支氣管肺泡灌洗液GeneXpert-MTB/RIF檢測在活動性肺結核診斷中的效能

虞忻 吳海燕 趙靜 張建平

結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染的慢性呼吸系統(tǒng)傳染病，其中以肺結核為最常見，并嚴重威脅人類健康和生命安全。我國的肺結核發(fā)病率及死亡率位居所有傳染病首位，為全球第2位[1]。參照我國制定的“到2030年前肺結核發(fā)病率下降80%、病死率下降95%”的十三五結核病防治目標[2]，以及當前耐藥肺結核發(fā)病率逐年升高的情況[1]，同時廣泛耐藥結核也呈逐年上升趨勢，所以肺結核的防治已成為當務之急，也是我國結核病防治的重要任務。

近年來，分子生物學檢測技術日趨成熟，給結核病的早期診斷開辟了新篇章。其中由美國Cepheid公司研發(fā)生產的GeneXpert MTB/RIF技術能2 h內快速檢測MTB和利福平耐藥的全自動分子生物學檢測方法[3]。以往的檢測手段如痰涂片抗酸染色敏感度低、無法做菌種鑒定[4]；結核分枝桿菌培養(yǎng)需4～6周報告結果，無法滿足肺結核及耐藥結核病早診斷、早治療的要求，不利于結核病和耐藥結核病的早期控制而導致結核播散甚至影響預后。所以在2010年，WHO正式批準了GeneXpert MTB/RIF檢測方法的推廣應用，并受到國內外的廣泛關注。有資料表明，70%左右的肺結核患者痰涂片抗酸染色陰性，病原學陽性率較低，同時部分患者難以咳出痰，肺結核早期診斷從而被延誤[5]。故臨床中進行電子支氣管鏡灌洗液(BALF)病原學檢測，能有效提高結核分枝桿菌檢出率，對肺結核特別是菌陰肺結核的早期診斷有很大的幫助[6]。本研究對158例臨床診斷肺結核患者進行回顧性分析，旨在探討支氣管肺泡灌洗液GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert法”)檢測對肺結核早期診斷的價值。

資料與方法

一、研究對象

選擇2017年9月～2018年9月蘇州大學附屬傳染病醫(yī)院肺科收治的臨床診斷肺結核的158例患者進行回顧性研究，其中男112例，女46例；年齡14～81歲，平均(35.40±20.51)歲。入選患者均符合《WS 288—2017 肺結核診斷》[7]標準，同時排除并發(fā)COPD、自身免疫系統(tǒng)疾病等患者，以及有氣管鏡檢查禁忌者，如嚴重心肺功能不全、嚴重心律失常、1周內發(fā)生嚴重大咯血等患者。對158例入組肺結核患者分別進行痰液Xpert及BALF的直接涂片抗酸染色法、Xpert、熒光定量PCR檢測及BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡稱“MGIT 960培養(yǎng)”)等四項檢測。以上所有研究方案均獲得蘇州大學附屬傳染病醫(yī)院倫理委員會批準并同時取得研究對象知情同意。

二、研究方法

1 BALF采集

患者術前均完善血常規(guī)、凝血功能、心電圖，同時詢問有無高血壓、糖尿病、心律失常、支氣管哮喘、藥物過敏等病史，如有高血壓病史需術前服用降壓藥，有無服用抗凝藥物及抗血小板凝集等藥物的病史，如服用需停用3 d。術前禁食禁水4 h。患者術前2%利多卡因會厭局麻后15分鐘，平仰臥，使用Olympus BF260或Olympus BF290電子支氣管鏡由口腔進入，使用2%利多卡因局麻雙側主氣道，觀察顯示屏以完成采集操作。根據(jù)影像學改變及電子氣管鏡下表現(xiàn)，在病變部位予以刷檢、取活檢組織后，在病變部位段及以下支氣管灌入生理鹽水80～100 mL，負壓吸引回收支氣管肺泡灌洗液，送檢涂片抗酸染色、熒光定量PCR、Xpert MTB/RIF、MGIT 960液體培養(yǎng)等檢測。

2 痰標本采集

患者深呼吸后咳出的痰液，痰標本由檢驗人員或經(jīng)培訓合格的專人驗收，留取痰液容器為國際通用的無菌螺旋痰瓶。患者深咳后產生的痰標本應由檢查員或訓練有素的專業(yè)人員檢查并接受，保存痰液容器應為無菌螺旋痰瓶并為國際認可。

3 直接涂片抗酸染色法

根據(jù)《中國結核病防治規(guī)劃實施工作指南(2008年版)》[8]進行檢驗操作并報告抗酸染色鏡檢結果分級[9]。

4 熒光定量PCR檢測

① 將同樣體積液化液加入痰標本中并渦旋混合，取1 mL放入離心管以離心5 分鐘，除去上清液；② 將1 mL0.9%NS加入離心管中，渦旋振蕩混合后再次離心，棄上清；③ 將60μl核酸提取液加入離心管中，并渦旋振蕩混合，隨后使用晶芯ExtractorTM 36核酸快速提取儀，振蕩5 分鐘，置于95 ℃水浴中5 min，離心1 min獲得核酸；④ 取2μl擴增檢測出結果。

