LED光質(zhì)對兩種金線蓮組培苗生理特征和代謝物質(zhì)的影響

李 琪，吳 棟，吳延妮，周雅蓮，劉麗華，羅麗萍，崔 萌

(南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江西 南昌 330031)

福建金線蓮(A.roxburghii)和臺灣金線蓮(A.formosanus)為蘭科開唇蘭屬(Anoectochilus)植物，全草可入藥，是珍稀名貴中藥材和國家二級重點(diǎn)保護(hù)野生植物，具有清涼解毒、祛風(fēng)利濕、消炎止痛等作用[1]，常被用于金線蓮組培快繁體系研究。福建金線蓮葉呈深綠色，葉脈為金色，臺灣金線蓮葉呈淺綠色，葉脈為銀白色。金線蓮富含多糖、類黃酮、酚類、三萜類、皂甙和甾體等多種物質(zhì)，可提高機(jī)體免疫力[2-3]，其微量元素、氨基酸含量均高于國產(chǎn)西洋參和野生參[4-5]。金線蓮醇提物還具有降血糖和抗氧化作用，能顯著降低糖尿病小鼠的丙二醛(Malondialdehyde)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase)、甘油三酯(Triglyceride)和總膽固醇(Total Cholesterol)[6]。金線蓮種子萌發(fā)率低，有性繁殖比較困難，野生資源較為匱乏。目前通過組織培養(yǎng)對金線蓮進(jìn)行快速繁殖，不僅解決了野生金線蘭資源緊缺問題，而且對于其種質(zhì)資源保護(hù)也發(fā)揮了積極的作用[6]。國內(nèi)關(guān)于金線蓮組培快繁技術(shù)進(jìn)行了大量研究，多以莖段作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)分化[7-8]，并在此基礎(chǔ)上對培養(yǎng)基、激素、有機(jī)物等培養(yǎng)條件優(yōu)化，金線蓮的組織培養(yǎng)體系較為完善[9]。

光質(zhì)作為組織培養(yǎng)的關(guān)鍵環(huán)境因素，對離體培養(yǎng)植物的光形態(tài)建成、物質(zhì)代謝等各個生理過程起著重要的調(diào)控作用。LED能發(fā)出高純度的單色光以及復(fù)合光來調(diào)控植物的生長以及代謝物質(zhì)的積累。如Puspa等[10]發(fā)現(xiàn)紅色LED光源處理下葡萄組培外植體的芽最長，Kurilik等[11]研究表明短波長藍(lán)光抑制了菊花幼苗的伸長生長。Ye等[12]研究了4種不同顏色的薄膜過濾光對福建金線蓮生長及活性物質(zhì)含量的影響，發(fā)現(xiàn)紅光處理顯著提高了福建金線蓮的株高和酚類物質(zhì)含量，而藍(lán)光處理的植株鮮重、葉面積、多糖和黃酮含量明顯提高。Wang等[13]在夜間補(bǔ)充LED藍(lán)光以研究金線蓮植株生物量和次生代謝物含量的變化，發(fā)現(xiàn)單色藍(lán)光處理有利于增加總黃酮、總多酚的積累。然而目前仍缺乏不同光配比的復(fù)合光對不同金線蓮組培苗代謝產(chǎn)物含量的分析比較。

本實(shí)驗(yàn)以福建金線蓮和臺灣金線蓮莖段為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)兩種金線蓮吸收光譜中紅藍(lán)波長區(qū)吸收峰比例均為2:1，設(shè)置紅藍(lán)光2:1(R2B1)、紅藍(lán)光1:2(R1B2)和白光(W)3種LED光處理，并在3種LED光下進(jìn)行組織培養(yǎng)，探究光質(zhì)配比對其生物量、葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白、游離氨基酸、總酚、總黃酮、槲皮素、異鼠李素、山奈酚、阿魏酸、綠原酸的影響，摸索出金線蓮最佳LED培育光質(zhì)，為LED在金線蓮組培方面的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

高5 cm、帶3個節(jié)的福建金線蓮和臺灣金線蓮組培苗，由江西省植物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

選取金線蓮組培苗莖段接種在MS+0.5 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1瓊脂+0.5 g·L-1活性炭培養(yǎng)基[14]上，每瓶4段。設(shè)置紅藍(lán)光2:1(R2B1)、紅藍(lán)光1:2(R1B2)和白光(W)3種光質(zhì)處理，將接種好的材料置于(30±1) μmol·m-2·s-1的LED光下進(jìn)行光照處理。光周期為12 h·d-1，相對濕度為(75±5)%，溫度為(25±2)℃，培養(yǎng)60 d后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測定。

