基于核轉(zhuǎn)錄因子κB信號通路探討益氣固表丸治療慢性阻塞性肺疾病的療效研究

羅建江，張艷麗，劉珊

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是臨床常見的一種慢性呼吸系統(tǒng)疾病，以氣道、肺實質(zhì)和肺血管慢性炎癥為主要特征，患病率較高，且病情易反復(fù)加重，嚴(yán)重影響患者的勞動能力和生活質(zhì)量［1-2］。炎癥是COPD的主要機制［3］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，可黏附于支氣管黏膜的上皮細(xì)胞，進而刺激中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞釋放白介素（interleukin，IL）-1、IL-6、腫瘤壞死因 子 α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等細(xì)胞因子，激活信號通路釋放各種自由基、水解酶等，進而導(dǎo)致肺損傷，造成炎癥級聯(lián)反應(yīng)［4-5］。既往研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方制劑——益氣固表丸可有效降低COPD患者IL-6、TNF-α水平［6］。核因子激活的核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear transcription factor κB，NF-κB）是IL-6和 TNF-α基因的調(diào)控信號途徑，但LPS是如何通過NF-κB信號通路來誘導(dǎo)COPD尚不明確?；诖耍狙芯恐荚谔接懸鏆夤瘫硗柰ㄟ^阻斷LPS/NF-κB信號通路來抑制COPD的分子機制，以期為益氣固表丸治療COPD提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 2017年7月—2018年6月。

1.2 實驗動物 本實驗選取了8周齡的SPF級SD雄性大鼠48只，平均體質(zhì)量（190±10）g，均于2017年7月購于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物質(zhì)量合格證書：SCXK（新）2016-0002。飼養(yǎng)環(huán)境：模擬自然晝夜條件，室溫20～25 ℃，相對濕度為50%～65%，環(huán)境安靜，定時換窩。通過氣管滴注彈性蛋白酶、LPS以建立COPD大鼠模型，并通過檢查其炎性因子和肺功能進一步確定建模是否成功。按照隨機數(shù)字表法將所有COPD大鼠分為空白對照組、模型組、益氣固表丸高劑量組、益氣固表丸低劑量組，每組12只。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.3 試劑與儀器 試劑：益氣固表丸（新疆制藥廠生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：20121212）購于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中心藥房；LPS購于美國Sigma公司；IL-6、TNF-α均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測，試劑盒購于上海聯(lián)科生物醫(yī)藥有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物購于生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；IκBα、p-IκBα抗體均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。儀器：多功能酶標(biāo)儀購于Bio-RadBio-Rad（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品）有限公司；實時熒光定量PCR儀購于Bio-Rad有限公司；化學(xué)發(fā)光成像儀系統(tǒng)（Chemiscope 3000）購于上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.4 模型制備及治療 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，氣道滴注彈性蛋白酶聯(lián)合LPS以建立COPD大鼠模型［7］，具體方法如下：大鼠均予以10%水合氯醛進行腹腔麻醉，而后模型組、益氣固表丸高劑量組、益氣固表丸低劑量組大鼠均于氣道內(nèi)給予豬胰彈性蛋白酶4.2 U，1周后再氣道滴注LPS 100 μl，1次/10 d，持續(xù)給藥10次。空白對照組大鼠僅于氣道內(nèi)噴相同劑量的0.9%氯化鈉溶液。

確定建模成功后，益氣固表丸高劑量組大鼠給予益氣固表丸200丸+0.9%氯化鈉溶液500 ml進行治療；益氣固表丸低劑量組大鼠給予益氣固表丸100丸+0.9%氯化鈉溶液500 ml進行治療，大鼠均按照1.5 ml∶100 g的比例進行灌胃，2次/d，持續(xù)治療14 d；空白對照組和模型組大鼠則給予相同劑量的0.9%氯化鈉溶液，且采用相同的灌胃頻率處理。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 肺組織病理變化情況 觀察大鼠肺組織病理變化情況。建模后第2天，四組大鼠均予以10%水合氯醛進行腹腔麻醉，而后迅速開胸剝離肺組織，在垂直于支氣管的左側(cè)肺矢狀面最大周徑處取厚約5 mm的肺組織，用10%甲醛溶液固定，制作石蠟組織切片，用蘇木精-伊紅（HE）染色后在顯微鏡下觀察四組大鼠肺組織病理變化情況。

