兩種分子檢測(cè)技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株耐藥性診斷價(jià)值的評(píng)價(jià)

劉春平 熊德芳 譚耀駒

耐多藥結(jié)核是指結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平和異煙肼兩種主要抗結(jié)核藥物同時(shí)產(chǎn)生耐藥的結(jié)核病。我國是耐多藥肺結(jié)核高負(fù)擔(dān)國家之一，耐多藥結(jié)核病是目前控制結(jié)核病的主要難題和重要挑戰(zhàn)。目前表型藥敏試驗(yàn)是確診耐多藥結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時(shí)長、操作復(fù)雜，遠(yuǎn)不能滿足臨床診治的的需求，因此，迫切需要建立快速準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)核桿菌耐藥性的方法。分子生物學(xué)技術(shù)可將結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的診斷從幾周減少到幾個(gè)小時(shí)[1]，而逐漸成為該領(lǐng)域的發(fā)展方向。雖然2011年Xpert MTB/RIF分子技術(shù)被WHO推薦用于結(jié)核的快速診斷和利福平耐藥性檢測(cè)，但該方法成本高且不能檢測(cè)異煙肼耐藥突變。目前國內(nèi)很多地區(qū)已經(jīng)開展的熒光PCR熔解曲線法和線性探針方法，可一次同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因突變位點(diǎn)，但鮮見對(duì)這兩種分子方法結(jié)核耐藥性效果比較的相關(guān)報(bào)道。本研究采用熒光PCR探針熔解曲線方法及線性探針技術(shù)，檢測(cè)一線抗結(jié)核藥物利福平和異煙肼耐藥性，以表型藥敏試驗(yàn)方法為參考，分析這兩種分子方法檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥性的效能。

資料與方法

一、材料收集

回顧性分析2013年12月-2014年3月廣州市胸科醫(yī)院186例涂陽肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果。每例患者的同一份痰標(biāo)本行痰涂片鏡檢、BACTAC MGIT 960液體培養(yǎng)以及熒光PCR熔解曲線法和線性探針法對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)培養(yǎng)陽性鑒定為結(jié)核分枝桿菌分離株進(jìn)行表型藥敏試驗(yàn)。涂陽性患者的186例痰標(biāo)本分離培養(yǎng)，7例污染，10例培養(yǎng)陰性，169例為陽性培養(yǎng)菌株，經(jīng)菌種鑒定13例為非結(jié)核分枝桿菌，最終獲得156例結(jié)核分枝桿菌臨床分離株。156例結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中，4例熒光PCR熔解曲線檢測(cè)Ct值與陰性對(duì)照重疊，判定為無效，11例線性探針檢測(cè)質(zhì)控TUB條帶缺失，判為未檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌，142例同時(shí)獲得表型藥敏試驗(yàn)、熒光PCR熔解曲線及線性探針法檢測(cè)結(jié)果。最終用于評(píng)估熒光PCR熔解曲線和線性探針方法對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)效能的142例患者中，男性103例，女性39例，平均年齡 48.37±17.32歲。

二、方法

1 標(biāo)本收集和培養(yǎng)

經(jīng)抗酸染色證實(shí)為陽性的痰標(biāo)本，加入2～3倍體積的4% N-乙酰半胱氨酸-氫氧化鈉(NALC-NaOH)，液化15min。將液化后的痰標(biāo)本分成三份，一份用于熒光PCR熔解曲線法DNA提取、一份用于線性探針法DNA提取、一份用于分離培養(yǎng)。分離培養(yǎng)按照中國防癆協(xié)會(huì)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》使用BACTEC MGIT960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)儀進(jìn)行[2]。

2 結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)

對(duì)分離培養(yǎng)出的陽性產(chǎn)物按照中國防癆協(xié)會(huì)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》實(shí)驗(yàn)操作方法進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定和利福平和異煙肼藥敏試驗(yàn)[2]。

