生物炭對白漿土土壤微生物功能多樣性的影響

陸欣春，鄭永照，韓曉增，陳 旭，鄒文秀，嚴(yán) 君

(1.中國科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150081；2.通化市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,吉林 梅河口 135007)

0 引 言

生物炭施用能夠改變土壤物理化學(xué)屬性，改變土壤微生物群落組成和豐度，減少溫室氣體釋放，降低有毒元素對植物的侵害，提升土壤肥力和增加作物產(chǎn)量[1-4]。生物炭作為一種新型的土壤改良劑，因其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)(高堿度、高比表面積、多孔隙結(jié)構(gòu)和高灰分等)，被認(rèn)為可能是未來改良酸性土壤的有效途徑，也因此引起了國內(nèi)外科研工作者的廣泛關(guān)注[5]。

目前主要采用Biolog-Eco技術(shù)通過對碳源底物利用情況的分析，評價(jià)微生物群落功能多樣性。然而，不同的生物炭類型、施用水平之間生物炭添加對土壤微生物群落功能的影響是不同的[6]。施用生物炭提高根際土壤微生物對糖類、氨基酸類和羧酸類碳源的利用能力，生物質(zhì)炭≥40 t·hm-2塿土土壤微生物對氨基酸類、羧酸類的利用能力最強(qiáng)[7]。武愛蓮等[8]通過在褐土上施用生物炭的研究表明，施用生物炭后改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成，降低了褐土土壤中的微生物活性，進(jìn)而減少或改變了褐土土壤微生物對碳源的利用種類和強(qiáng)度。Zhu等[9]研究表明，我國北方地區(qū)農(nóng)民為追求高產(chǎn)而過度施用化肥，不施用有機(jī)肥，使土壤無法分解肥害，致使土壤嚴(yán)重酸化(pH<4.0)，嚴(yán)重影響玉米產(chǎn)量。目前，關(guān)于生物炭對土壤改良、肥力提升以及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)方面已有很多報(bào)道[4,10-11]，而針對中國東北長期施化肥造成的酸化土壤中微生物群落功能對生物炭改良的反應(yīng)的研究還較少。本研究選取了我國東北典型旱地白漿土土壤，以玉米秸稈生物炭為原料，采用不同施用量的生物炭改良酸化白漿土土壤，以明確其改良過程中生物炭施用對土壤微生物對碳源的代謝利用特征。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)于2018年4月在吉林省通化農(nóng)科院梅河口海龍鎮(zhèn)前進(jìn)村試驗(yàn)田(42°36′N，125°53′E)進(jìn)行，供試前土壤的有機(jī)碳含量15.1 g·kg-1，全氮含量1.42 g·kg-1，速效磷61.4 mg·kg-1，速效鉀136.7 mg·kg-1，pH(水土比2.5∶1)為4.52。試驗(yàn)區(qū)地勢平坦，屬于溫帶大陸性季風(fēng)氣候，夏季高溫多雨，冬季寒冷干燥。年均氣溫4～6 ℃，年降水量600～750 mm，其中6～9月的降水量占全年降水的70%左右。試驗(yàn)區(qū)土壤類型為典型白漿土。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置了4個(gè)生物炭處理：生物炭添加量為0、15 t、30 t和60 t·hm-2處理，代碼依次為C0t、C1t、C2t和C3t。每個(gè)處理3次重復(fù)，共12個(gè)小區(qū)，小區(qū)規(guī)格為3 m×10 m，各小區(qū)之間有兩行的保護(hù)行。2018年5月3日田間試驗(yàn)開始前，將供試生物炭磨細(xì)過1 mm篩后，一次性撒施于表層土壤，深翻使之與耕層土壤充分混勻，之后不再施用生物炭。生物炭的基本理化性質(zhì)：有機(jī)碳447.7 g·kg-1，全磷3.4 g·kg-1，全鉀31.3 g·kg-1，pH(水土比2.5∶1)為7.89。

