樟樹MVA途徑基因克隆與表達模式初探

（江西省林業(yè)科學(xué)院 國家林業(yè)和草原局樟樹工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330032）

樟樹Cinnamomum camphora是我國重要的木本精油植物資源之一。枝葉精油是目前樟樹主要的利用部位，具有得率高、主成分突出等優(yōu)點。萜類是樟樹枝葉精油的主要成分，常根據(jù)各主成分含量差異將樟樹劃分為不同化學(xué)類型。其中，橙花叔醇型樟樹精油主成分為橙花叔醇，歸類于倍半萜類化學(xué)型[1-2]。我國樟屬植物中其它倍半萜類化學(xué)型還包括金合歡醇型、γ-欖香烯型、布萊醇型、β-蓽澄茄油烯型與β-石竹烯型等[3-4]。不同化學(xué)型樟屬精油用途各異，橙花叔醇型精油主要為高級香水的調(diào)香劑和定香劑[5]。

植物化學(xué)型是指群體中個體間不能通過形態(tài)學(xué)區(qū)分的化學(xué)特性，主要用來描述個體間體內(nèi)化合物特別是次生代謝物特征。倍半萜類化合物為植物主要次生代謝物之一，目前已在自然界中鑒定獲得數(shù)萬種之多。研究顯示，各類倍半萜類化合物皆享有相同的前體物合成路徑即甲羥戊酸途徑（Mevalonate pathway，MVA）。該途徑以2分子乙酰CoA作為啟始反應(yīng)物，通過7步連續(xù)酶促反應(yīng)，最終生成異戊烯基焦磷酸（IPP）與其同分異構(gòu)體二甲烯丙酯焦磷酸（DMAPP）[6-7]。啟始反應(yīng)步驟為2分子乙酰CoA縮合形成乙酰乙酰-CoA，由乙酰乙酰-CoA硫解酶（AACT）催化完成，該酶通常定位于細胞質(zhì)或過氧化物酶體中[7]。3-羥基-3-甲基戊二酰CoA合成酶（HMGS）催化第二步反應(yīng)形成3-羥基-3-甲基戊二酰CoA，隨后經(jīng)HMG-CoA 還原酶（HMGR）還原形成甲羥戊酸[7]。甲羥戊酸為相關(guān)合成中樞支點，可進入多種物質(zhì)合成代謝通路。隨后經(jīng)連續(xù)兩步磷酸化反應(yīng)生成甲羥戊酸-5-焦磷酸（PP-MVA），所涉及的兩個催化激酶分別為甲羥戊酸激酶（MK）和磷酸甲羥戊酸激酶（PMK）[8]。甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶（MVD）進一步將PP-MVA脫羧形成類異戊二烯共同前體物IPP[6]。最終IPP在異構(gòu)酶（IDI）的作用下，異構(gòu)形成另一共同前體物DMAPP，IDI同時可調(diào)控二者含量相對平衡[9]。

植物MVA途徑自1960年代被發(fā)現(xiàn)以來，已在多種植物中開展了深入研究?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)MVA途徑存在關(guān)鍵限速酶，且通過轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平等對多個編碼催化酶基因進行多層次調(diào)控。近幾年樟樹MVA途徑研究雖有所涉及，但整條途徑基因克隆及其表達調(diào)控模式研究還沒見報道。橙花叔醇型樟樹作為樟屬倍半萜類中最常見的化學(xué)類型，以其為研究材料，開展倍半萜生物合成相關(guān)研究，可為后續(xù)樟屬良種選育和化學(xué)型形成機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

橙花叔醇型樟樹、桉葉油素型樟樹與黃樟油素型巖桂C.pauciflorum采自江西省林業(yè)科學(xué)院樟屬植物基因庫。樟樹MVA途徑基因序列參考國家林業(yè)和草原局樟樹工程技術(shù)中心完成的樟樹5種化學(xué)類型（芳樟醇型、桉葉油素型、樟腦型、龍腦型與橙花椒醇型）葉組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[10]、基因組數(shù)據(jù)和黃樟C.porrectum葉組織全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[11]。

