西地那非通過(guò)STAT3和Akt/GSK-3β途徑對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥和重塑的作用研究

陳麗娜 薛岑 杜麗娟 祝勁

哮喘是最常見(jiàn)的慢性呼吸系統(tǒng)疾病之一，其特征是氣道炎癥、氣道重塑、氣道高反應(yīng)性、杯狀細(xì)胞增生和粘液高分泌。慢性炎癥引起的氣道重塑在難治性哮喘的發(fā)病機(jī)制中起著非常重要的作用[1]。氣道平滑肌質(zhì)量增加，是氣道結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵。氣道平滑肌細(xì)胞增生和肥大，是增加氣道平滑肌質(zhì)量，導(dǎo)致哮喘氣道重塑的主要原因[2]。STAT3/Akt/GSK-3β途徑是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路之一，已有研究表明，STAT3/Akt/GSK-3β途徑參與調(diào)節(jié)哮喘平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，對(duì)哮喘氣道重塑有重要作用[3]。西地那非是美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)的用于治療勃起功能障礙和肺動(dòng)脈高壓的口服藥物。西地那非是一種有效的磷酸二酯酶(phosphodiesterase ，PDE)5抑制劑，其通過(guò)抑制PDE5，使得細(xì)胞內(nèi)環(huán)鳥苷單磷酸(cyclic guanosine monophosphate ，cGMP)信號(hào)持續(xù)激活，促進(jìn)肺動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞舒張并發(fā)揮抗增殖作用，從而降低肺動(dòng)脈壓，抑制血管重塑[4]。除了對(duì)肺血管的有益作用外，另有研究表明，西地那非對(duì)慢性阻塞性肺疾病合并肺動(dòng)脈高壓患者，也有一定的有利作用，如增加運(yùn)動(dòng)能力，BODE指數(shù)和改善生活質(zhì)量[5]，提示西地那非可能對(duì)肺功能異常有抑制作用。目前，還未有西地那非對(duì)哮喘的作用研究。綜上所述，本研究通過(guò)OVA誘導(dǎo)建立小鼠哮喘模型，旨在探究西地那非對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥和重塑的影響及其作用是否與STAT3和Akt/GSK-3β途徑相關(guān)，以期為哮喘治療藥物的開發(fā)提供新的科學(xué)依據(jù)。

資料與方法

一、材料

1 主要試劑

西地那非購(gòu)自美國(guó)selleck公司；地塞米松和卵清蛋白(OVA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-13檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；IgE和OVA特異性LgE檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海吉雅生物科技有限公司；糖原PAS染色液試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；Masson三色染色試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；α-SMA抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；p-STAT3、STAT3、p- Akt、Akt、p-GSK-3β和GSK-3β抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signalling Technology；GAPDH抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只雄性BALB/c小鼠，6周齡，體質(zhì)量(18±2)g購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有小鼠飼養(yǎng)于22±2℃、相對(duì)濕度45%～55%條件下，提供充足的飲水及飼料。待小鼠適應(yīng)環(huán)境一周后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

二、動(dòng)物分組及給藥處理

待小鼠適應(yīng)環(huán)境一周后，將小鼠隨機(jī)分為：對(duì)照組、哮喘組、西地那非低劑量組、西地那非高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組各8只。除對(duì)照組外，其余組小鼠于第1、7、14天用0.2mL OVA混懸液(含10μg OVA和1mg氫氧化鋁)腹腔注射致敏。從第21天起，霧化吸入25g/L OVA(生理鹽水溶解)激發(fā)30min，隔天激發(fā)1次，連續(xù)8周[6]。對(duì)照組注射和霧化吸入等量生理鹽水。西地那非低、高劑量組小鼠在霧化激發(fā)前1h給予腹腔注射西地那非12.5mg/kg和25mg/kg[7]，陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射地塞米松2mg/kg[8]。對(duì)照組和哮喘組小鼠注射生理鹽水。

三、支氣管肺泡灌洗液(BALF)的收集及細(xì)胞計(jì)數(shù)

小鼠麻醉后處死，行氣管插管，灌入生理鹽水灌洗肺部，隨后抽回生理鹽水，即為BALF。血球計(jì)數(shù)儀進(jìn)行BALF總細(xì)胞數(shù)的計(jì)數(shù)，隨后1000rpm離心5min后，生理鹽水重懸沉淀，涂于載玻片上，瑞士-吉姆薩染色后對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

四、ELISA檢測(cè)炎性因子、IgE和OVA特異性LgE水平

BALF 3000rpm離心5min，取上清液。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)BALF上清液中TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-13、IgE和OVA特異性LgE水平。

五、HE染色檢測(cè)肺組織病理學(xué)變化

取小鼠肺組織，4%多聚甲醛固定72h，梯度酒精脫水，二甲苯透明。常規(guī)石蠟包埋、切片。肺石蠟切片脫蠟至水，蘇木素染色10min，0.7%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流水洗滌后，伊紅液浸染3min。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。參考文獻(xiàn)[9]，對(duì)支氣管周圍和血管周圍炎癥程度進(jìn)行評(píng)估，1分：無(wú)明顯炎癥；2分：有少量炎癥細(xì)胞；3分：大多數(shù)支氣管或血管被一薄層炎癥細(xì)胞(1到5個(gè)細(xì)胞厚)包圍；4分：大多數(shù)支氣管或血管被一層厚厚的炎癥細(xì)胞(5個(gè)以上細(xì)胞厚)包圍。