3 熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)利福平及異煙肼耐藥性

取1mL液化后的痰標(biāo)本，12000g離心10min，棄上清。重懸于250μl TB DNA提取液中，渦旋振蕩混勻。封口膜封口，99℃加熱10min，12000g離心10min，轉(zhuǎn)移上清至半自動(dòng)核酸提取儀(廈門致善生物科技股份有限公司)進(jìn)行核酸提取，提取液作為DNA模板，4℃或-20℃保存。

采用熒光PCR探針熔解曲線法(結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測(cè)試劑盒、異煙肼耐藥突變檢測(cè)試劑盒均為廈門致善生物科技股份有限公司)檢測(cè)利福平和異煙肼的耐藥性。利福平耐藥突變檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群rpoB507-534核心區(qū)位點(diǎn)的突變。異煙肼耐藥突變檢測(cè)ahpC啟動(dòng)子區(qū)(-44～-30、-15～3位點(diǎn))、inhA94密碼子、inhA啟動(dòng)子區(qū)(-17～-8位點(diǎn))以及katG315密碼子的突變。所有的PCR反應(yīng)體系均為25μl。實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，并參照試劑盒說明書進(jìn)行結(jié)果判讀。利福平和異煙肼的每個(gè)標(biāo)本有兩個(gè)反應(yīng)管，每種突變檢測(cè)FAM和TET兩個(gè)通道熒光信號(hào)，即每個(gè)標(biāo)本有4個(gè)通道的檢測(cè)結(jié)果。操作流程簡(jiǎn)述如下：配制PCR反應(yīng)液：取n×19.6μl PCR Mix A和n×0.4μl TB酶混合液加入至1.5mL 離心管內(nèi)，混勻，向每支PCR反應(yīng)管內(nèi)分裝20μl，再加入5μl相應(yīng)提取樣品或陽/陰性對(duì)照，PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熔解分析。

4 線性探針檢測(cè)利福平及異煙肼耐藥性

Genolyse?提取DNA：取1mL液化后的痰標(biāo)本，10000g離心15min。棄上清，加入100μl裂解緩沖液(A-LYS)，渦旋振蕩重懸。95℃水浴5min，瞬時(shí)離心。加入100μl中和緩沖液(A-NB)振蕩標(biāo)本5min。13000g離心5min，轉(zhuǎn)移上清(即為DNA模板)至新管中，4℃或-20℃保存。

采用GenoType MTBDR plus 2.0試劑盒(梅里埃公司)檢測(cè)利福平和異煙肼的耐藥性。配制PCR反應(yīng)液：實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說明書操作。取n×10μl AM-A和n×35μl AM-B混合液加入至1.5mL 離心管內(nèi)，混勻，向每支PCR反應(yīng)管內(nèi)分裝45μl，再加入5μl相應(yīng)提取樣品或陽/陰性對(duì)照，PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。20μl變性液與20μl PCR產(chǎn)物充分混勻，室溫孵育5min，加入1mL雜交緩沖液和標(biāo)記好的探針試紙條，45℃孵育30min，依次加入STR洗脫液、RIN洗脫液進(jìn)行漂洗，加入1：100稀釋的共軛室溫孵育30min，RIN試劑洗脫2次，蒸餾水漂洗1次，基底液避光顯色。每個(gè)探針試紙條有27個(gè)反應(yīng)區(qū)，包括3個(gè)質(zhì)控探針(擴(kuò)增系統(tǒng)質(zhì)控AC、顯色反應(yīng)質(zhì)控CC和23rRNA基因質(zhì)控TUB)和24個(gè)檢測(cè)探針(1個(gè)rpoB基因特異性探針、8個(gè)rpoB野生位點(diǎn)探針、4個(gè)常見突變位點(diǎn)探針；1個(gè)katG基因特異性探針、1個(gè)katG野生位點(diǎn)探針、2個(gè)katG突變位點(diǎn)探針；1個(gè)inhA基因特異性探針、2個(gè)inhA野生位點(diǎn)探針、4個(gè)inhA突變位點(diǎn)探針)。任一基因野生位點(diǎn)出現(xiàn)條帶，缺失或突變位點(diǎn)出現(xiàn)條帶判定為耐藥；任一基因野生位點(diǎn)出現(xiàn)條帶出現(xiàn)或突變位點(diǎn)缺失，判為敏感。質(zhì)控TUB條帶缺失判為未檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以表型藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算熒光PCR探針熔解曲線法和線性探針法的敏感度、特異度、符合率。采用Kappa檢驗(yàn)分析兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致性(Kappa ≥ 0.8高度一致；0.6≤Kappa<0.8一致性較好；0.4≤Kappa<0.6一致性中等；Kappa<0.4一致性較差)[3]。采用卡方檢驗(yàn)比較兩種方法檢測(cè)結(jié)果，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果