1.3 土樣采集與分析

于2019年9月28日玉米成熟期前，采集0～20 cm土壤樣品。每個(gè)小區(qū)內(nèi)采集5個(gè)點(diǎn)的新鮮土壤樣品，然后混合均勻后作為一個(gè)處理的樣品。隨后，將新鮮土壤樣品迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，去除雜草、落葉及樹枝等過2 mm篩混合均勻，放入無菌袋中，于4 ℃冰箱中保存，用于測定土壤的含水量及微生物的功能多樣性。土壤微生物功能多樣性采用Biolog-Eco測定[12]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

碳源利用的強(qiáng)度、多樣性和優(yōu)勢度指數(shù)分別采用反應(yīng)孔顏色的平均變化率(Average well color development，AWCD)、Richness豐富度指數(shù)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Simpson優(yōu)勢度指數(shù)來評估，具體的計(jì)算公式參照Keylock和Strong的方法[13-14]。采用Microsoft Excel 2019、SPSS 20.0整理分析試驗(yàn)結(jié)果，采用Origin 9.0繪制圖形。

2 結(jié)果分析

2.1 生物炭添加對土壤微生物利用碳源的動(dòng)力學(xué)特征的影響

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，不同處理下土壤微生物利用碳源代謝活性的AWCD逐漸增加，呈S型曲線(圖1)。培養(yǎng)24 h內(nèi)，各處理間AWCD值無明顯變化，24 h～48 h之間C0t和C1t處理AWCD值無顯著變化，C2t和C3t處理AWCD值開始快速增長，且與C0t和C1t處理差異顯著；48 h～168 h之間C1t、C2t和C3t處理AWCD值呈現(xiàn)快速增長的趨勢，此時(shí)土壤微生物對碳源的綜合利用能力最強(qiáng)。168 h后AWCD值增長趨于平緩，微生物對碳源的利用能力逐漸減弱。因此，采用不同生物炭量處理168 h時(shí)的AWCD值進(jìn)行土壤微生物碳源代謝活性的進(jìn)一步分析。

圖1 不同量生物炭處理下土壤微生物碳源平均利用率的變化Fig.1 AWCD of microorganisms under different biochar application rates

不同處理土壤培養(yǎng)192 h內(nèi)，土壤微生物AWCD值的整體變化表現(xiàn)為C3t>C2t>C1t>C0t(P<0.05)。培養(yǎng)168 h時(shí)，C3t、C2t和C1t處理較C0t處理AWCD值分別增加了29.7%、22.9%和21.2%，其中當(dāng)生物炭添加量為60 t·hm-2時(shí)，土壤微生物的AWCD值最高達(dá)到1.17。原始土壤樣品添加生物炭后，土壤微生物代謝活性發(fā)生顯著變化，表明添加生物炭有助于土壤微生物代謝活性及其對碳源利用能力的提高。

2.2 生物炭添加對土壤微生物功能多樣性指數(shù)的影響

表1是土壤培養(yǎng)168 h時(shí)的吸光值，土壤微生物功能多樣性指數(shù)的計(jì)算。隨著生物炭添加量的增加，土壤豐富度指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)均顯著增加(P<0.05)，表現(xiàn)為：C3t>C2t>C1t>C0t。C0t處理的土壤豐富度指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)顯著低于添加生物炭處理(C1t、C2t和C3t處理)。生物炭添加量為15 t·hm-2時(shí)，土壤微生物對碳源利用的豐富度指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)顯著增加，當(dāng)生物炭添加量達(dá)到60 t·hm-2時(shí)，各指數(shù)均達(dá)到最高。

表1 不同生物炭添加量對土壤微生物功能多樣性指數(shù)的影響Table 1 Functional diversity indexes of microorganisms under different biochar application rates

