FLT3基因在成人急性淋巴細(xì)胞白血病中突變的特征及臨床意義

張雪楠，李威，郭榮群，李文文，徐婷婷，姜中興

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 血液科，河南 鄭州 450052)

FMS樣酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinases 3，F(xiàn)LT3)為Ⅲ型受體酪氨酸激酶家族(rrceptor tyrosine kinases，PTK)成員之一，在骨髓中僅表達(dá)于造血干/祖細(xì)胞中，F(xiàn)LT3與其配體(FLT3 ligand，F(xiàn)L)在正常造血細(xì)胞的增殖、分化和存活中發(fā)揮重要作用[1]。FLT3由5個(gè)免疫球蛋白樣胞外域、1個(gè)跨膜域、1個(gè)膜旁結(jié)構(gòu)域(juxtamembrane，JM)和2個(gè)由激酶插入結(jié)構(gòu)域連接的細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(tyrosine kinase domain，TKD)組成[2]，是血液系統(tǒng)惡性腫瘤中常見(jiàn)的突變基因之一，JM的內(nèi)串聯(lián)重復(fù)(internal tandem duplication，ITD)和TKD的激活環(huán)中天冬氨酸835點(diǎn)突變是其最常見(jiàn)的兩種突變類型[3]。急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是一種發(fā)生在B細(xì)胞或T細(xì)胞系的具有獨(dú)特遺傳學(xué)特征的克隆性造血系統(tǒng)疾病[4]。FLT3突變?cè)诩毙运柘蛋籽?acute myeloid leukemia，AML)中很常見(jiàn)(約占30%)[5-6]，而在ALL中較少見(jiàn)且預(yù)后及意義不明，常發(fā)生在MLL基因重排ALL和高超二倍體(>50條染色體)ALL中[7-8]。本研究對(duì)250例成人ALL患者進(jìn)行二代測(cè)序(next generation sequencing，NGS)，探討FLT3基因突變特征及其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 病例資料選取2017年1月至2020年3月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科就診的初治成人ALL患者250例。所有患者均按照MICM(細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué))確診和分型(WHO 2016診斷標(biāo)準(zhǔn)[9])。250例患者中，急性B淋巴細(xì)胞白血病(acute B cell lymphoblastic leukemia，B-ALL)205例，急性T淋巴細(xì)胞白血病(acute T cell lymphoblastic leukemia，T-ALL)45例，男性137例，女性113例，年齡14～82歲，中位年齡30歲，初診外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)(0.10～465)×109L-1，中位白細(xì)胞計(jì)數(shù)15.8×109L-1。本研究骨髓標(biāo)本采集患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑與儀器本研究所用血液基因組DNA提取試劑盒(0.1～1 mL)為中國(guó)Tiangen公司產(chǎn)品，配套試劑為上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)的ALL相關(guān)基因突變檢測(cè)試劑盒(22)及美國(guó)Illumina公司生產(chǎn)的Miseq v2-25m(reads)試劑盒。白血病免疫分型采用美國(guó)Becton Dickinson公司生產(chǎn)的FACSC anto流式細(xì)胞儀及配套單克隆抗體。突變基因檢測(cè)采用美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)的普通PCR、德國(guó)Eppenddorf公司生產(chǎn)的低溫離心機(jī)及美國(guó)Illumina公司生產(chǎn)的Miseq二代測(cè)序儀。

1.3 標(biāo)本采集與基因檢測(cè)采集患者初診時(shí)骨髓液標(biāo)本2～4 mL，肝素管抗凝，收集骨髓單個(gè)核細(xì)胞后進(jìn)行DNA提取，具體制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[10-11]。FLT3基因的14、15和第20外顯子(exon)擴(kuò)增引物序列參見(jiàn)文獻(xiàn)[11-12]，余包括NOTCH1、IL-7R、TP53、JAK3、CREBBP、FBXW7、PAX5、IKZF1、JAK1、PHF6、SH2B3、JAK2、CRLF2、PTEN、NT5C2在內(nèi)的共16種突變基因的二代測(cè)序操作流程參見(jiàn)文獻(xiàn)[12]。流式細(xì)胞免疫表型分析方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[13]。