Total RNA提取試劑盒購自北京華越洋；2×Phanta Master Mi（P511-01）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，R211-01）、熒光定量PCR試劑盒（ChamQ SYBR qPCR Master Mix，Q311-02）、大腸桿菌感受態(tài)細胞TOP10與瓊脂糖凝膠回收試劑盒等均購自南京諾唯贊；PMD18-T克隆試劑盒購自TaKaRa公司。有機溶劑環(huán)己烷分析純與癸酸乙酯購自阿拉丁。實驗室常規(guī)試劑和培養(yǎng)基購自上海生工；克隆測序由上海生工完成。

1.2 方 法

1.2.1 MVA途徑系列基因克隆與生物信息學(xué)分析

以模式植物擬南芥MVA系列基因序列作為查詢序列，運行本地blast X軟件，比對樟樹葉組織轉(zhuǎn)錄組和近源種黃樟葉組織全長轉(zhuǎn)錄組；根據(jù)序列相似性篩選樟樹MVA途徑系列基因Contigs，進一步借助序列拼接軟件CAP3完成樟樹MVA途徑系列基因全長編碼區(qū)電子克隆。

采集橙花叔醇型樟樹花、葉、根與小枝等組織速凍于液氮中，提取各組織total RNA。DNAase I消化后去除殘留DNA，混合均勻后取50 ng total RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。基于樟樹葉組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、設(shè)計特異引物（表1），以上述混合cDNA為模板，采用PCR法特異擴增樟樹MVA系列基因。電泳檢測PCR產(chǎn)物，切取與各目標產(chǎn)物大小相當?shù)臄U增條帶，回收后與克隆載體連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。篩選陽性克隆，送至上海生工測序，獲得各系列基因編碼區(qū)序列。比對樟樹基因組數(shù)據(jù)，預(yù)測各基因內(nèi)含子與外顯子組成結(jié)構(gòu)。

表1 所有引物信息Table 1 List of all primers

利用多種在線軟件TargetP 1.1 ( http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)、ChloroP 1.1 ( http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)、MitoProt ( http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html)和PTS1 ( http://www.peroxisomedb.org/diy_PTS1.html)等預(yù)測各系列基因編碼蛋白亞細胞的定位情況。

1.2.2 橙花叔醇型樟樹各組織精油提取與成分分析

2018年4月，采集5株橙花叔醇型樟樹花各1 g，7月采集5株橙花叔醇型樟樹其它組織各1 g。將新鮮組織于液氮中研磨，后轉(zhuǎn)移至10 mL玻璃試管中，利用有機溶劑萃取法提取精油。有機溶劑為5 mL環(huán)己烷分析純，添加100 μg癸酸乙酯作為內(nèi)標。研磨后組織粉末于環(huán)己烷溶液中浸泡12 h，之后4 000 r/min離心5 min，取上清液，重復(fù)2次。過濾除雜，取500 μL液體轉(zhuǎn)移至進樣瓶之中，利用shimadzu氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）進行精油成分分析。統(tǒng)計整理各成分的相對含量，根據(jù)內(nèi)標癸酸乙酯含量和進樣體積折算各成分的絕對含量。

載氣為He，載氣流速1.0 mL/min，采用分流進樣，分流比20∶1。氣相條件（GC）：進樣口溫度280℃。升溫程序：初始柱溫50℃保持2 min，3℃/min升溫至180℃保持2 min，再以8℃/min升溫至240℃保持5 min，共運行60 min。質(zhì)譜條件（MS）：接口溫度260℃，離子源溫度180℃，掃描范圍（m/z）50～620。

1.2.3 MVA途徑系列基因組織表達特異性分析

2019年4月，分別采集橙花叔醇型樟樹葉、葉柄、花、花梗、小枝、樹皮與根等7種鮮嫩組織，提取total RNA。以Actin基因作為內(nèi)參，采用熒光定量PCR方法（qRT-PCR）檢測橙花叔醇型樟樹各組織中MVA系列基因相對表達量。qRT-PCR引物見表1，反應(yīng)在Bio-RAD C1000 TM Thermal Cycler 熒光定量PCR儀上完成。反應(yīng)體系總體積20 μL，包括cDNA 50 ng、2×SYBR Green qPCR 10 μL、10 mmol/L的正反向引物各0.3 μL，ddH2O補足至20 μL。反應(yīng)程序為95℃ 2 min；95℃ 15 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s；40個循環(huán)，添加溶解曲線；每個樣品重復(fù)3次。參照2-△△CT方法計算各基因的相對表達量[12]。