1.2 試劑與儀器

沒食子酸、阿魏酸、綠原酸等標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蘆丁、槲皮素、山奈酚、異鼠李素等標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈(色譜純)、無水乙醇(分析純)、甲酸(色譜純)、甲醇(色譜純)等均為國產(chǎn)。

日立L-8900全自動氨基酸分析儀(德國SYKAM公司)；Waters Alliance HPLC高效液相色譜儀(美國Waters公司)，C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；UV-5800紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；PLA-20型植物光照分析儀(杭州遠(yuǎn)方光電信息股份有限公司)；LED紅藍(lán)白組合燈板(錦昊光電科技有限公司)。

1.3 理化特性

1.3.1 生長指標(biāo)的測定

用直尺測定金線蓮組培苗的株高、葉長、葉寬，用游標(biāo)卡尺測量莖粗。鮮重和干重(85℃烘干至恒重)用電子天平稱量，計(jì)算含水率。

1.3.2 葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白、游離氨基酸含量的測定

葉綠素含量用95%乙醇進(jìn)行提取[15]，于665，649 nm下測定吸光值，計(jì)算公式為C總=13.95D665-6.8D649+24.96D649-7.32D665，其中C總為葉綠素濃度(mg·L-1)，D665為665 nm的吸光值，D649為649 nm的吸光值?？扇苄蕴呛坑昧蛩?蒽酮法測定[16]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，于620 nm處測吸光值，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.007 4x+0.019 7(R2=0.997 7)，其中x為葡萄糖濃度(mg·mL-1)，y為吸光度值?？扇苄缘鞍缀坑每捡R斯亮藍(lán)法測定[12]，并以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，于595 nm處測吸光值，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=3.415 7x+0.017 4(R2=0.992 3)，其中x為蛋白質(zhì)濃度(mg·mL-1)，y為吸光度值。

游離氨基酸通過氨基酸分析儀進(jìn)行測定[17]：準(zhǔn)確稱取1.500 g的金線蓮組培苗鮮樣，加入3 mL 0.02 mol·L-1HCl冰浴研磨成勻漿，4 ℃下10 000 r·min-1離心15 min，殘?jiān)鼜?fù)提2次，合并上清液。取4 mL上清液加入4 mL 8%磺基水楊酸混勻，靜置15 min使蛋白質(zhì)沉淀。離心取上清液，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后上機(jī)檢測。

1.4 次生代謝物質(zhì)含量測定

1.4.1 金線蓮整株醇提液的制備

金線蓮醇提液的制備[18]：將金線蓮鮮樣整株進(jìn)行冷凍干燥后研磨。精密稱取金線蓮粉末0.200 g，加入2 mL的80%乙醇溶液，45 ℃下超聲提取15 min，5 000 r·min-1離心10 min，殘?jiān)鼜?fù)提2次，合并上清液。50℃下置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮至近干，加入80%乙醇溶液溶解定容至10 mL。

1.4.2 總酚和總黃酮的測定

總酚含量測定采用Folin-Ciocalteu法[19]，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制總酚含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=0.505 1x-0.007 8(R2=0.997 7)，其中x為沒食子酸質(zhì)量濃度(mg·mL-1)，y為吸光度值。準(zhǔn)確吸取1 mL的醇提液于10 mL容量瓶，加入1.5 mL的福林酚試劑，再加入4 mL的0.94 mol·L-1碳酸鈉溶液，混勻后用蒸餾水定容，760 nm波長下測定吸光值，通過沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算總酚含量。

總黃酮含量測定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法[13]，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制總黃酮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.113 2x-0.005 4(R2=0.998 7)，其中x為蘆丁質(zhì)量濃度(mg·mL-1)，y為吸光度值。精密吸取1 mL的醇提液，再依次加入0.4 mL的0.73 mol·L-1亞硝酸鈉溶液、0.4 mL的0.47 mol·L-1硝酸鋁溶液、4 mL的1 mol·L-1氫氧化鈉、0.2 mL的60%乙醇混勻振蕩12 min，510 nm波長下測定吸光值，通過蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算總黃酮含量。