5 MGIT 960培養(yǎng)

通過連續(xù)測定培養(yǎng)管中熒光強度，來測定結核分枝桿菌的生長狀態(tài)，并自動打印出結果。在50毫升離心管中加入痰液1～2mL，加入4%氫氧化納震蕩混勻，靜置半小時，離心去上清留沉淀。標本接種：① 標本接種前,在培養(yǎng)管中先加入營養(yǎng)添加劑(OADC)和雜菌抑制劑(PANTA)混合添加劑0.8mL；② 抽取0.5mL已處理樣本注入MGIT培養(yǎng)管中；③ 將接種好的MGIT培養(yǎng)管放入BACTEC MGIT-960 Tb中培養(yǎng)。

6 Xpert MTB/RIF核酸擴增檢測

① 取1 mL痰標本置放入預處理管中，然后加入液化液；② 渦旋振蕩15～30 s后靜置15分鐘，痰標本充分液化后取2 mL加入反應盒；③ 然后在檢測模塊中，放入反應盒，儀器即自動化檢測開始進行并報告結果。

三、質量控制

本實驗所有操作人員均通過中國疾病預防控制中心(簡稱中國CDC)組織的全國結核病分子診斷技術能力驗證培訓、江蘇省疾病預防控制中心(簡稱江蘇CDC)組織的痰涂片抗酸染色診斷技術能力驗證培訓，以及結核病實驗室藥物敏感測試培訓。每次結果同時進行陽性質控和陰性質控。

四、統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)庫的建立采用EXCEL表格，統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0軟件，多組計數(shù)資料間的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義,多組之間兩兩比較采用P值修正的方法,即P<0.05/K(K為需要比較的次數(shù))才能認為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、 四種方法檢測BALF情況比較

158例肺結核患者中，BALF涂片抗酸桿菌鏡檢、MGIT 960培養(yǎng)、PCR、Xpert 檢測的陽性率分別為25.3%、50.6%、38.0%、57.0%，四種方法聯(lián)合檢測總陽性率67.7%。Xpert MTB/RIF(χ2=32.672，P<0.001)、MGIT 960培養(yǎng)(χ2=21.497，P<0.001)、PCR檢測(χ2=5.852，P=0.016)陽性率明顯高于涂片抗酸桿菌。Xpert檢測陽性率明顯高于PCR檢測(χ2=11.422，P<0.001)，而與痰培養(yǎng)陽性率的差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.273，P=0.2592)。4種方法聯(lián)合檢測總陽性率明顯高于涂片抗酸染色(χ2=57.1，P<0.001)，結核培養(yǎng)(χ2=9.55，P=0.002)，PCR檢測(χ2=28.053，P<0.001)，Xpert MTB/RIF(χ2=3.896，P=0.048)任何單一檢測方法(見表1)。

表1 四種方法檢測158份BALF標本的結果[例(構成比，%)]

二、 以MGIT 960培養(yǎng)為金標準，涂片抗酸染色、PCR、Xpert MTB/RIF檢測支氣管肺泡灌洗液的檢測效能

Xpert檢測的敏感度和特異度分別為78.75%(63/80)和65.38%(51/78)，熒光定量PCR檢測的敏感度和特異度分別為66.25%(53/80)和91.03%(71/78)，涂片抗酸桿菌的敏感度和特異度分別為45.0%(36/80)和94.87%(74/78)(見表2)。

表2 以MGIT 960培養(yǎng)為金標準，涂片抗酸染色、Xpert MTB/RIF、PCR的檢測效能

三、Xpert MTB/RIF檢測BALF和痰液陽性率的比較

158例肺結核患者中，在BALF中Xpert陽性率為57.0%(90/158)，明顯高于痰液標本中檢測的陽性率[32.3%(51/158)](χ2=19.479，P<0.001)，差異有統(tǒng)計學意義(見表3)。

表3 Xpert MTB/RIF檢測BALF和痰液陽性率的比較[例(構成比，%)]

討 論

一、Xpert MTB/RIF檢測技術的原理及優(yōu)勢

Xpert MTB/RIF檢測技術是一種以GeneXpert系統(tǒng)平臺及聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)原理為基礎的體外診斷技術，全自動一體化實時定量檢測。其以半巢式實時定量(Quantitative Real-time PCR)為技術基礎，以利福平(rifampicin，RIF)耐藥rpoB基因為靶基因，自動提取DNA片段，并擴增其基因的192bp片段，以進行檢測的技術手段[3]；它采用6種分子信標及檢測6種分子探針，5個分子探針相互重疊，分別以A、B、C、D、E命名， rpoB基因81bp核心的被選擇性覆蓋，并檢測出MTB對利福平是否耐藥情況[10]。Xpert MTB/RIF系統(tǒng)只需2 h便可以自動完成標本的純化、離心及DNA的提取擴增、檢測及結果讀出，并提示RFP耐藥情況[11]。該檢測系統(tǒng)另一大優(yōu)勢就是細菌污染可能性很小，和以往檢測方法不同，其試劑盒獨立儲存，操作快捷簡便。這些特點均卓越的顯示出Xpert MTB/RIF技術有別于涂片抗酸染色、熒光定量PCR等，檢測方法有極大的優(yōu)勢，受到WHO的高度重視及推崇[12]。