1.2.4 不同化學(xué)型樟屬植物葉組織中MVA途徑系列基因表達比較分析

本實驗室尚未收集到葉精油主成分為苯丙素類化合物的樟樹化學(xué)型。樟屬近源種巖桂葉組織富含黃樟油素，故作為苯丙素類化學(xué)型代表引入本次分析。桉葉油素型樟樹葉精油富含單萜類化合物，在本節(jié)分析中作為單萜類化學(xué)型代表。

課題組于2018年7月分別采集橙花叔醇型樟樹、桉葉油素型樟樹與黃樟油素型巖桂各3株新鮮葉組織1 g，提取精油并進行成分分析，方法同1.2.2。于2019年4月采集上述單株鮮嫩葉組織，提取total RNA。以Actin基因作為內(nèi)參，采用qRTPCR檢測MVA系列基因在樟屬植物不同化學(xué)型葉組織的表達情況。具體引物見表1，方法同1.2.3。

1.2.5 橙花叔醇型樟樹葉精油倍半萜含量年變化統(tǒng)計與分析

樟樹每年2—3月開始萌發(fā)新葉，來年2—3月落葉。2018—2019年，隔月采集小群體橙花叔醇型樟樹一個生長周期內(nèi)（即3、5、7、9、11月至來年1月份）鮮葉各1 g。利用有機溶劑萃取精油，通過GC-MS分析各成分含量，方法同1.2.2。統(tǒng)計各單株葉精油倍半萜含量年平均數(shù)并以此為基數(shù)，計算每月倍半萜含量并與之比值作圖，分析小群體各單株鮮葉精油倍半萜含量的年變化情況。

1.2.6 不用時令下橙花叔醇型樟樹葉組織MVA途徑系列基因表達變化分析

根據(jù)1.2.5分析結(jié)果，從小群體中挑選6株代表性單株作為本節(jié)實驗材料。于2019年3月與7月分別采集新葉組織，提取total RNA，檢測MVA途徑系列基因在各單株葉組織中的表達量，qRTPCR方法和引物同1.2.3，并與倍半萜含量相關(guān)聯(lián)，分析其對倍半萜合成的調(diào)控作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 MVA途徑系列基因克隆與生物信息學(xué)分析

以擬南芥MVA途徑系列基因蛋白序列作為查詢種子，在樟樹葉組織轉(zhuǎn)錄組中獲得11個MVA途徑系列同源基因。設(shè)計特異克隆引物，以橙花叔醇型樟樹葉組織cDNA作為模板，PCR擴增樟樹MVA途徑系列基因（圖1a）。PCR產(chǎn)物切膠回收后連接至克隆載體PMD18-T，挑選陽性單克隆、測序。當中AACT、HMGS、HMGR與IDI等4個酶由2個旁系同源基因編碼，其它為單拷貝基因。比對樟樹基因組數(shù)據(jù)，顯示該系列基因由4～13個不等外顯子組成，AACT1與AACT2、HMGS1與HMGS2、HMGR1與HMGR2及IDI1與IDI2等旁系同源基因皆包含相同外顯子數(shù)目，即內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)相同（圖1b）。

圖1 樟樹MVA途徑系列基因克隆與內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.1 PCR cloning and exon-intron structures of the MVA pathway in C.camphora