六、過(guò)碘酸雪夫(Periodic Acid-Schiff stain ，PAS)染色檢測(cè)杯狀細(xì)胞增生

按照(五)所示，制備各組小鼠肺石蠟切片。切片常規(guī)脫蠟至水，高錳酸酒精溶液反應(yīng)10min，70%酒精清洗后，入還原液1min，70%酒精清洗后，入無(wú)色鹽基性品紅溶液1h。流水沖洗后，蘇木素復(fù)染5min，1%鹽酸酒精分化。流水沖洗后，脫水，透明，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡觀察分析。PAS陽(yáng)性上皮細(xì)胞占?xì)獾郎掀ぜ?xì)胞總數(shù)的百分比，即為PAS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(%)。

七、Masson染色檢測(cè)膠原纖維沉積

按照(五)所示，制備各組小鼠肺石蠟切片。切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染液染色10min。酸性乙醇分化液分化15s，水洗。Masson藍(lán)化液返藍(lán)5min，水洗。麗春紅品紅染液10min。磷鉬酸溶液洗1min，弱酸工作液洗1min。苯胺藍(lán)染液染色2min。弱酸工作液洗后，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠固封，Image J軟件分析膠原纖維藍(lán)色著染面積。

八、免疫組化檢測(cè)α-SMA的表達(dá)

按照(五)所示，制備各組小鼠肺石蠟切片。切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)。3% H2O2甲醇液孵育10 min，PBS清洗后，5% BSA封閉1h，α-SMA抗體(1 ∶100)4 ℃孵育過(guò)夜。二抗(1 ∶500)室溫孵育1 h。DAB顯色液顯色，蘇木素染液染色2 min。1%鹽酸酒精分化10 s。0.2%氨水做返藍(lán)處理8 s。自來(lái)水沖洗后，切片進(jìn)行脫水、透明處理，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察分析。

九、Western blot檢測(cè)α-SMA蛋白和STAT3/Akt/GSK-3β途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)

取小鼠肺組織剪碎，RIPA裂解液冰上裂解組織，離心取上清，BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。10%脫脂奶粉封閉，隨后加入α-SMA(1 ∶2 000)、p-STAT3(1 ∶1 000)、STAT3(1 ∶1 000)、p- Akt(1 ∶1 000)、Akt(1 ∶1 000)、p-GSK-3β(1 ∶1 000)、GSK-3β(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶5 000)抗體，4 ℃條件下過(guò)夜孵育。加入二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h后，滴加ECL發(fā)光液到膜上，化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)。

十、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組小鼠氣道炎癥的比較

與對(duì)照組相比，哮喘組小鼠BALF總細(xì)胞數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)明顯升高(P<0.05)，TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-13水平明顯升高(P<0.05)；與哮喘組相比，西地那非，低、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠BALF總細(xì)胞數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05)，TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-13水平明顯降低(P<0.05)(見(jiàn)表1、2)。

表1 各組小鼠BALF總細(xì)胞數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)的比較

表2 各組小鼠炎性因子水平的比較

二、各組小鼠IgE和OVA特異性LgE水平的比較

與對(duì)照組相比，哮喘組小鼠IgE和OVA特異性LgE水平明顯升高(P<0.05)；與哮喘組相比，西地那非低、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠IgE和OVA特異性LgE水平明顯降低(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 各組小鼠IgE和OVA特異性LgE水平的比較

三、各組小鼠肺組織病理學(xué)變化的比較

與對(duì)照組相比，哮喘組小鼠肺組織支氣管周圍存在明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥評(píng)分明顯升高(P<0.05)；與哮喘組相比，西地那非低、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肺組織支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，炎癥評(píng)分明顯降低(P<0.05)(見(jiàn)圖1，表4)。

圖1 HE染色檢測(cè)各組小鼠肺組織病理學(xué)變化(HE ×100)

表4 各組小鼠炎癥評(píng)分的比較

四、各組小鼠杯狀細(xì)胞增生的比較

與對(duì)照組相比，哮喘組小鼠肺組織PAS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯升高(P<0.05)；與哮喘組相比，西地那非低、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肺組織PAS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05)(見(jiàn)圖2，表5)。

圖2 PAS染色檢測(cè)各組小鼠杯狀細(xì)胞增生(HE ×100)

表5 各組小鼠PAS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比較

五、各組小鼠氣道重塑的比較

與對(duì)照組相比，哮喘組小鼠肺組織膠原纖維面積和α-SMA表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與哮喘組相比，西地那非低、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肺組織膠原纖維面積和α-SMA表達(dá)明顯降低(P<0.05)(見(jiàn)圖3、4、5、表6，7)。

表6 各組小鼠膠原纖維面積的比較

圖3 Masson染色檢測(cè)各組小鼠膠原纖維沉積(HE ×100)