1.5.2 血清TNF-α、IL-6水平 比較四組大鼠血清TNF-α、IL-6水平。抽取四組大鼠血液，4 000 r/min離心10 min（離心半徑6 cm），取上清液，采用ELISA檢測血清TNF-α、IL-6水平，具體操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進行，具體操作步驟如下：（1）準(zhǔn)備好所有需要的試劑及工作濃度標(biāo)準(zhǔn)品。（2）將不需要的板條拆卸下來，放回裝有干燥劑的鋁箔袋，重新封口。（3）加入300 μl洗液靜置、浸泡30 s，棄掉洗液后，在吸水紙拍干微孔板；洗板完成后，立即使用微孔板，不要讓微孔板干燥。（4）標(biāo)準(zhǔn)孔加入100 μl 2倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔加入100 μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。（5）樣本孔加入100 μl血清樣本。（6）每孔加入50 μl稀釋的檢測抗體。保證步驟4、5、6連續(xù)加樣，不間斷。加樣過程在15 min內(nèi)完成。（7）使用封板膜封板。300 r/min振蕩，室溫孵育2 h。（8）棄掉液體，每孔加入300 μl洗液洗板，洗滌6次。每次洗板在吸水紙上拍干。（9）每孔加入100 μl稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素。（10）使用新的封板膜封板。300 r/min振蕩，室溫孵育45 min。（11）重復(fù)步驟8。（12）每孔加入100 μl TMB底物顯色試劑盒，避光，室溫孵育5～30 min。（13）每孔加入100 μl終止液。（14）在30 min內(nèi)，使用酶標(biāo)儀進行雙波長檢測，測定450 nm最大吸收波長和570 nm參考波長下的OD值。校準(zhǔn)后OD值為450 nm處OD值與570 nm處OD值的差。

1.5.3 RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相對表達量 比較四組大鼠RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相對表達量。麻醉處死大鼠后，快速采集肺組織，組織樣本經(jīng)液氮研磨后取100 mg置于離心管中，加入1 ml TRLZOL將組織吹打、混勻，室溫放置15 min以上；而后加入200 μl的氯仿，顛倒混勻后室溫放置2～5 min，再在4 ℃環(huán)境下以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心處理15 min（離心半徑10 cm），而后取上清液置于一個新的離心管中，加入等體積的異丙醇混勻，并于-20 ℃環(huán)境下靜置30 min以上，再在4 ℃環(huán)境下以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心處理15 min（離心半徑10 cm），倒掉上清液；加入75%乙醇，使沉淀漂浮起來洗滌；再在4 ℃環(huán)境下以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心處理15 min（離心半徑10 cm），倒掉上清液，吸盡液體，晾干；用無RNA、DNA酶的水溶解沉淀。進行1.8%瓊脂糖凝膠電泳，150 V，10 min，電泳完畢后應(yīng)用凝膠成像儀進行觀察。剩余RNA置于-80 ℃環(huán)境下保存或直接反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進行實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（rRT-PCR），實時熒光定量PCR引物序列見表1，觀察四組大鼠RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相對表達量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.5.4 IκBα、p-IκBα蛋白相對表達量 采用Western blotting法檢測四組大鼠IκBα、p-IκBα蛋白相對表達量。麻醉處死大鼠后，快速提取肺組織，勻漿，經(jīng)液氮研磨后取約100 mg的肺組織加入到預(yù)冷的1.5 ml離心管中，然后加入400 μl RIPA裂解液（已加入蛋白酶抑制劑和廣譜磷酸酶抑制劑）充分混勻，在4 ℃環(huán)境下放置60 min后，12 000 r/min離心15 min（離心半徑10 cm），取上清液，提取白蛋白。用蛋白質(zhì)定量法測定蛋白濃度。將已電泳后的聚丙烯酰胺凝膠用考馬斯亮藍染色60 min。蛋白樣本中加入適量十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑loading buffer（含β-巰基乙醇），100 ℃沸水中加熱5 min，使蛋白充分變性，12 000 r/min離心5 min（離心半徑10 cm），取上清液備用。配制12%、15%分離膠與5%濃縮膠，依次進行制膠、加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗撫育、二抗撫育、曝光，顯影、定影。結(jié)果掃描后，經(jīng)光密度分析系統(tǒng)計算灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠肺組織病理變化情況 HE染色結(jié)果顯示，空白對照組大鼠肺組織大體結(jié)構(gòu)基本正常；模型組大鼠肺組織肺泡壁增生、增厚，伴細(xì)胞增大、增多，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤，部分肺泡萎縮或擴張，支氣管上皮細(xì)胞部分增生及缺損，黏膜下大量慢性炎癥細(xì)胞浸潤，有較多出血、壞死區(qū)；與模型組相比，益氣固表丸低劑量組大鼠肺組織改善并不明顯，而益氣固表丸高劑量組大鼠肺泡增生、增厚，支氣管病變有所好轉(zhuǎn)，見圖1。

圖1 四組大鼠肺組織病理變化情況Figure 1 Pathological changes of lung tissue in the four groups of rats