1.4.3 HPLC法檢測樣品中酚酸類物質(zhì)含量

取1 mL上述制備的醇提液過0.45 μm有機(jī)濾膜后進(jìn)樣。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制：精密稱取槲皮素、阿魏酸、綠原酸、山奈酚、異鼠李素5種標(biāo)準(zhǔn)品，用60%甲醇制成1 mg·mL-1的單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取各單標(biāo)溶液1 mL置于10 mL容量瓶中，加60%甲醇至刻度，搖勻，制成各標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品混合儲備液0.20，0.50，1.00，2.00，4.00，6.00，8.00 mL置于10 mL容量瓶，加60%甲醇至刻度，制成2，5，10，20，40，60，80 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

色譜條件：流動相為乙腈(A)和0.5%甲酸溶液(B)；流速為1 μL·min-1；柱溫為35 ℃；檢測波長：280 nm，進(jìn)樣量：20 μL。梯度洗脫程序：0～5 min：5%～14%(B)；5～20 min：14%～21%(B)；20～27 min：21%～27%(B)；27～40 min：27%～42%(B)；40～48 min：42%～65%(B)；48～54 min：65%～35%(B)；54～60 min：35%～14%(B)；60～62 min：5%～14%(B)。根據(jù)樣品HPLC色譜圖保留時間及紫外吸收光譜定性，定量分析根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的濃度與峰面積之間的比例關(guān)系計(jì)算。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 LED光質(zhì)配比對兩種金線蓮生長的影響

由表1可知，不同光質(zhì)對金線蓮的株高、葉長、葉寬具有顯著影響，金線蓮的莖粗在不同光質(zhì)之間無明顯差異。兩種金線蓮株高在R2B1下最高，白光下最低，R1B2介于兩者之間且3組光質(zhì)之間存在顯著性差異，不同光質(zhì)下兩種金線蓮株高的順序?yàn)镽2B1>R1B2>W。兩種金線蓮葉長在復(fù)合光R2B1下最高，白光下最低，但R1B2與白光無顯著性差異，R2B1對金線蓮的葉長有顯著的促進(jìn)作用。不同光質(zhì)對兩種金線蓮的葉寬、鮮重的影響與株高一致，在R2B1下最高，白光下最低。綜合而言，復(fù)合光R2B1下金線蓮的株高、葉長、葉寬、鮮重均達(dá)到最大值，對金線蓮株高、葉片生長、生物量積累均具有較顯著的促進(jìn)作用。

表1 不同LED光質(zhì)對兩種金線蓮生長的影響

2.2 LED光質(zhì)配比對兩種金線蓮葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白、總酚、總黃酮、游離氨基酸的影響

由表2可知，R2B1下兩種金線蓮組培苗的葉綠素含量最高，R1B2下葉綠素含量最低，兩種金線蓮葉綠素含量的順序均為R2B1>W>R1B2。其中福建金線蓮中R2B1與白光均顯著高于R1B2，R2B1是R1B2的近2倍，R2B1與白光之間無明顯差異。臺灣金線蓮中R2B1顯著高于R1B2與白光，R1B2與白光之間無明顯差異。結(jié)果表明對金線蓮組培苗葉綠素積累較有利的光質(zhì)配比是R2B1。

不同光質(zhì)下兩種金線蓮中可溶性糖、總酚、總黃酮含量變化趨勢不同，可溶性蛋白和游離氨基酸含量變化趨勢相同。3種光質(zhì)處理下可溶性糖含量在福建金線蓮中沒有顯著差異，在臺灣金線蓮中復(fù)合光均大于白光，順序?yàn)镽1B2>R2B1>W，R1B2較R2B1和白光可溶性糖含量分別提高了33%和132%。R1B2下臺灣金線蓮可溶性糖含量顯著增加。兩種金線蓮的可溶性蛋白含量均在R1B2下達(dá)到最低，其中R2B1和白光的福建金線蓮較R1B2分別提高了54%和64%，R2B1和白光的臺灣金線蓮較R1B2分別提高了72%和62%。結(jié)果表明R1B2對于兩種金線蓮可溶性蛋白含量的積累可能具有抑制作用。

3種光質(zhì)下總酚含量在臺灣金線蓮中沒有顯著差異，在福建金線蓮中復(fù)合光均大于白光，順序?yàn)镽1B2>R2B1>W，R2B1和R2B1相比于白光總酚含量分別提高了24%和32%。結(jié)果表明復(fù)合光R2B1和R2B1均有利于福建金線蓮中總酚含量的積累。3種光質(zhì)處理下總黃酮含量福在福建金線蓮中差異不顯著，在臺灣金線蓮中復(fù)合光均大于白光且順序?yàn)镽1B2>R2B1>W，R2B1和R1B2組相比于白光總黃酮含量分別提高了81%和162%。結(jié)果表明R1B2較R2B1更能促進(jìn)臺灣金線蓮總黃酮含量的積累。3種光質(zhì)處理下的兩種金線蓮游離氨基酸總量均無顯著差異。