CcAACT1與CcAACT2序列相似性為86.91%，皆由405個氨基酸殘基組成。催化活性位點（C99、H361與C391）、底物結(jié)合位點（K239與S260）及金屬離子結(jié)合位點（A256、G257與A259）等都高度保守。C端具有典型的過氧化物酶體定位PTS1-motif (398SAL)，但軟件預(yù)測其可能定位于細胞溶質(zhì)中。CcHMGS1與CcHMGS2序列相似性為86.50%，皆由474個氨基酸殘基組成?；钚晕稽cGlu83、Gly107、Cys120、Ala125及第His247等都高度保守，在線軟件預(yù)測其定位于細胞溶質(zhì)中。CcHMGR1與CcHMGR2序列相似性為78.32%，分別由560和562個氨基酸殘基組成，2個跨膜保守結(jié)構(gòu)域分別位于序列第36～63、34～61和84～107、82～105位，活性位點包括E239、K372、D448和H546等高度保守。MVK、PMK與MVD分別由397、514和423個氨基酸殘基組成，三者N端具有典型 的PTS2-motif即10KIILSGEHA、58DVKVTSPQL與44SVTLDPDHL，但軟件預(yù)測分別定位于細胞溶質(zhì)、過氧化物酶體和過氧化物酶體之中。CcID11與CcIDI2序相似性為73.45%，分別由296和318個氨基酸殘基組成。PTS1-motifs分別位于C端的293～296位和316～318位，軟件預(yù)測二者亞細胞定位多元化，定位于或過氧化物酶體或質(zhì)體或線粒體之中。

2.2 橙花叔醇型樟樹各組織精油分析結(jié)果

有機溶劑萃取5株橙花叔醇型樟樹不同組織精油，經(jīng)GC-MS分析獲得各成分的相對含量，具體結(jié)果見表2?？傆嬭b定獲得30種單萜類化合物、31種倍半萜類化合物和4種苯丙素類化合物。葉、葉柄、花與花梗等4種精油優(yōu)勢成分為倍半萜類化合物，相對含量分別為58.09%～80.71%、50.14%～71.02%、59.61%～78.48%與56.14%～67.15%，皆超過一半。小枝、樹皮精油中優(yōu)勢成分則為單萜類化合物，相對含量分別為37.34%～51.67%與56.33%～78.35%。根的精油優(yōu)勢成分為苯丙素類化合物，相對含量則高達60.22%～75.84%。

表2 樟屬各組織精油成分分析結(jié)果?Table 2 Analysis of essential oil components of Cinnamomum tissues

葉精油50種成分比較顯示，橙花叔醇為第一優(yōu)勢成分，占32.86%～44.39%，其它主要倍半萜成分還包括β-欖香烯、β-石竹烯、a-石竹烯、大根香葉烯D、β-芹子烯、a-芹子烯、橙花叔醇、β-桉葉油醇、石竹烯氧化物與環(huán)氧蛇麻烯II等，合計占據(jù)精油總量的85.00%以上。別香橙烯、γ-馬欖烯、a-布藜烯、a-欖香醇與庫貝醇等5種成分為葉精油獨有。葉柄精油含40種成分，花柄精油含43種成分，橙花叔醇亦為第一優(yōu)勢成分，含量分別為29.29%～37.37%與22.21%～36.43%。花精油含33種成分，無顯著優(yōu)勢成分存在，δ-欖香烯、β-石竹烯、異橙花叔醇、石竹烯氧化物及β-桉葉油醇等成分相對含量占據(jù)精油譜前五位。小枝精油含33種成分，1,8-桉葉油素為第一優(yōu)勢成分，相對含量為22.36%～43.42%。樹皮精油含28種成分，樟腦為第一優(yōu)勢成分，相對含量為29.31%～40.12%。根精油含33種成分，黃樟油素為第一優(yōu)勢成分，相對含量高達59.01%～74.26%。

橙花叔醇型樟樹各組織得油率依次為：根（0.89%～1.19%）、葉（0.37%～0.54%）、葉柄（0.31%～0.42%）、花柄(0.29%～0.35%)、花(0.19%～0.26%)、小枝(0.11%～0.19%)與皮(0.08%～0.15%)。對應(yīng)每100 g組織倍半萜類化合物含量，分別為根107.36～219.60 mg、葉304.94～415.83 mg、葉柄187.56～256.13 mg、花144.26～185.43 mg、小枝24.79～39.63 mg及樹皮13.53～34.71 mg。小枝和樹皮中倍半萜總含量遠遠低于其它組織。本文中將比對質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中相似度低于＜85分的成分歸為未確認成分。

