蘆可替尼治療骨髓纖維化階段性療效及安全性評估

羅潔 譚雅嫻 黃繼賢 吳婉兒 劉靚 周玲玲 周璇 陰常欣 劉曉力 許娜

1南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院血液科（廣州510515）；2粵北人民醫(yī)院血液科（廣東韶關(guān)512025）

骨髓增殖性腫瘤（MPN）是以一系或多系髓系細(xì)胞增殖為主要特征的克隆性造血干細(xì)胞疾病，其中真性紅細(xì)胞增多癥（PV）、原發(fā)性血小板增多癥（ET）、原發(fā)性骨髓纖維化（PMF）是最常見的經(jīng)典型BCR?ABL 融合基因陰性的MPN。而PV、ET在疾病后期可進(jìn)展為繼發(fā)性骨髓纖維化（MF），稱為Post?PV MF、Post?ET MF［1］。MF 的臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性血細(xì)胞減少、肝脾腫大和衰弱癥狀（疲勞、虛弱、腹痛、惡病質(zhì)、體重減輕、瘙癢、盜汗和骨痛），并且高風(fēng)險(xiǎn)向白血病轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致患者生存質(zhì)量下降和壽命縮短。研究表明JAK?STAT通路的過度活化與MF 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。蘆可替尼作為一種強(qiáng)效的JAK1/JAK2 選擇性抑制劑，是美國食品藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)上市的第一個(gè)JAK 家族抑制劑。大量研究證實(shí)蘆可替尼顯著改善MF 患者的生存質(zhì)量和延長患者的總體生存期（overall survival，OS），現(xiàn)已作為IPSS 中危?2 和高危組MF患者治療的首選。該藥2017年于我國上市批準(zhǔn)用于治療中高危PMF、PV 繼發(fā)的MF 或者ET 繼發(fā)的MF［2］，由于費(fèi)用相對昂貴，故目前中國人群真實(shí)世界關(guān)于蘆可替尼療效及安全性報(bào)道較少，缺少具有參考價(jià)值的臨床大數(shù)據(jù)的支持。本研究擬分析單中心蘆可替尼治療MF 患者的療效及安全性，同時(shí)觀察蘆可替尼對MF 患者免疫系統(tǒng)的影響，為中國人群真實(shí)世界中蘆可替尼的用藥提供了一定的參考價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 病例資料回顧性分析2017年6月至2019年5月就診于南方醫(yī)院規(guī)范服用蘆可替尼超過12 個(gè)月的60 例MF 患者，其中男29 例，女31 例，中位年齡58（20，78）歲。所有病例均有明確的骨髓活檢組織病理學(xué)診斷依據(jù)，且診斷符合2016年WHO 重新修訂的造血和淋巴組織腫瘤分類中關(guān)于PPV?MF、PET?ET 和PMF 的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，入組患者PMF 29 例（48.33%）、PPV?MF 16 例（26.67%）、PET?MF 15例（25.00%）。確診MF的患者均根據(jù)國際預(yù)后積分系統(tǒng)（IPSS）、動(dòng)態(tài)國際預(yù)后積分系統(tǒng)（DIPSS）或DIPSS?Plus 預(yù)后積分系統(tǒng)［4］進(jìn)行了危險(xiǎn)分層，其中中危?2組38例（63.33%）、高危組22例（36.67%）。MF 患者的一般臨床特征見表1。

1.2 藥物劑量根據(jù)患者血小板基線計(jì)數(shù)來確定蘆可替尼的起始劑量（50～100）×109/L，10 mg bid；（100～200）×109/L，15 mg bid；＞200×109/L，20 mg bid）。本研究中對于就診時(shí)血紅蛋白低于90 g/L的患者蘆可替尼起始劑量調(diào)整為5 mg bid。根據(jù)療效和不良反應(yīng)發(fā)生情況允許進(jìn)行劑量調(diào)整，調(diào)整劑量間隔至少2 周，最大用量為25 mg bid［4］。本研究中起始劑量20 mg bid：23例；15 mg bid：11例；10 mg bid：18 例；5 mg bid：8 例。有8 例（13.33%）患者分別在用藥后的第2、3、8、12、24 周減小藥物劑量，減量的主要原因是血小板減少和貧血；有2 例（3.33%）患者用藥后第8 周因嚴(yán)重貧血而停藥，停藥2 個(gè)月后貧血好轉(zhuǎn)又繼續(xù)用藥；有3 例（5.00%）患者因疾病進(jìn)展停藥；其余患者的藥物使用劑量隨訪期間穩(wěn)定維持。