2.2 四組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 四組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組、益氣固表丸低劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6水平及益氣固表丸高劑量組血清TNF-α水平高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；益氣固表丸高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6水平低于模型組及益氣固表丸低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 四組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較（±s，pg/ml，n=12）Table 2 Comparison of serum levels of TNF-α，IL-6 in the four groups of rats

表2 四組大鼠血清TNF-α、IL-6水平比較（±s，pg/ml，n=12）Table 2 Comparison of serum levels of TNF-α，IL-6 in the four groups of rats

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與益氣固表丸低劑量組比較，cP＜0.05；TNF-α=腫瘤壞死因子α，IL-6=白介素6

組別 TNF-α IL-6空白對照組 1.52±1.09 5.02±3.43模型組 9.13±1.66a 37.64±13.06a益氣固表丸低劑量組 9.19±1.61a 24.17±8.31a益氣固表丸高劑量組 4.14±1.78abc 5.17±3.94bc F值 35.923 22.994 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 四組大鼠RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相對表達量比較 四組大鼠RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組、益氣固表丸低劑量組大鼠RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相對表達量高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；益氣固表丸高劑量組大鼠RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相對表達量低于模型組，RelA（p65）基因相對表達量低于益氣固表丸低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 四組大鼠RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相對表達量比較（±s，n=12）Table 3 Comparison of the gene relative expression of RelA（p65） and NF-κB1（p53） in the four groups of rats

表3 四組大鼠RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相對表達量比較（±s，n=12）Table 3 Comparison of the gene relative expression of RelA（p65） and NF-κB1（p53） in the four groups of rats

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與益氣固表丸低劑量組比較，cP＜0.05

組別 RelA（p65） NF-κB1（p53）空白對照組 1.02±0.22 1.01±0.11模型組 1.66±0.14a 1.76±0.19a益氣固表丸低劑量組 1.48±0.25a 1.59±0.31a益氣固表丸高劑量組 1.21±0.21bc 1.19±0.16b F值 10.003 17.249 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.4 四組大鼠IκBα、p-IκBα蛋白相對表達量比較四組大鼠IκBα蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。四組大鼠p-IκBα蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組、益氣固表丸低劑量組大鼠p-IκBα蛋白相對表達量高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；益氣固表丸高劑量組大鼠p-IκBα蛋白相對表達量低于模型組及益氣固表丸低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4、圖2。

圖2 Western blotting法檢測IκBα、p-IκBα蛋白相對表達量的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Figure 2 SDS-PAGE of relative expression of IκBα and p-IκBα protein detected by Western blotting

表4 四組大鼠IκBα、p-IκBα蛋白相對表達量比較（±s，n=12）Table 4 Comparison of the protein relative expression of IκBα and p-IκBα in the four groups of rats

表4 四組大鼠IκBα、p-IκBα蛋白相對表達量比較（±s，n=12）Table 4 Comparison of the protein relative expression of IκBα and p-IκBα in the four groups of rats

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與益氣固表丸低劑量組比較，cP＜0.05

組別 IκBα蛋白相對表達量p-IκBα蛋白相對表達量空白對照組 0.54±0.04 0.31±0.07模型組 0.56±0.01 0.74±0.04a益氣固表丸低劑量組 0.56±0.02 0.63±0.10a益氣固表丸高劑量組 0.54±0.04 0.43±0.05bc F值 0.794 24.935 P值 0.530 ＜0.001

3 討論

COPD氣道慢性炎癥發(fā)生的中心環(huán)節(jié)是炎癥細(xì)胞局部趨化、激活以及大量相關(guān)炎性遞質(zhì)的釋放［8］，長期反復(fù)發(fā)作可導(dǎo)致患者肺損傷及肺功能惡化，最終引發(fā)呼吸衰竭甚至死亡。研究表明，西藥雖可控制COPD患者現(xiàn)有癥狀、緩解急性加重癥狀，但均不能逆轉(zhuǎn)肺損傷［9］，目前傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療COPD逐漸得到重視。

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，COPD屬“肺脹”范疇。COPD是本虛標(biāo)實，日久肺氣虧虛，病及脾腎，故益氣固表、健脾燥濕是其主要治療原則。本院研制的復(fù)方制劑——益氣固表丸是由茯苓、陳皮、（炒）白術(shù)、法半夏、浮小麥、薏苡仁、蜜枇杷葉、黃芩、防風(fēng)、紫蘇子、伊貝母、黨參、蜜款冬花13味中藥構(gòu)成的丸劑，具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)機體免疫力的作用，能有效緩解COPD患者喘、咳、痰、脹等不適，減少患者急性加重，降低再住院率［10-11］。