六、各組小鼠STAT3和Akt/GSK-3β途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

與對(duì)照組相比，哮喘組小鼠p-STAT3/STAT3的比值明顯升高(P<0.05)，p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β的比值明顯降低(P<0.05)；與哮喘組相比，西地那非低、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠p-STAT3/ STAT3的比值明顯降低(P<0.05)，p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β的比值明顯升高(P<0.05)(見(jiàn)圖6，表8)。

表8 各組小鼠STAT3/Akt/GSK-3β通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較

圖4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組小鼠α-SMA的表達(dá)(HE ×400)

圖5 Western blot檢測(cè)各組小鼠α-SMA的蛋白表達(dá)

圖6 Western blot檢測(cè)各組小鼠STAT3/Akt/GSK-3β通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

表7 各組小鼠α-SMA蛋白表達(dá)水平的比較

1：對(duì)照組；2：哮喘組；3：西地那非低劑量組；4：西地那非高劑量組；5：陽(yáng)性對(duì)照組

討 論

哮喘是兒童和成人最常見(jiàn)的慢性非傳染性綜合征之一，全世界約有3.34億人患有此病，每年約有25萬(wàn)人死于哮喘[10]。目前哮喘的治療策略主要有長(zhǎng)效β2-激動(dòng)劑、支氣管擴(kuò)張劑、吸入皮質(zhì)類固。以上治療策略雖然可以減輕炎癥，但目前還沒(méi)有建立有效的治療方法來(lái)減輕氣道重塑[11]。因此，需要開發(fā)新的治療策略減輕哮喘病理學(xué)基礎(chǔ)上的炎癥和重塑過(guò)程。西地那非是一種被廣泛用于治療勃起功能障礙和肺動(dòng)脈高壓的藥物[4]。目前，關(guān)于西地那非對(duì)哮喘作用的相關(guān)研究寥寥無(wú)幾。因此，本研究旨在探究西地那非對(duì)哮喘的作用及其可能的作用機(jī)制，以期為開發(fā)更有效的哮喘治療策略提供新的科學(xué)資料。

氣道炎癥和氣道重塑是哮喘的兩個(gè)主要病理生理特征。哮喘的炎癥反應(yīng)包括B細(xì)胞過(guò)度產(chǎn)生IgE、釋放細(xì)胞因子以及嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)[12]。哮喘氣道重塑的特征是平滑肌肥大和增生、杯狀細(xì)胞增生、黏液高分泌、上皮下纖維化和膠原沉積、血管增加和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[13]。因此，控制氣道炎癥和重塑是治療哮喘的關(guān)鍵。研究表明，西地那非治療通過(guò)抑制心臟炎癥、心臟纖維化和心臟重塑改善燒傷性心功能不全[14]。西地那非除了具有心臟保護(hù)功能以外，還對(duì)重度慢性阻塞性疾病合并肺動(dòng)脈高壓大鼠肺泡、細(xì)支氣管、間質(zhì)組織和小動(dòng)脈的病理學(xué)變化有明顯改善作用[15]。本研究結(jié)果顯示：在OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中，西地那非以劑量依賴的方式改善哮喘誘導(dǎo)的氣道炎癥及氣道重塑，同時(shí)降低BALF中IgE和OVA特異性LgE水平。

STAT3是一種細(xì)胞因子的激活轉(zhuǎn)錄因子，其激活在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。一旦受到刺激，導(dǎo)致STAT3 Tyr705位點(diǎn)磷酸化，隨后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，從而轉(zhuǎn)錄調(diào)控細(xì)胞因子反應(yīng)基因和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[16]。因此，STAT3激活可能是哮喘潛在的治療靶點(diǎn)[17]。本研究結(jié)果表明：在OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中，STAT3通路活化，而西地那非以劑量依賴的方式抑制STAT3通路活化。Akt/GSK-3β信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中普遍存在，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和自噬等多種重要細(xì)胞活動(dòng)[18]。以往的研究表明，硫化氫通過(guò)激活PI3K/Akt/mTOR途徑改善脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷[19]。線粒體輔酶Q通過(guò)激活PI3K/Akt/GSK-3β/mTOR信號(hào)通路改善肺組織病理學(xué)變化，減輕肺水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，在膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[20]。本研究結(jié)果顯示：在OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中，Akt/GSK-3β通路被抑制，而西地那非治療可促進(jìn)Akt/GSK-3β通路活化。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，西地那非可抑制哮喘小鼠氣道炎癥及氣道重塑，其作用可能是通過(guò)調(diào)控STAT3和Akt/GSK-3β通路實(shí)現(xiàn)的。該研究結(jié)果為明確西地那非在哮喘中的作用及開發(fā)新的哮喘治療策略提供了新的科學(xué)依據(jù)。本研究只初步確認(rèn)了西地那非對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥及氣道重塑的改善作用可能與STAT3和Akt/GSK-3β通路有關(guān)，并未進(jìn)行深入研究。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探討西地那非在哮喘小鼠中調(diào)控STAT3和Akt/GSK-3β通路的具體機(jī)制。