1.3 療效及不良反應(yīng)評估使用MPN 癥狀評估表（MPN?SAF?TSS）［5］評估服用蘆可替尼12 個(gè)月后患者總癥狀評分較基線的變化，觀察總評分降低≥50%的患者比例。采用超聲技術(shù)測量患者脾臟的長徑和厚徑來評估脾臟大小，觀察服用蘆可替尼12 個(gè)月，患者脾臟長厚徑較前縮小情況。骨髓纖維化程度通過骨髓活檢活組織切片病理染色來分析，根據(jù)WHO（2016）定義的骨髓纖維化分級［3，6］進(jìn)行評估。JAK2V617F 等位基因突變量的定量檢測通過實(shí)時(shí)定量PCR（RT?PCR）法來檢測，等位基因負(fù)荷改善率根據(jù)前后PCR 結(jié)果來評估。

表1 60 例骨髓纖維化患者的一般臨床特征Tab.1 Basic clinical characteristics of 60 patients with myelofibrosis

藥物不良反應(yīng)的嚴(yán)重程度是依據(jù)美國國家癌癥研究所（NCI）發(fā)布的不良反應(yīng)常用術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)（CTCAE）4.0 版進(jìn)行評估的，根據(jù)定義：1 級=輕度，2 級=中度，3 級=重度，4 級=危及生命或致殘。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測T 細(xì)胞亞群變化T 淋巴細(xì)胞亞群及NK 細(xì)胞檢測使用直接免疫熒光染色法（試劑及儀器均采購于美國BD公司）。全部患者均于清晨空腹抽取靜脈血2 mL 置于EDTA 紫色抗凝管中，各取血50 μL 置于4 個(gè)試管中，分別加入熒光素標(biāo)記抗人CD3?APC/CD19?Pacific，CD3?PerCP?Cy5?5/CD4?APC/CD8?PE，CD3?APC/CD56?PE 單克隆抗體各5 μL，留一個(gè)空白對照試管?；靹蚝笾糜陉幇堤? ℃孵育20 min。各加紅細(xì)胞裂解液2 mL充分震蕩混勻，置于陰暗處18～20 ℃孵育10 min。待紅細(xì)胞充分溶解后2 000 r/min 離心5 min；加1 mL PBS 洗液，2 000 r/min 離心5 min，棄上清液，重復(fù)1 次；加300 μL PBS 洗液重懸，上機(jī)檢測。以CD3+CD19-T 細(xì)胞表示總T 細(xì)胞，CD3+CD4+T 細(xì)胞標(biāo)記Th 細(xì)胞（輔助性T 細(xì)胞），CD3+CD8+T 細(xì)胞標(biāo)記Tc 細(xì)胞（細(xì)胞毒性T 細(xì)胞），CD3-CD56+代表NK 細(xì)胞，記錄T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞的陽性細(xì)胞百分率。

1.5 隨訪通過走訪、門診進(jìn)行隨訪。隨訪終止時(shí)間為2020年5月31日，中位隨訪時(shí)間為20（12，34）個(gè)月。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)性計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，非正態(tài)性計(jì)量資料以M（P25，P75）描述，計(jì)數(shù)資料以例（%）描述，自身對照采用配對樣本t檢驗(yàn)或Wilcoxon 符號秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癥狀評分評估隨訪12 個(gè)月，49 例（81.67%）患者總癥狀評分較基線有不同程度的下降，其中31例（51.67%）患者總癥狀評分降低≥50%。基線中位MPN?10 評分為17.50（12，33），隨訪12 個(gè)月后減少至10.00（6，18），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。治療期間，患者的各項(xiàng)單項(xiàng)癥狀均明顯改善，中位癥狀評分改善均≥50%（表2）。

表2 骨髓纖維化患者接受蘆可替尼治療前后各項(xiàng)癥狀評分變化Tab.2 The changes of symptom scores in patients with myelofibrosis after treat with ruxolitinib M（P25，P75）

2.2 脾臟大小評估基線時(shí)45 例患者存在脾臟腫大，治療期間40 例（88.89%）患者有不同程度的脾臟縮小。患者在服用蘆可替尼前后均用B 超測量了脾臟的長徑和厚徑，基線脾臟平均長厚徑分別為（16.65±3.42）、（5.86±1.54）cm，隨訪12 個(gè)月分別縮短至（14.93 ± 3.02）、（5.32 ±1.29）cm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，表3）。

表3 骨髓纖維化患者接受蘆可替尼治療前后脾臟長徑變化Tab.3 The length of the spleen after the treatment of ruxolitinib in patients with myelofibrosis 例（%）