2.3 樟樹MVA途徑部分基因表達具有組織特異性

以Actin基因為內(nèi)參，比較分析MVA途徑系列基因在橙花叔醇型樟樹葉、葉柄、花、花柄、小枝、樹皮及根等7個組織中的表達情況，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，系列基因分為3類表達模式。第1種模式包括AACT2、HMGR1與PMK等3個基因，即只在一種或兩種組織中差異表達，AACT2基因在花、葉柄中下調(diào)表達，HMGR1基因在葉柄和小枝中上調(diào)表達，PMK基因則在花組織中下調(diào)表達。第2種模式包括MVK、HMGS1、MVD與AACT1等4個基因，即無表達組織差異。第3類基因包括HMGR2、HMGS2、IDI1與IDI2等4個基因，此類基因具有明顯表達組織特異性。當中，HMGR2、HMGS2與IDI1等3個基因皆在富含倍半萜類化合物組織即葉、葉柄、花與花柄中上調(diào)表達。HMGS2基因在葉、葉柄、花、花柄中相對表達量依次是其在小枝中相對表達量的11.25倍、7.85倍、16.94倍與10.27倍。HMGR2基因在葉、葉柄、花、花柄中相對表達量依次是其在小枝中相對表達量的6.70倍、4.44倍、6.06倍與4.68倍。IDI1基因在葉、葉柄、花與花柄中相對表達量依次是其在根中相對表達量的5.76倍、4.84倍、8.63倍與4.75倍。IDI2基因稍有不同，其在葉、葉柄、花梗與小枝中顯著上調(diào)表達。

圖2 樟樹MVA途徑系列基因表達組織特異性分析Fig.2 Expression analysis of the MVA pathway among tissues of C.camphora

旁系同源基因之間比較，AACT1基因表達豐度在所有調(diào)查組織中都高于AACT2基因表達豐度，相對差異程度介于1.80（樹皮）～8.63倍（花）。HMGS2基因在葉、葉柄、花、花柄中表達豐度高于HMGS1基因表達豐度，而在小枝、樹皮及根中二者無明顯差異。HMGR1基因表達豐度在葉、葉柄、花、花柄中與HMGR2類似，小枝、樹皮及根中則顯著上調(diào)表達，上調(diào)幅度介于7.06～14.12倍。除花組織外，IDI1基因在所有組織中相對表達豐度均顯著低于IDI2基因表達豐度。

2.4 MVA途徑部分基因在倍半萜類樟屬植物葉組織中上調(diào)表達

2018年7月，采集用于本節(jié)分析的桉葉油素型樟樹與巖桂葉精油譜（表2）。桉葉油素型樟樹葉精油中，單萜類化合物相對含量為81.77%～96.12%，第一優(yōu)勢成分為1,8-桉葉油素；黃樟油素型巖桂中，苯丙烯類化合物相對含量為90.69%～98.43%，第一優(yōu)勢成分為黃樟油素。桉葉油素型樟樹和黃樟油素型巖桂葉組織出油率分別為1.55%～1.97%、2.89%～3.54%，對應(yīng)每100 g鮮葉倍半萜類化合物含量分別為17.36～40.84、21.55～72.16 mg，與橙花叔醇型樟樹小枝與樹皮精油中倍半萜含量類似。具體比較葉精油倍半萜含量，橙花叔醇型樟樹分別是桉葉油素型樟樹和黃樟油素型巖桂的10.18～17.33倍及5.76～14.15倍。

2019年4月，提取上述3種化學(xué)型樟屬植物嫩葉組織total RNA，檢測HMGS2、HMGR2、IDI1和IDI2等4個基因的相對表達量（圖3）。結(jié)果顯示，HMGS2、HMGR2和IDI1等3個 基因在不同化學(xué)型樟屬葉組織中差異性表達。相對桉葉油素型樟樹和黃樟油素型巖桂，HMGS2、HMGR2與IDI1基因在橙花叔醇型樟樹分別上調(diào)表達3.70～3.73倍、4.20～5.46倍及3.38～4.07倍。IDI2基因表達量在不同化學(xué)型中無顯著性差異。結(jié)果顯示，HMGS2、HMGR2和IDI1等3個基因上調(diào)表達可能是促成倍半萜化學(xué)型樟屬植物形成的因素之一。

