降低,用鍍金PCB電極測(cè)量。過氧化氫的阻抗變化與細(xì)菌的濃度呈良好的線性關(guān)系。該傳感器能在3 h內(nèi)檢測(cè)低至10 cfu·mL-1的大腸桿菌,在牛奶中大腸桿菌的平均回收率為99%。由此可見,該傳感器具有檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高、成本低等優(yōu)點(diǎn),有不錯(cuò)的應(yīng)用前景。
圖6 發(fā)光傳感器檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7的原理[39]
圖7 電化學(xué)傳感器快速檢測(cè)大腸桿菌的原理[40]
側(cè)向流生物傳感器是將側(cè)向流動(dòng)型試紙與核酸適配體相結(jié)合的技術(shù),靶標(biāo)菌與適配體結(jié)合形成復(fù)合物后進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物加入側(cè)向流試紙后會(huì)進(jìn)行可視化信號(hào)輸出[23]。該技術(shù)整合了Linux From Scratch和適配體在分子檢測(cè)領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì),方便攜帶、操作簡(jiǎn)單,也可直觀的快速檢測(cè),但無法進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析[28]。在橫向血流免疫分析法(lateral flow immunoassay,LFIA)中使用的常用測(cè)試條由樣品、共軛墊和吸收墊以及膜組成。金納米粒子(AuNPs;標(biāo)記劑)和抗體(識(shí)別元件)是試紙法中最重要的成分,如圖8所示。三明治格式是LFIA中使用最多的系統(tǒng),在夾心LFIA中,一種抗體固定在膜上,另一種識(shí)別不同表位的抗體用AuNPs標(biāo)記。在2種抗體之間捕獲分析物[41]。去年Wang等[42]報(bào)道了一種基于納米酶細(xì)菌抗體的快速檢測(cè)多讀出和無標(biāo)簽的LFIA。這種無標(biāo)簽的LFIA可以在西瓜汁、牛奶和卷心菜沙拉中的102 cfu·mL-1的低檢測(cè)極限下表現(xiàn)出優(yōu)異的檢測(cè)性能,檢測(cè)范圍為102~108 cfu·mL-1。
圖8 側(cè)流適體傳感器檢測(cè)大腸桿菌的原理[41]
隨著衛(wèi)生事業(yè)、醫(yī)學(xué)事業(yè)、科學(xué)事業(yè)的發(fā)展以及人民生活水平的提升,食源性致病菌污染問題備受重視。要想切實(shí)保障人民的健康,就必須對(duì)大腸桿菌O157∶H7進(jìn)行及時(shí)檢測(cè)和有效預(yù)防。兼具接受器與轉(zhuǎn)換器雙重功能的生物傳感器對(duì)于監(jiān)測(cè)大腸桿菌O157∶H7有重要意義。
大腸桿菌O157∶H7的檢測(cè)方法隨著時(shí)間的推移在不斷完善,監(jiān)測(cè)朝著科技化、精準(zhǔn)化、快速化的方向逐漸演變;生物傳感器在大腸桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用經(jīng)歷了范圍由小至大、深度由淺入深、效果由一般到逐漸理想化的轉(zhuǎn)變。簡(jiǎn)而言之,生物傳感器技術(shù)在檢測(cè)大腸桿菌當(dāng)中的應(yīng)用經(jīng)歷了由點(diǎn)至面的過程,從小范圍應(yīng)用向大范圍應(yīng)用不斷擴(kuò)展,在生物傳感器技術(shù)不斷發(fā)展的過程中,其在檢測(cè)大腸桿菌方面發(fā)揮了日益重要的作用。
就目前來看,生物傳感器在大腸桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用會(huì)繼續(xù)朝著科技化方向發(fā)展,或許生物傳感器會(huì)同當(dāng)下流行的人工智能技術(shù)、信息技術(shù)良好結(jié)合,從而提高檢測(cè)的精準(zhǔn)度、加快檢測(cè)的速度、進(jìn)一步提高升檢測(cè)的準(zhǔn)確度。進(jìn)而開發(fā)的方法可以應(yīng)用于檢測(cè)其他食源性病原體,如沙門氏菌、李氏菌和弧菌等。期望將來能夠開發(fā)一種先進(jìn)的生物傳感器,能夠同時(shí)監(jiān)測(cè)存在于樣本中的多種食源性病原體。