2.3 骨髓纖維化改善率及JAK2V617F 等位基因負(fù)荷改善率至隨訪結(jié)束共取得42 例患者服用蘆可替尼前后的骨髓病理結(jié)果，其中24 例（57.14%）患者骨髓纖維化程度穩(wěn)定，15 例（35.71%）患者較基線有所改善（包括1 例從3 級、2 例從1 級改善至0級），3例（7.14%）患者加重，見表4。45例（75.00%）患者合并JAK2V617F基因突變，基線中位等位基因負(fù)荷為52.40%（23.09%，78.67%），隨訪12個(gè)月該基因突變負(fù)荷中位下降了0.90%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.600）。

表4 骨髓纖維化患者接受蘆可替尼前后骨髓纖維化程度變化Tab.4 Bonemarrow fibrosis in patients with myelofibrosis after ruxolitinib therapy

2.4 安全性隨訪期間，47 例（78.33%）患者經(jīng)歷了一種或多種不良反應(yīng)（任何級別），19例（31.67%）患者發(fā)生3/4 級不良事件。10 例（16.67%）患者因不良事件而藥物減量或中斷治療，3 例（5.00%）因不良事件而終止給藥。

常見的血液學(xué)不良反應(yīng)為貧血（68.09%，3/4 級19.15%）和血小板減少（40.43%，3/4 級8.51%）?；颊咂骄t蛋白水平和血小板計(jì)數(shù)在開始治療后的前8 周顯著下降，隨后逐漸恢復(fù)至平均血紅蛋白≥110 g/L，平均血小板計(jì)數(shù)維持在300×109/L 的水平（圖1）。幾乎所有發(fā)生3/4 級貧血的患者經(jīng)紅細(xì)胞輸注后貧血癥狀改善，僅1 例患者因重度貧血而停藥；發(fā)生3/4 級血小板減少事件的患者均經(jīng)調(diào)整蘆可替尼劑量后好轉(zhuǎn)。

圖1 平均血紅蛋白和血小板計(jì)數(shù)隨蘆可替尼治療時(shí)間的變化Fig.1 Mean hemoglobin and platelet counts changes with the treatment time of ruxolitinib

非血液學(xué)不良反應(yīng)主要觀察到感染的發(fā)生，14 例（23.33%）患者在服用蘆可替尼后出現(xiàn)感染，包括尿路感染（1 例）、肺炎（7 例）、肺結(jié)核（3 例）、帶狀皰疹（1 例）、巨細(xì)胞病毒（1 例）、隱球菌性腦炎（1 例）。其中2 例患者因嚴(yán)重感染而停藥，其余患者在針對感染癥狀治療后好轉(zhuǎn)。為探索蘆可替尼對患者免疫功能的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測患者服用蘆可替尼前后免疫細(xì)胞亞群的變化情況（表5、圖2），結(jié)果顯示在使用蘆可替尼后MF 患者外周血中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T 細(xì)胞及NK細(xì)胞百分率均有所下降，其中NK 細(xì)胞百分率在治療前后的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.020），見表5。

表5 骨髓纖維化患者接受蘆可替尼治療前后免疫細(xì)胞亞群對比Tab.5 Immune cell subsets in patients with myelofibrosis before and after the therapy of ruxolitinib±s，%

表5 骨髓纖維化患者接受蘆可替尼治療前后免疫細(xì)胞亞群對比Tab.5 Immune cell subsets in patients with myelofibrosis before and after the therapy of ruxolitinib±s，%

類別 治療前 治療后P 值CD3+68.32±11.6859.03±12.980.148 CD3+CD4+35.90±11.9631.51±11.050.266 CD3+CD8+CD3-CD56+28.68±8.95 12.13±5.29 24.36±7.63 8.17±4.09 0.153 0.020

3 討論

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測治療前后患者免疫功能的變化Fig.2 Flow cytometry to detect changes in the patient′s immune function after the treatment of ruxolitinib