1.4 療效評(píng)定及指標(biāo)分析250例患者中，20例未在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院治療，余患者根據(jù)情況接受VDC(L)P[長(zhǎng)春新堿類+蒽環(huán)類+環(huán)磷酰胺+(門冬酰胺酶)+糖皮質(zhì)激素]方案誘導(dǎo)治療，BCR-ABL陽(yáng)性患者加用伊馬替尼、達(dá)沙替尼等酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)。依據(jù)《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[14]評(píng)定療效。所有病例隨訪至2020年6月30日，采用查閱住院病例及電話聯(lián)系的方式，失訪患者17例，失訪率6.80%(17/250)?？偵嫫?overall survival，OS)指從確診至死亡或末次隨訪日期的時(shí)間。無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)指從治療后第1次完全緩解(complete remission，CR)至第1次復(fù)發(fā)或緩解期死亡或末次隨訪日期的時(shí)間。收集并分析患者的臨床指標(biāo)，包括患者性別、年齡、實(shí)驗(yàn)室檢查[白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell，WBC)、血紅蛋白(hemoglobin，Hb)、血小板計(jì)數(shù)(platelet，PLT)、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值(lymphocyte count，LYM)、外周血細(xì)胞形態(tài)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞學(xué)、染色體、融合基因、突變基因、FLT3突變類型及突變位點(diǎn)等]、影像學(xué)檢查、確診時(shí)間及轉(zhuǎn)歸。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以中位數(shù)(四分位數(shù))即M(P25，P75)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU-test(非參數(shù)檢驗(yàn))；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和率(%)表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線，并用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1FLT3基因在成人ALL中的突變特征250例初發(fā)成人ALL患者中，共觀察到FLT3突變11例(詳見(jiàn)表1)，突變率為4.40%(11/250)，突變總頻次12次(1例雙突變)，分別包括2個(gè)ITD突變、5個(gè)TKD突變(2個(gè)D835和Y842C、D839G、836_837del共3個(gè)非D835)、2個(gè)膜旁插入缺失突變(juxtamembrane indel mutation，JM-InDel)(Y597delinsPY、598_600del)和3個(gè)膜旁點(diǎn)突變(juxtamembrane point mutation，JM-PM)(Y589H、F594I、V592A)。6例發(fā)生在外顯子14，5例發(fā)生在外顯子20。其中男性5例(45.45%)，女性6例(54.55%)。8例突變發(fā)生在B-ALL(3.90%，8/205)，3例突變發(fā)生在T-ALL(6.67%，3/45)，B-ALL與T-ALL兩組FLT3突變率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.174，P=0.676)。

表1 FLT3基因突變患者臨床特征

2.2FLT3基因突變與臨床、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性FLT3突變組與無(wú)突變組患者年齡、性別、WBC、Hb、PLT、LYM、LDH、骨髓及外周血原始細(xì)胞比率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組臨床指標(biāo)對(duì)比[M(P25，P75)]

2.3FLT3基因突變與預(yù)后生存的相關(guān)性患者OS時(shí)間0.1～40個(gè)月，中位OS時(shí)間18.40個(gè)月，PFS時(shí)間0.1～40個(gè)月，中位PFS時(shí)間9.90個(gè)月。FLT3突變組中位OS時(shí)間18.50個(gè)月，無(wú)突變組中位OS時(shí)間17.30個(gè)月，兩組OS比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.006，P=0.941)(圖1)；FLT3突變組中位PFS時(shí)間10.00個(gè)月，無(wú)突變組中位PFS時(shí)間9.90個(gè)月，兩組PFS比較，差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.305，P=0.581)(圖2)，考慮可能與FLT3突變患者病例數(shù)較少有關(guān)。

圖1 兩組總生存分析比較

圖2 兩組無(wú)進(jìn)展生存分析比較

3 討論

ALL是在骨髓、外周血以及其他器官以未成熟淋巴細(xì)胞惡性增殖為特征的高度異質(zhì)性腫瘤，其生物學(xué)特征和臨床表現(xiàn)具有高度異質(zhì)性，成人ALL與兒童ALL，T-ALL與B-ALL之間都具有不同的臨床及實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)[4]。雖然兒童ALL的長(zhǎng)期無(wú)病生存率超過(guò)了80%，但目前成人ALL仍然面臨復(fù)發(fā)、難治、預(yù)后差的風(fēng)險(xiǎn)。隨著對(duì)ALL發(fā)病機(jī)制的深入研究及NGS等新技術(shù)的應(yīng)用，不同分子生物學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)特征在ALL明確預(yù)后、危險(xiǎn)分層、指導(dǎo)治療方面的重要作用日益突出[15]。

目前關(guān)于FLT3突變的研究多集中于突變率較高的AML，而ALL伴FLT3突變率較低，報(bào)道較少，主要集中于嬰幼兒。Kabir等[8]報(bào)道兒童ALL中FLT3突變率為6.3%，且多見(jiàn)于MLL基因重排和高超二倍體(分別為15.7%和14.4%)，預(yù)后不明。Alkhayat等[16]報(bào)道FLT3在兒童ALL患者總體突變率為4.7%(3/64)，與預(yù)后無(wú)關(guān)。FLT3在成人ALL中的相關(guān)研究數(shù)據(jù)甚少。Zhen等[17]報(bào)道117例成人ALL中8例存在FLT3突變，突變率為6.8%，(B-ALL 4/96例，4.2%；T-ALL 4/21例，19.0%)。本研究中FLT3在成人ALL患者中的總突變率為4.40%(11/250)，位于外顯子14和外顯子20，其中B-ALL的FLT3突變率為3.90%(8/205)，T-ALL的FLT3突變率為6.67%(3/45)，突變多見(jiàn)于T-ALL，與既往報(bào)道一致。