圖3 MVA途徑系列基因在不同化學(xué)型樟屬葉組織表達分析Fig.3 Expression analysis of the MVA pathway in different chemical types of Cinnamomum leaves

2.5 橙花叔醇型樟樹葉精油倍半萜含量高峰期分析

調(diào)查記錄1個生長周期內(nèi)30棵橙花叔醇型樟樹不同月份葉精油倍半萜化合物的變化情況。3月至5月為新葉萌發(fā)發(fā)育期，所有單株葉精油倍半萜含量快速增加。5月至9月，小樣本葉精油倍半萜含量變化存在4種模式。第1種模式僅包含編號No.11與No.13兩棵單株，5月份倍半萜含量達到高峰期，之后即無明顯差異（圖4a）。第2種模式包含編號No.1、No.2與No.4等7棵單株，7月份倍半萜含量達到高峰期，之后無明顯差異（圖4b）。第三種模式包含編號No.14、No.19與No.21等6棵單株，倍半萜含量增加至9月份達到高峰期且與11月含量無明顯差異（圖4c）。其余15棵單株為第4種模式，9月份葉精油中倍半萜含量達到峰值，顯著高于其它月份（圖4d）。從精油生產(chǎn)角度看，70%橙花叔醇型樟樹葉精油倍半萜含量在9月份最高，是原料林采收的最好時節(jié)。

圖4 橙花叔醇型樟樹葉精油倍半萜含量年變化Fig.4 The annual variation of sesquiterpene contents in the leaf essential oil of trans-nerolidol chemotype C.camphora

小樣本3、5、7、9、11與1月份標準差值分別為4.73、9.13、10.36、9.56、8.81與8.48，表明3月份橙花叔醇型樟樹群體倍半萜含量變異性最小，7月份最大。7月份，小樣本中No.2單株葉精油倍半萜含量最高，每100 g鮮葉含419.02 mg倍半萜，是最低單株（No.24）的2.80倍，也比小樣本平均值高57.10%。若統(tǒng)計各成分相對含量，葉精油中所述的10種主要倍半萜類化合物總相對含量受時令影響變化無規(guī)律性，各單株情況不一。總體上葉精油中倍半萜相對含量3月份最低，為59.47%，7月份最高，到達68.73%。結(jié)果表明，7月份是橙花叔醇型樟樹優(yōu)樹選擇的最好時機，且橙花叔醇型樟樹優(yōu)樹篩選具有很大空間。

2.6 不同時令下橙花叔醇型樟樹葉組織MVA途徑系列基因表達比較分析

根據(jù)2.4的結(jié)果，從小樣本中挑選6棵代表性單株作為本節(jié)實驗材料。A組（No.2、No.11、No.13）作為高倍半萜含量代表，B組（No.16、No.21、No.28）作為低倍半萜含量代表，各單株不同月份葉精油倍半萜含量見圖5。3—5月，所有單株葉精油倍半萜類化合物皆處于快速積累過程；7—9月，A組葉精油倍半萜類化合物含量變化不顯著，而B組葉精油倍化合物含量仍處于增加過程中。

圖5 不同月份橙花叔醇型樟樹葉精油倍半萜含量Fig.5 Sesquiterpene contents in leaves of trans-nerolidolchemotype C.camphora in different months

借助熒光定量PCR法檢測HMGS2、HMGR2、IDI1與IDI2等基因在2019年3、7月各單株葉組織中的表達水平（圖6）。設(shè)3月No.2葉組織中HMGS2、HMGR2、IDI1與IDI2表達量皆為1，其它單株對應(yīng)基因相對表達量以與之比值計算，在圖中以條形碼長度表示。3月，HMGS2、HMGR2、IDI1和IDI2等4個基因在6株測試單株葉組織間皆無顯著差異性表達。7月，HMGS2、HMGR2、IDI1和IDI2等4個基因在B組各單株顯著性上調(diào)表達。