骨髓纖維化是一種異質(zhì)性疾病，JAK?STAT 信號通路的過度激活導(dǎo)致造血干細(xì)胞過度增殖和炎癥因子的過度釋放是其發(fā)生的核心機(jī)制。當(dāng)前骨髓纖維化的治療目標(biāo)是緩解疾病相關(guān)癥狀和體征，提高患者生存質(zhì)量，改善/逆轉(zhuǎn)骨髓纖維化，延長生存。蘆可替尼是一種JAK1/JAK2 選擇性抑制劑，本研究顯示蘆可替尼通過抑制JAK?STAT 通路，可顯著改善骨髓纖維化患者體質(zhì)性癥狀、縮小腫大脾臟、穩(wěn)定或改善骨髓纖維化程度、一定程度降低JAK2V617F 基因突變負(fù)荷，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［7-11］。此外，本研究還評估了蘆可替尼治療骨髓纖維化的安全性并探討了蘆可替尼對患者免疫細(xì)胞的影響，旨為真實(shí)世界中蘆可替尼的用藥提供一定的參考價(jià)值。

既往研究［5］表明，蘆可替尼對MF 患者有良好療效。本研究采用MPN?SAF?TSS（MPN 癥狀評分表?總積分）對MF 患者的癥狀負(fù)荷進(jìn)行評估，該評分包括乏力、早飽感、腹部不適、活動(dòng)力不佳、注意力不集中、盜汗、皮膚瘙癢、骨痛、發(fā)熱及體重下降10項(xiàng)指標(biāo)，每項(xiàng)癥狀由輕至重評分為0～10分，滿分100 分。隨訪12 個(gè)月，81.67%的患者總癥狀評分較基線有不同程度的下降，其中51.67%的患者經(jīng)歷了總癥狀評分較基線改善≥50%，與A2202 臨床研究相近（53.1%的患者總癥狀評分降低≥50%）［11］。在一項(xiàng)蘆可替尼治療亞洲MF 患者的研究中，患者的單項(xiàng)癥狀有明顯改善（盜汗：-49.9%；早飽：-35.5%；腹部不適：-30.6%）［12］，本研究中患者各項(xiàng)指標(biāo)的評分均有較大改善，顯示了蘆可替尼在提高患者生存質(zhì)量方面的優(yōu)越性。

除改善MF 患者體質(zhì)性癥狀外，蘆可替尼還具有縮脾效果。隨訪12 個(gè)月，結(jié)果顯示88.89%的患者有不同程度的脾臟縮小；其中，脾臟長厚徑縮短≥35%的患者比例分別為31.11%、28.89%。脾反應(yīng)率較A2202 臨床試驗(yàn)稍差（39.7%的患者脾臟體積較基線水平縮小≥35%），這可能與兩個(gè)實(shí)驗(yàn)用于衡量脾臟大小的標(biāo)準(zhǔn)不同所造成，A2202 臨床試驗(yàn)采用MRI 或CT 通過測量脾臟體積來評估用藥前后脾臟的變化，而本研究則采用B 超通過測量脾臟長厚徑來評估。此外，許多研究還提到使用肋下可觸及脾臟長度作為衡量脾臟大小的標(biāo)準(zhǔn)［7，9，12］，但不論是以何種標(biāo)準(zhǔn)來衡量脾臟大小試驗(yàn)結(jié)果都說明了蘆可替尼具顯著的縮脾效果。

骨髓纖維化程度被認(rèn)為是MPN 患者預(yù)后不良的一個(gè)重要影響因素［13-14］。在一項(xiàng)長期使用蘆可替尼和最佳可行治療（BAT）對MF 患者骨髓纖維化影響的研究中，發(fā)現(xiàn)與BAT 相比，蘆可替尼改善或穩(wěn)定骨髓纖維化幾率更大［10］。本研究隨訪12 個(gè)月，發(fā)現(xiàn)92.86%的患者骨髓纖維化程度改善或穩(wěn)定，反應(yīng)率較好。JAK2V617F 等位基因負(fù)荷與疾病表型相關(guān)，白細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白水平較高且脾腫大程度患者往往合并較高的等位基因突變負(fù)荷。COMFORT?Ⅰ中延長蘆可替尼治療時(shí)間可以降低JAK2V617F 等位基因負(fù)荷，雖然平均變化不大，但一部分患者實(shí)現(xiàn)了分子學(xué)緩解，并且這種效果與基線等位基因負(fù)荷水平無關(guān)［15］。而在本研究中隨訪12 個(gè)月，JAK2V617F 等位基因負(fù)荷中位下降了0.90%。以上結(jié)果提示蘆可替尼具有逆轉(zhuǎn)或緩解骨髓纖維化程度的作用，并可減輕JAK2V617F基因突變負(fù)荷。