二、Xpert MTB/RIF檢測BALF對診斷活動性結核的重要價值

隨著電子支氣管鏡廣泛的臨床應用，經(jīng)支氣管灌洗等檢查，成為診斷肺結核的主要方法之一，它不僅可以直接觀察支氣管內黏膜病變并進行BALF、刷檢和活檢，而且可以通過BALF結合分子生物學檢查，推動了肺結核的早期診斷得到有效發(fā)展。本研究中就可看出BALF Xpert檢測的敏感度明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的涂片找抗酸桿菌及熒光定量PCR檢測，雖然與結核診斷“金標準”結核培養(yǎng)的敏感性相差不大，但結核培養(yǎng)需要4～8周才能得到結果，而Xpert MTB/RIF檢測技術2h即可出結果，并同時了解有無利福平耐藥，很大程度上極大縮短了檢測出病原學結果時間，故對肺結核、耐藥結核有早期診斷價值。

同時我們臨床上考慮到部分結核病患者痰液較少，因此無法留取優(yōu)質痰標本，痰液荷菌量少,從而降低了痰檢病原學陽性率。故本研究通過電子支氣管鏡檢測技術，收集了158例臨床診斷肺結核的支氣管鏡BALF標本，分別進行涂片、PCR、Xpert及結核培養(yǎng)，結果表明BALF Xpert檢測陽性率為57.0%，明顯高于PCR檢測(38.0%)及涂片找抗酸桿菌(25.3%)，兩者差異有統(tǒng)計學意義，與王蔚等[13]研究結果一致，表明BALF Xpert檢測能提高肺結核病原學確診率。與李妍等[14]報道的44例支氣管鏡BALF檢測陽性率(65.9%)相比稍低，考慮可能與標本量及部分患者已抗癆7天，方做支氣管鏡檢查有關。而Xpert陽性率高于PCR檢測，主要由于Xpert MTB/RIF的技術基礎是半巢式實時熒光定量，靶基因為ropb基因，而PCR 檢測中FAM是針對結核分枝桿菌復合群IS6110基因，HEX診斷分枝桿菌屬HSP65基因，兩者采用不同的引物序列，導致Xpert敏感性高于PCR檢測。值得一提的是，我們同時統(tǒng)計了BALF中涂片抗酸染色、PCR、Xpert及結核培養(yǎng)四種檢測方法聯(lián)合檢測后發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測可使病原學陽性率提高到67.7%，也就是說接近2/3患者可以病原學確診肺結核。同時電子支氣管鏡BALF上述四種檢測方法聯(lián)合檢測能很大程度提高結核病原學陽性率，進一步證實了廣泛開展電子支氣管鏡檢查，有助于肺結核早期病原學確診，對于肺結核早期診斷意義非凡。

同時需要關注的是，以BALF結核培養(yǎng)為金標準，Xpert檢測敏感度高達78.75%，明顯高于PCR檢測及涂片找抗酸桿菌，顯著提高了肺結核診斷的準確率，漏診率大大減少。而特異度為65.38%，較PCR檢測及涂片找抗酸桿菌均偏低，不理想，可能與部分患者抗癆后7天，才做氣管鏡有關，由于抗癆有效后結核菌量明顯減少結核培養(yǎng)轉陰而Xpert仍陽性。目前諸多研究均表明Xpert假陽性率較低[15-18]，而本研究的假陽性率可能為抗癆治療后病灶有吸收，抗癆治療有效，故考慮患者真的存在肺結核，但根據(jù)目前診斷“金標準”不能確診的病例，所以進一步說明聯(lián)合檢測的必要性。另外，BALF Xpert與PCR及結核培養(yǎng)檢測結果的符合率均較高，均達到70%以上，一致性較好，說明此檢測方法真實、有效、可靠，確實能提高肺結核病原學陽性率。

支氣管鏡BALF Xpert陽性率57.0%明顯高于痰Xpert檢測陽性率32.3%，說明支氣管鏡BALF檢測能明顯提高病原學陽性率，尤其對痰量較少或無痰的患者，氣管鏡檢測能提高肺結核的診斷率。近年來多項研究表明，支氣管鏡BALF中細菌學及分子生物學等相關檢測手段聯(lián)合，同時結合刷檢、病理活檢等多項指標，能進一步提高肺結核特別是菌陰肺結核及耐藥結核的正確診斷率[19-20]，這同時也需要我們進一步更多的研究來證實。

綜上所述，肺結核是臨床上常見的呼吸道傳染病，提高肺結核的早期診斷率，同時防止誤診、漏診是不容忽視的問題。經(jīng)支氣管鏡提取BALF進行Xpert MTB/RIF檢測，能明顯提高肺結核特別是耐藥結核的早期診斷率，為WHO根除結核病的目標奠定了診斷基礎，值得臨床進一步推廣使用。