表2 不同LED光質(zhì)對兩種金線蓮葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白、總酚、總黃酮、游離氨基酸含量的影響

2.3 LED光質(zhì)配比對金線蓮5種酚酸類化合物含量的影響

對單一對照品溶液和混合對照品溶液的色譜圖及其質(zhì)譜圖進(jìn)行比較，確定色譜峰1，2，3，4，5(圖1-A)分別為綠原酸、阿魏酸、槲皮素、山奈酚、異鼠李素。根據(jù)混合對照品溶液和金線蓮樣品溶液中對應(yīng)色譜峰的保留時間(圖1-B)，確定金線蓮醇提物含有綠原酸、阿魏酸、槲皮素、山奈酚、異鼠李素。

由表3可知，復(fù)合光下的兩種金線蓮的酚酸類物質(zhì)總量均高于白光，且順序均為R2B1>R1B2>W，其中福建金線蓮的R2B1和R1B2相比于白光分別提高了53%和17%，臺灣金線蓮的R2B1和R1B2相比于白光分別提高了63%和16%。R2B1下兩種金線蓮的酚酸類物質(zhì)總量均達(dá)到最高。

兩種金線蓮的異鼠李素、阿魏酸和山奈酚含量R2B1均顯著高于R1B2和W，其中福建金線蓮的異鼠李素含量R2B1和R1B2相比于白光分別提高了52%和17%，山奈酚含量R2B1和R1B2相比于白光分別提高了81%和13%，阿魏酸含量R2B1和R1B2相比于白光分別提高了99%和69%。臺灣金線蓮的異鼠李素含量R2B1和R1B2相比于白光分別提高了50%和30%，山奈酚含量R2B1和R1B2相比于W分別提高了85%和22%，阿魏酸含量R2B1和R1B2相比于白光分別提高了128%和40%。數(shù)據(jù)表明R2B1能顯著促進(jìn)兩種金線蓮中異鼠李素、山奈酚和阿魏酸含量的積累。而3種光質(zhì)處理下兩種金線蓮的槲皮素含量均無顯著差異。不同金線蓮的綠原酸含量對光質(zhì)的敏感程度不同，福建金線蓮的綠原酸含量在3種光質(zhì)處理下無明顯變化，臺灣金線蓮R2B1組的綠原酸含量相比于R1B2組和白光且均提高了48%。

RT/min

表3 不同光質(zhì)對金線蓮酚酸類物質(zhì)含量的影響 (μg·g-1 FW)

3 討論

光在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，光質(zhì)能通過光敏色素直接影響植物的生長發(fā)育以及代謝物質(zhì)的積累。植物對光譜的吸收具有特異性，紅光和藍(lán)光能形成與植物光合作用的形態(tài)建成基本相同的光譜[20]，紅藍(lán)組合光可以代替連續(xù)光譜進(jìn)行人工光植物栽培[21]。研究發(fā)現(xiàn)LED紅光有利于植物莖的伸長，LED藍(lán)光會使植株粗短，葉片面積和數(shù)量均較高，葉片葉綠素含量較高[15]。陳星星等[22]研究發(fā)現(xiàn)R4B1處理下白掌組培苗的葉長、葉幅、整株鮮重、地上部和地下部鮮重均達(dá)到最大值。王麗偉等[23]研究發(fā)現(xiàn)紅藍(lán)組合光較紅藍(lán)單色光更有利于番茄幼苗的生長發(fā)育，R2B1處理下植株干物質(zhì)量、葉綠素含量和光合性能均顯著提高，可能是紅、藍(lán)光的互補(bǔ)加性效應(yīng)。本研究中，R2B1顯著提高了金線蓮的株高、葉長、葉寬和鮮重，說明R2B1對金線蓮的生長發(fā)育具有促進(jìn)作用。