JAK?STAT 信號通路通過介導(dǎo)來自多種細(xì)胞因子（IL?2、IL?6 等）和造血生長因子（EPO、TPO、G?CSF 等）的信號在正常造血中發(fā)揮核心作用，而蘆可替尼作為一種JAK1/2 強(qiáng)抑制劑，也可能具有骨髓抑制作用。在既往的臨床研究中，蘆可替尼最常見的血液學(xué)不良反應(yīng)為貧血和血小板減少［16］。本研究中貧血、血小板減少的發(fā)生率分別為68.09%、40.43%，并且3/4 級貧血和血小板減少事件均在開始治療的前8 周發(fā)生，與既往研究報(bào)道的基本一致［7，11］，提示在使用蘆可替尼后的一段時(shí)間內(nèi)應(yīng)密切監(jiān)測血常規(guī)至患者血象穩(wěn)定。盡管貧血和血小板減少發(fā)生率較高，但絕大多數(shù)患者經(jīng)輸注紅細(xì)胞、減小藥物劑量或暫時(shí)中斷治療后癥狀改善，僅5.00%的患者因不良反應(yīng)而停藥。

此外，JAK?STAT 信號通路對免疫系統(tǒng)中細(xì)胞因子的激活和信號傳遞也是至關(guān)重要的，因此，MPN 患者表現(xiàn)出循環(huán)中致炎因子水平異常升高，從而導(dǎo)致疾病相關(guān)的全身癥狀。筆者前期研究工作中也發(fā)現(xiàn)MPN 患者循環(huán)中TPO、IL?6、IL?8、IL?12等炎性細(xì)胞因子較正常對照組明顯升高［17］。而蘆可替尼作為一種JAK 抑制劑，其抑制細(xì)胞因子作用可明顯改善患者全身癥狀，但同時(shí)也會引發(fā)免疫抑制效應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致感染的發(fā)生。蘆可替尼的細(xì)胞抑制靶點(diǎn)包括先天和獲得性免疫系統(tǒng)成分，如樹突狀細(xì)胞（DC），自然殺傷細(xì)胞（NK），輔助性T 細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Tregs）［18］。DC 是一種抗原呈遞細(xì)胞，在誘導(dǎo)抗原特異性T 細(xì)胞反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用［19］。BARONE 等［20］研究顯示暴露于蘆可替尼后，樹突狀細(xì)胞數(shù)量減少、功能受損，從而導(dǎo)致T 細(xì)胞活化受損。NK 可非特異性殺傷腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞等，CURRAN 等［21］在研究中發(fā)現(xiàn)使用蘆可替尼治療的患者NK 細(xì)胞數(shù)量明顯減少，這可能是因?yàn)槠湟种屏藢K 細(xì)胞終端成熟至關(guān)重要的細(xì)胞因子（IL?2、IL?15）的合成，并發(fā)現(xiàn)合并NK 細(xì)胞缺乏的患者更易合并感染。Tregs 細(xì)胞調(diào)節(jié)自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞并調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。BARONE 等［20］發(fā)現(xiàn)接受了蘆可替尼治療的患者Tregs 細(xì)胞較健康人顯著降低，并且蘆可替尼停藥或是減量都會影響Tregs 細(xì)胞的數(shù)量及功能，且對Tregs 細(xì)胞的影響是不可逆的。SANT′ANTO?NIO 等［22］發(fā)現(xiàn)蘆可替尼在體內(nèi)外均可快速抑制CD4+T 細(xì)胞分泌炎癥因子，進(jìn)而抑制免疫功能活化而增加感染發(fā)生率。本研究中感染發(fā)生率為23.33%，服用蘆可替尼后MF 患者循環(huán)中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T 細(xì)胞及NK 細(xì)胞百分率均有所降低，表明機(jī)體存在免疫功能的受損，與上述研究的結(jié)論一致，說明蘆可替尼的使用可能引起機(jī)體免疫抑制效應(yīng)，提示在應(yīng)用蘆可替尼或其他JAK 抑制劑治療時(shí)應(yīng)仔細(xì)詢問既往感染史并進(jìn)行積極的安全性評估，及時(shí)防控感染的發(fā)生。

總之，本研究結(jié)果表明蘆可替尼可顯著改善骨髓纖維化患者癥狀、縮小腫大脾臟、穩(wěn)定或改善骨髓纖維化程度、一定程度降低JAK2V617F 基因突變負(fù)荷。不良反應(yīng)主要為可控制的貧血和血小板減少，對于蘆可替尼的免疫抑制作用導(dǎo)致感染事件的發(fā)生需謹(jǐn)慎對待。不足在于本研究為單中心回顧性研究且病例數(shù)較少，可能會存在偏移；此外一年的觀察期較短缺乏長期隨訪。因此蘆可替尼對于真實(shí)世界中的療效仍需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行下一階段的觀察。