本研究觀察到B-ALL中FLT3突變患者有2例合并存在CREBBP突變。CREBBP(或CBP，編碼CREB結(jié)合蛋白)及其類似物EP300(P300)是轉(zhuǎn)錄共激活因子，調(diào)控多個(gè)參與癌癥發(fā)病的基因，在染色質(zhì)重塑中起重要作用，可能與淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤的預(yù)后有關(guān)[18]。既往無(wú)CREBBP與FLT3共突變相互作用的文獻(xiàn)報(bào)道。此外，本研究還觀察到FLT3與PAX5突變共存的現(xiàn)象，PAX5是B細(xì)胞分化和發(fā)育中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子[19]，既往未見(jiàn)與FLT3共突變的報(bào)道。本研究中3例共突變患者均持續(xù)緩解，預(yù)后較好，F(xiàn)LT3與CREBBP/PAX5突變是否具有相互作用及其對(duì)預(yù)后的影響有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)行更深入的突變功能機(jī)制研究。本研究未發(fā)現(xiàn)FLT3突變與NOTCH1、IL-7R、JAK3、TP53、FBXW7、CRLF2等基因突變合并存在。

研究報(bào)道，F(xiàn)LT3突變大多是激活突變，ITDS可能干擾JM結(jié)構(gòu)域的抑制性結(jié)構(gòu)域并促進(jìn)二聚化。D835突變被認(rèn)為是改變構(gòu)型，暴露酪氨酸激酶的活性位點(diǎn)，并允許增加ATP和底物的進(jìn)入，以增加固有的酪氨酸激酶活性水平，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)性酪氨酸激酶激活[20]。關(guān)于JM-InDel的報(bào)道較少，Chatain等[21]在7例AML患者中發(fā)現(xiàn)FLT3膜旁區(qū)(n=6)和跨膜區(qū)(n=1)的缺失或缺失插入，進(jìn)而導(dǎo)致FLT3蛋白的框內(nèi)缺失(n=4)和截短突變(n=3)，通過(guò)促進(jìn)抑制域和激酶結(jié)構(gòu)域的分離，F(xiàn)LT3的自抑制構(gòu)象被破壞，導(dǎo)致FLT3下游信號(hào)通路的結(jié)構(gòu)性激活，并且對(duì)FLT3激酶抑制劑的敏感性高于ITD，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。本研究中Y597delinsPY、598_600del突變既往未見(jiàn)報(bào)道。FLT3-JM-PM位于氨基酸V572和D600之間，本研究中Y589H、F594I、V592A在AML中均已被證實(shí)是激活突變，可導(dǎo)致FLT3下游信號(hào)通路的組成性激活，并對(duì)FLT3激酶抑制劑敏感[20]。本研究中例9初始高白細(xì)胞的T-ALL患者，化療半療程未緩解，加用索拉菲尼后目前持續(xù)緩解，表明FLT3抑制劑可能對(duì)FLT3突變的難治ALL患者有利，但由于例數(shù)較少，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行臨床研究并長(zhǎng)期隨訪觀察預(yù)后。

FLT3突變?cè)贏ML患者中約占30%，其中FLT3-ITD突變與預(yù)后不良顯著相關(guān)，而FLT3-TKD點(diǎn)突變與AML預(yù)后的相關(guān)性仍不明確。與AML不同，ALL中FLT3突變占1%～3%，且TKD比ITD突變更常見(jiàn)[5-8]。由于突變率低，既往研究幾乎均顯示FLT3突變對(duì)ALL患者預(yù)后無(wú)顯著影響。本研究顯示，11例患者除1例半療程緩解后死亡外，余10例患者1個(gè)療程均CR，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與BCR-ABL融合基因、中樞神經(jīng)系統(tǒng)侵犯有關(guān)，這和FLT3突變的AML患者治療難度大且預(yù)后不良這一臨床特征有所不同。通過(guò)分析未發(fā)現(xiàn)FLT3突變與ALL患者的臨床預(yù)后顯著相關(guān)，但傾向于改善OS和PFS，原因可能是由于FLT3突變病例少，治療方案不同以及隨訪時(shí)間不足等。需要擴(kuò)大樣本量來(lái)最終闡明ALL中FLT3突變的臨床相關(guān)性。

綜上所述，本研究表明FLT3突變?cè)诔醢l(fā)成人ALL患者中不常見(jiàn)，觀察到的部分突變位點(diǎn)及共突變基因類型在成人ALL中未見(jiàn)報(bào)道，其功能和機(jī)制有待深入探討。FLT3突變與預(yù)后無(wú)明確相關(guān)性，F(xiàn)LT3抑制劑可能對(duì)FLT3突變的難治ALL患者有利，需要更大樣本量的前瞻性臨床研究進(jìn)一步明確FLT3突變?cè)诔扇薃LL中的預(yù)后意義。