142份臨床結(jié)核桿菌分離株中，其中1份(0.70%)為利福平單耐藥株，16份(11.27%)為異煙肼單耐藥株，27份(19.01%)為同時(shí)對(duì)利福平和異煙肼耐藥株，98份(69.01%)為敏感株。

二、熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)結(jié)果

142份臨床結(jié)核桿菌分離標(biāo)本中，4份(2.82%)對(duì)利福平單耐藥，5份(3.52%)對(duì)異煙肼單耐藥，26份(18.31%)同時(shí)對(duì)利福平和異煙肼耐藥，107份(75.35%)為敏感株。以表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥性的敏感度、特異度、符合率及Kappa值結(jié)果(見表1)。

表1 以表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平和異煙肼耐藥的效能

三、線性探針法檢測(cè)結(jié)果

142份臨床結(jié)核桿菌分離標(biāo)本中，110份(77.46%)為敏感株，3份(2.11%)對(duì)利福平單耐藥，其中2份rpoB 531突變(S531L)、1份rpoB 526位點(diǎn)突變(H526Y)；7份(4.93%)對(duì)異煙肼單耐藥，均為KatG 315點(diǎn)突變(S315T)；22份(15.86%)同時(shí)對(duì)利福平和異煙肼耐藥，其中1份為rpoBD516V+ KatGS315T突變、1份rpoB516G-T+ KatG315G-C突變、8份rpoBS531L+ KatGS315T突變、1份rpoB 516A-T+ KatG315G-C突變、4份rpoBH526T+KatGS315T突變、2份rpoB531C-T+ KatG315G-C突變、3份rpoB526-529野生型缺失+ KatGS315T突變及2份rpoB513-519野生型缺失+KatGS315T突變。以表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，線性探針法檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥性的敏感度、特異度、符合率及Kappa值結(jié)果(見表2)。

表2 以表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)線性探針法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平和異煙肼耐藥的效能

四、熒光PCR探針熔解曲線與線性探針技術(shù)檢測(cè)結(jié)果的比較(見表3)

表3 探針熔解曲線與線性探針檢測(cè)結(jié)果比較

28例利福平臨床結(jié)核桿菌分離耐藥菌株中， PCR熒光熔解曲線技術(shù)檢測(cè)利福平耐藥株為26例，線性探針法檢測(cè)利福平耐藥株為23例，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.574，P=0.4497)。114例利福平敏感菌株中，熒光PCR熔解曲線技術(shù)檢測(cè)利福平敏感株為110株，線性探針法檢測(cè)利福平敏感株為112株，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.1667，P=0.6831)。在異煙肼耐藥檢測(cè)上，這兩種分子方法檢測(cè)結(jié)果比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討 論