圖6 不同時令下橙花叔醇型樟樹單株葉組織間MVA系列基因表達分析Fig.6 Expression analysis of the MVA pathway in leaf of trans-nerolidol-chemotype C.camphora in different months

比較不同月份系列基因表達量，A組各單株3月表達豐度顯著高于7月，B組各單株表達豐度在3月與7月差異不明顯。3月，A、B兩組半萜倍處于快速累積過程中，上述4個基因也處于轉(zhuǎn)錄活躍期。7月，A組各單株倍半萜含量增加不顯著，上述4個基因表達水平也對應(yīng)地降低。相反，B組各單株在7月還處于快速增加中，上述4個基因表達水平亦保持較高的水平。結(jié)果表明：HMGS2、HMGR2、IDI1和IDI2等4個基因表達水平對倍半萜累積速度具有重要調(diào)控作用。3—9月，A組倍半萜含量顯著高于B組，并未與上述4個基因表達水平情況相關(guān)聯(lián)，顯示可能還有其它因素參與調(diào)控單株間倍半萜含量差異表型形成。

3 討 論

在擬南芥基因組中，MVA路徑系列基因包括AACT、HMGR、IDI和MVD等由2個旁系同源基因編碼，而HMGS、MVK和PMK則由單拷貝基因編碼[13]。樟樹基因組中除HMGS由2個旁系同源基因編碼之外，其它MVA途徑系列基因與擬南芥相同。在大部分植物基因組中，HMGS由2個或多個旁系同源基因編碼，如在芥菜Brassica juncea基因組中4個HMGS基因已被分離[14]。通過可變剪接或轉(zhuǎn)錄起始位點調(diào)控，MVA系列基因包括AACT[15]、HMGS[16]、HMGR[17]與MVK[13]等皆存在不同轉(zhuǎn)錄本，編碼形成不同蛋白亞型，調(diào)控類異戊二烯合成或其它生長發(fā)育過程。樟樹MVA途徑系列基因可變剪接或轉(zhuǎn)錄起始位點調(diào)控目前還一無所知，需在今后開展研究予以證實。

通常認為植物MVA途徑發(fā)生于細胞質(zhì)之中，然而實驗結(jié)果顯示部分催化酶亞細胞定位呈多元化。擬南芥AtAACT1具有3種亞型，或定位于過氧化物酶體或細胞溶質(zhì)中，而AtAACT2具有2種亞型蛋白，或定位于細胞溶質(zhì)或細胞核中[18]。HMGR蛋白序列N端含有2段疏水跨膜結(jié)構(gòu)域，體外實驗顯示其蛋白N端錨定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔，C端包含催化中心暴露于細胞質(zhì)之中，瞬時表達結(jié)果則補充證實部分HMGR蛋白亦定位于細胞質(zhì)中類囊泡結(jié)構(gòu)之中[19]。序列分析顯示MVK、PMK與MVD蛋白序列N端皆包含過氧化物酶體定位保守motif-PTS2[20]，然而試驗結(jié)果顯示僅PMK與MVD二者定位于過氧化物酶體[21]。IDI序列N端具有質(zhì)體信號肽同時C端存在另一種過氧化物酶體定位信號肽motif-PTS1，通過形成不同亞型蛋白調(diào)控其定位于質(zhì)體、線粒體或過氧化物酶體中[22]。本文中部分樟樹MVA系列酶包括AACT、IDI、MVK、PMK與MVD等皆包含氧化物酶體定位信號肽motif-PTS1或motif-PTS2，在線軟件TargetP 1.1、ChloroP 1.1與MitoProt等預(yù)測序列基因亞細胞結(jié)果基本與其它植物一致，顯示植物MVA途徑基因區(qū)域化調(diào)控機制具有高度保守性。