光質(zhì)對植物的代謝物質(zhì)有較大的調(diào)控作用。R2B1下兩種金線蓮的葉綠素含量最高，說明R2B1復(fù)合光對金線蓮組培苗葉綠素的積累也具有促進(jìn)作用，這與李杰等[24]的研究結(jié)果一致。陳文昊等[25]發(fā)現(xiàn)與自然光相比，紅藍(lán)光處理生菜的可溶性糖含量較高，紅藍(lán)復(fù)合光的綜合效應(yīng)比單色的紅光或藍(lán)光更有利于可溶性糖在生菜葉片中累積。本研究中不同品種的金線蓮在相同光質(zhì)處理下可溶性糖含量呈現(xiàn)出一定的差異性。R1B2復(fù)合光能促進(jìn)臺灣金線蓮中可溶性糖含量的積累，說明適當(dāng)增加混合光中紅光或藍(lán)光的比例，有利于增加臺灣金線蓮可溶性糖含量。不同光質(zhì)配比下福建金線蓮的可溶性糖含量無顯著差異，可能該品種的可溶性糖對光質(zhì)不敏感。尚文倩等[26]指出單色藍(lán)光有利于鐵皮石斛可溶性蛋白的合成。本研究中，R1B2下兩種金線蓮的可溶性蛋白含量均達(dá)到最低，說明R1B2復(fù)合光對于兩種金線蓮可溶性蛋白含量的積累可能存在抑制作用。

藍(lán)光下可誘導(dǎo)植物的酚類代謝產(chǎn)物含量增加，藍(lán)光促進(jìn)類黃酮代謝關(guān)鍵酶(PAL)活性，從而提高酚類物質(zhì)的含量[27]。陳文昊等[25]報道指出LED紅藍(lán)單色或復(fù)合光源下生菜總酚的含量較自然光下要高。本研究中R2B1和R2B1下福建金線蓮中總酚含量均比白光高，說明紅藍(lán)復(fù)合光質(zhì)對福建金線蓮的總酚含量的積累有促進(jìn)作用。而不同光質(zhì)配比下臺灣金線蓮的總酚含量無明顯差異，可能與臺灣金線蓮本身的生長特性有關(guān)。肖開前等[28]研究發(fā)現(xiàn)通過單色藍(lán)光誘導(dǎo)可顯著增加組培金線蓮中總黃酮的含量。雒曉鵬等[29]報道指出藍(lán)光促進(jìn)苦蕎中總黃酮合成。本試驗(yàn)中，R1B2處理下臺灣金線蓮的總黃酮含量最高，說明藍(lán)光占比多的R1B2復(fù)合光能促進(jìn)臺灣金線蓮總黃酮含量的積累。而不同光質(zhì)配比下福建金線蓮的總黃酮含量無明顯差異，兩種金線蓮中總黃酮的合成積累對光處理的響應(yīng)不同，可能是兩種金線蓮中調(diào)節(jié)總黃酮合成的關(guān)鍵酶基因表達(dá)受光影響的程度不同，其中涉及到的光信號機(jī)制有待進(jìn)一步研究。王麗偉等[23]研究發(fā)現(xiàn)單色藍(lán)光下番茄幼苗中游離氨基酸總量較高。而在本研究中，3種光質(zhì)下兩種金線蓮的游離氨基酸總量均無明顯差異，需要進(jìn)一步探究不同光質(zhì)下金線蓮的具體氨基酸的含量變化。肖開前等[28]研究指出藍(lán)光相比于紅光對金線蓮的槲皮素、異鼠李素、山奈酚3種黃酮類物質(zhì)有著不同程度的促進(jìn)作用。本研究中，R2B1處理下兩種金線蓮的槲皮素、異鼠李素、山奈酚、阿魏酸、綠原酸含量均為最高，說明紅光占比多的復(fù)合光處理有利于金線蓮的酚酸類和黃酮類物質(zhì)含量的積累，這與汪玉潔等[30]報道的紅光比例大的光質(zhì)組合有利于芽苗菜酚類、類黃酮等抗氧化物質(zhì)的積累結(jié)果一致。

綜上所述，R1B2處理能促進(jìn)臺灣金線蓮中可溶性糖、總黃酮含量的積累，但對兩種金線蓮的生長以及可溶性蛋白含量的積累均有顯著抑制作用。R2B1處理有利于兩種金線蓮組培苗鮮干重、葉綠素、黃酮類以及酚酸類次生代謝產(chǎn)物的合成。綜上，R2B1復(fù)合光用于金線蓮組培苗生長的效果更好，這對金線蓮的組培生產(chǎn)具有重要意義。但是臺灣金線蓮和福建金線蓮在可溶性糖、總酚、總黃酮的含量變化不完全一致，其調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。