結(jié)核分枝桿菌耐藥性主要發(fā)生在特定基因組的堿基突變引起的，包括藥物靶點(diǎn)的基因或藥物活性有關(guān)的酶基因。約95%的利福平耐藥菌株是由rpoB基因上81bp的耐藥決定區(qū)突變所致，約80%以上的異煙肼耐藥結(jié)核分枝桿菌發(fā)生在katG 315密碼子、inhA啟動(dòng)子的-15和-8位或ahpC啟動(dòng)子區(qū)域的-6～-47位點(diǎn)的堿基突變[4]。隨著對(duì)耐多藥結(jié)核病耐藥機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深入，分子診斷技術(shù)逐漸成為耐藥結(jié)核病快速診斷的發(fā)展趨勢(shì)。熒光PCR探針熔解曲線法是PCR和熔解曲線分析方法的結(jié)合，由于野生型序列具有自身特定的熔點(diǎn)，當(dāng)基因突變時(shí)探針結(jié)合力下降導(dǎo)致熔點(diǎn)下降，通過監(jiān)測(cè)熒光雜交信號(hào)區(qū)分出野生型與突變型。線性探針技術(shù)是由德國Hain Lifescience公司推出的一種基于多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與固化在試紙條上的特異性探針反向多位點(diǎn)DNA雜交，通過雜交條帶的顯色情況判斷結(jié)核菌株對(duì)利福平耐藥相關(guān)基因rpoB和異煙肼耐藥基因KatG、inhA基因啟動(dòng)子的野生型及突變型，判斷是否耐藥。這兩種分子技術(shù)方法可用于一線抗結(jié)核藥物利福平和異煙肼耐藥突變的檢測(cè)，在制定耐藥結(jié)核病的治療方法和管理上具有重要的使用價(jià)值。

本文以表型藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR探針熔解曲線法對(duì)142例結(jié)核分枝桿菌臨床分離株檢測(cè)利福平耐藥的敏感性和特異性與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[5-6]。該方法對(duì)異煙肼耐藥的特異性和符合率高，但敏感性略低于以往文獻(xiàn)報(bào)道[7-8]，可能因?yàn)樵噭┖兄缓w80%耐藥檢測(cè)位點(diǎn)及低水平耐藥等因素相關(guān)。不同文獻(xiàn)報(bào)道線性探針檢測(cè)結(jié)核耐藥性的敏感性和特異性存在著差異，本文以表型藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)，線性探針法對(duì)142例結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，檢測(cè)利福平耐藥的敏感性和特異性與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[9-11]，但對(duì)異煙肼耐藥檢測(cè)的敏感性不同文獻(xiàn)報(bào)道不一致，與一些文獻(xiàn)基本一致[11- 12]，卻低于其他文獻(xiàn)報(bào)道[9-10]。本文線性探針法檢測(cè)利福平耐藥菌株中發(fā)生rpoB S531L最常見，其次為rpoB 526位點(diǎn)和rpoB 516位點(diǎn)。異煙肼耐藥菌株中最常見的突變位點(diǎn)為KatG S315T。線性探針檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥性的常見突變耐藥位點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道相符合[13]。這兩種分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)異煙肼耐藥性檢測(cè)的敏感性均低于表型藥敏試驗(yàn)，分析其原因：異煙肼耐藥機(jī)制很復(fù)雜，還存在其他耐藥機(jī)制及低水平耐藥情況；兩種分子檢測(cè)方法所使用的試劑盒未能完全涵蓋異煙肼耐藥的所有突變位點(diǎn)等因素有關(guān)。另外結(jié)核桿菌壁堅(jiān)硬，裂解較困難，提取DNA效率不高、DNA濃度不夠可能是導(dǎo)致這兩種分子方法出現(xiàn)無效檢測(cè)現(xiàn)象的原因。

表型藥敏試驗(yàn)耗時(shí)長、操作復(fù)雜，分子生物學(xué)技術(shù)可將結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的診斷時(shí)間明顯縮短。相對(duì)于線性探針方法，熒光PCR探針熔解曲線法操作時(shí)間短、獲得結(jié)果更快速、閉管操作減少DNA污染及結(jié)果判讀自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)[14]；而線性探針法檢測(cè)可以獲得利福平和異煙肼耐藥基因突變的具體位點(diǎn)。本研究中熒光PCR探針熔解曲線和線性探針兩種分子生物學(xué)方法，對(duì)利福平和異煙肼耐藥性的檢測(cè)具有同等的檢驗(yàn)效能，與表型藥敏試驗(yàn)符合率高，一致性較好，可以早期快速診斷耐藥結(jié)核病，值得臨床推廣。