植物MVA途徑系列基因表達具有組織特異性，但在不同植物中表達模式略有差異。在不同組織器官中，擬南芥AACT2為組成型表達模式，而AACT1在花序與根中優(yōu)勢表達，但表達豐度遠低于AACT2[18]。在巴西橡膠樹Hevea brasiliensis中，HMGS基因在莖、葉柄特別在乳汁管細胞中優(yōu)勢表達[23]。在樟科植物山蒼子Litsea cubeba中，HMGS基因在根、莖、葉與果中差異性表達，且在不同發(fā)育階段表達豐度差異顯著[24]。AtHMGR1S在所有組織器官均可被檢測，尤其在早期發(fā)育時期和花序中優(yōu)勢表達，而AtHMGR1L與AtHMGR2主要在分生組織與花器官中優(yōu)勢表達且表達豐度顯著弱于AtHMGR1S[25]。IDI基因組織表達特異性也常見于多種植物，如在海島棉Gossypium barbadense莖中優(yōu)勢表達[26]。在本研究所涉及的7個樟樹組織中，AACT1、HMGS1、MVK與MVD等4個基因為組成型表達模式，其它基因表達則具有組織特異性。HMGS2、HMGR2與IDI1等3個基因具有相似的表達模式，即都在富含倍半萜類物質(zhì)的葉、葉柄、花與花梗等中優(yōu)勢表達。此類現(xiàn)象也見于橡膠乳汁管細胞中HMGS與HMGR基因，二者共同優(yōu)勢表達且受乙烯利誘導(dǎo)表達[27]。在番茄Solanum lycopersicumMVA途徑研究中也發(fā)現(xiàn)HMGS與HMGR同時在腺毛中優(yōu)勢表達[28]。

部分植物MVA途徑系列基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是倍半萜類化合物生物合成的重要調(diào)控方式之一。擬南芥hmgr1與hmgr2突變體中三萜類化合物分別下降了65%和15%,證明了HMGR對植物萜類合成的重要作用[29]。橡膠性狀關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示，優(yōu)良無性系中HMGS基因表達量、HMGS酶活性與橡膠產(chǎn)量具有正相關(guān)性[30]。轉(zhuǎn)基因結(jié)果顯示，過量表達BjHMGS1、LcHMGS與EuIDI基因可分別提高芥菜甾醇[31]、山蒼子倍半萜[24]及杜仲Eucommia ulmoides反式橡膠的產(chǎn)量[32]。在本研究中，HMGS2、HMGR2與IDI1等基因在倍半萜類單株葉組織中相對其它化學(xué)型單株優(yōu)勢表達，與倍半萜含量呈正相關(guān)性，暗示三者對倍半萜類化合物合成或倍半萜類化學(xué)型形成具有重要作用。比較不同倍半萜含量橙花叔醇型樟樹單株葉組織，倍半萜累積含量與HMGS2、HMGR2與IDI1等基因表達量無顯著相關(guān)性，顯示可能有其它因素如精油細胞大小、密度或精油合成后轉(zhuǎn)運能力等也參與了調(diào)控倍半萜累積過程。

近年來部分樟樹MVA途徑基因克隆與表達研究亦鑒于其他作者研究報道中,部分基因表達結(jié)果與本文結(jié)果有所差異[33-35]。由于樟樹精油累積量處于動態(tài)過程之中，且單株精油含量差異顯著，因此在研究基因表達時空變化、組織特異性及化學(xué)型之間比較時，取樣時間段與取樣單株選擇尤為重要，不同的單株或取樣時間甚至可導(dǎo)致相反的結(jié)果。與精油譜數(shù)據(jù)同步分析可提高基因表達分析結(jié)果的可靠性，此外擴大分析樣本數(shù)亦可提高分析結(jié)果的可靠性。本研究涉及表達研究時，出于工作量考慮只挑選了6株代表性單株，所獲結(jié)果需在下階段通過增加樣本量進一步驗證。此外，推定HMGR2、HMGS2與IDI1等基因作為重要調(diào)控基因缺少蛋白水平的證據(jù)支持。因此，本課題組將比較分析MVA途徑各基因啟動子序列、尋找調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子及轉(zhuǎn)化模式植物等作為下一階段研究樟樹精油調(diào)控機制的主要內(nèi)容。