COPD的主要致病菌是革蘭陰性菌［12］。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，具有廣泛生理活性，可與巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞膜上的CD14/TLR4/MD2復(fù)合物結(jié)合并通過MyD88/TAK1等激活NF-κB通路，促進細(xì)胞分泌促炎因子、一氧化氮（NO）等多種細(xì)胞因子，而彈性蛋白酶作用于氣道彈性蛋白時可激活肺泡巨噬細(xì)胞，引起炎性因子表達增加［13］。本研究在建模過程中不僅對大鼠氣管滴注彈性蛋白酶，還結(jié)合LPS反復(fù)刺激氣道產(chǎn)生慢性炎癥反應(yīng)，從而成功建立COPD大鼠模型，結(jié)果顯示，空白對照組大鼠肺組織大體結(jié)構(gòu)基本正常；模型組大鼠肺組織肺泡壁增生、增厚，伴細(xì)胞增大、增多，間質(zhì)較多慢性炎癥細(xì)胞浸潤，部分肺泡萎縮或擴張，支氣管上皮細(xì)胞部分增生及缺損，黏膜下大量慢性炎癥細(xì)胞浸潤，較多出血、壞死區(qū)，表明COPD大鼠建模成功。另外，益氣固表丸低劑量組較模型組肺組織病變差異不明顯；益氣固表丸高劑量組與模型組比較，肺泡增生、增厚及間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤程度均有所改善，肺泡萎縮及肺泡壁斷裂、擴張程度均減輕，支氣管病變有所好轉(zhuǎn)，表明高劑量益氣固表丸可有效減輕COPD大鼠肺組織損傷程度，改善炎癥細(xì)胞浸潤程度。本研究結(jié)果還顯示，模型組、益氣固表丸低劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6水平及益氣固表丸高劑量組血清TNF-α水平高于空白對照組；益氣固表丸高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6水平低于模型組及益氣固表丸低劑量組，表明益氣固表丸高劑量治療較低劑量可更有效地減輕COPD大鼠炎癥反應(yīng)。金晶等［14］研究表明，益氣固表丸可抑制JKA/STAT通路及其下游炎癥蛋白的活化與表達，改善COPD大鼠肺內(nèi)炎癥反應(yīng)。另有研究表明，益氣固表丸可改善肺脾氣虛型COPD穩(wěn)定期患者機體免疫功能［15］，但其具體機制尚未明確。

NF-κB是人體重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，是由多個多肽亞單位組成的蛋白家族［16］。RelA（p65）、IκB、p-IκB皆是NF-κB家族的重要成員。當(dāng)無活化刺激信號時，RelA可與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的IκB結(jié)合形成復(fù)合物；支氣管上皮細(xì)胞在LPS刺激下釋放的炎性因子如IL-1、IL-6可激活NF-κB通路，IκB激酶復(fù)合物IKK可使IκB磷酸化，生成p-IκB，進而激活RelA/IκB復(fù)合物使其分離，游離的RelA進入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)相關(guān)炎性因子表達［17］。本研究結(jié)果顯示，模型組、益氣固表丸低劑量組大鼠RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相對表達量高于空白對照組；益氣固表丸高劑量組大鼠RelA（p65）、NF-κB1（p53）基因相對表達量低于模型組，RelA（p65）基因相對表達量低于益氣固表丸低劑量組；模型組、益氣固表丸低劑量組大鼠p-IκBα蛋白相對表達量高于空白對照組；益氣固表丸高劑量組大鼠p-IκBα蛋白相對表達量低于模型組及益氣固表丸低劑量組，表明益氣固表丸高劑量治療可更有效地降低COPD大鼠RelA（p65）基因相對表達量及p-IκBα蛋白相對表達量，推測益氣固表丸可通過抑制NF-κB信號通路中p-IκBα來阻斷RelA（p65）進入細(xì)胞核激活基因的轉(zhuǎn)錄，減少炎性遞質(zhì)釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)。研究表明，COPD患者IL-1、IL-6與NF-κB基因相對表達量呈正相關(guān)，表明NF-κB與炎性因子可相互影響而加速局部炎癥的發(fā)生發(fā)展［18-19］，本研究結(jié)果與之一致。

綜上所述，高劑量益氣固表丸可通過調(diào)控COPD大鼠體內(nèi)的NF-κB信號通路及其下游RelA（p65）基因相對表達量、p-IκBα蛋白相對表達量而降低炎性細(xì)胞水平，進而減輕氣道炎癥反應(yīng)。

作者貢獻：羅建江進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，研究的實施與可行性分析，結(jié)果分析與解釋，撰寫論文，進行論文的修訂；劉珊進行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；張艷麗負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。