2.3 生物炭添加對碳源利用多樣性的主成分分析

對不同生物炭添加處理下168 h的土壤微生物碳源代謝進(jìn)行主成分分析，可了解不同生物炭處理后土壤微生物群落功能的綜合差異和相似狀況。圖2可知，4個(gè)處理在31種碳源構(gòu)建的主成分分析中存在明顯的空間分異，整體可分為C0t、C1t、C2t和C3t三大類。C0t、C1t分別在第三和第一象限中分布，C2t和C3t相聚較近均分布在第四象限中。主成分方差分析可知，不同生物炭量添加處理在PC1和PC2軸上的得分系數(shù)差異顯著(表2)，在PC1軸上，C0t、C1t、C2t、C3t處理之間差異顯著；在PC2軸上，C0t、C1t處理與C2t和C3t處理之間差異顯著，C2t和C3t處理間差異不顯著，表明C2t和C3t處理的碳源代謝功能特征相似。進(jìn)一步對PC1和PC2貢獻(xiàn)的特征向量系數(shù)大于0.5的碳源類型進(jìn)行分析表明，對PC1貢獻(xiàn)大的碳源有30種，其中碳水化合物類有11種，占碳源總數(shù)的35.5%；對PC2貢獻(xiàn)大的碳源有4種，主要是碳水化合物類(9.7%)和胺類(6.5%)。

圖2 不同生物炭處理下土壤微生物碳源代謝主成分分析Fig.2 Principal component analysis on the functional diversity of microorganisms under different biochar application rates

表2 不同生物炭施用量處理主成分得分系數(shù)Table 2 Principal component scores under different biochar application rates(mean±SD)

2.4 土壤微生物生理碳代謝指紋圖譜分析

土壤微生物Biolog代謝指紋圖譜，能夠較為全面的反映微生物群落代謝功能特征。由圖3可知(以培養(yǎng)168 h數(shù)據(jù)為例)，不同生物炭添加量處理土壤微生物群落對碳源利用率存在差異。C0t處理對多聚物類利用最高，達(dá)到40.5%，其次是碳水化合物類(32.8%)；而C1t、C2t和C3t處理則對碳水化合物類(29.3%～34.9%)、氨基酸類(22.0%～25.2%)的利用最高。土壤微生物群落對碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類、多聚物類、酚酸類和胺類碳源的利用強(qiáng)度整體表現(xiàn)為：C3t>C2t>C1t>C0t。隨著生物炭施用量的增加，土壤微生物碳源利用種類逐漸增多，且表現(xiàn)為由多聚物類向氨基酸類和羧酸類碳源轉(zhuǎn)變的趨勢，表明生物炭施用改變了土壤中微生物對碳源的利用。

注：A2-H2：碳水化合物類；A4-F4：氨基酸類；B1-H3：羧酸類；C1-F1：多聚物類；C3和D3：酚酸類；G4和H4：胺類。Note:A2-H2:Carbohydrates; A4-F4:Amino acids; B1-H3:Carboxylic acids:C1-F1:Polymer; C3 and D3:Phenolic acids; G4 and H4:Amine.圖3 不同生物炭處理下土壤微生物生理碳代謝指紋圖譜Fig.3 Metabolic fingerprint of carbon physiological profiles of soil microbial community under different biochar application rates

不同生物炭添加量處理下，C3t處理對碳源的利用種類和強(qiáng)度最高。C0t處理可利用的碳源僅有9種(且吸光值均≤0.2)，占碳源總數(shù)的29.0%，其中對D-木糖(碳水化合物類)、吐溫-40(多聚物類)和吐溫-80(多聚物類)的利用最高，這三種碳源在添加生物炭后的利用能力顯著減弱。C1t處理可利用的碳源(土壤代謝指紋圖譜中吸光值≥ 0.8)有17種，占碳源總數(shù)的54.8%，其中對L-苯基丙氨酸(氨基酸類)、D-半乳糖醛酸(碳水化合物類)和D-甘露醇(碳水化合物類)的利用最高，且對L-苯基丙氨酸利用顯著高于其它處理(P<0.05)。C2t處理可利用的碳源有20種，占碳源總數(shù)的64.5%，其中對吐溫-80(多聚物類)、L-苯基丙氨酸(氨基酸類)和L-天冬酰胺酸(氨基酸類)的利用最高；C3t處理可利用的碳源有24種，占總碳源的77.4%，其中對L-天冬酰胺(氨基酸類)、L-精氨酸(氨基酸類)和苯乙基胺(胺類)的利用率最高，且對這三種碳源的利用顯著高于其它處理(P<0.05)。C0t對照處理土壤代謝指紋圖譜中吸光值 ≥ 0.8的碳源沒有，增施生物炭處理土壤微生物對碳源的利用能力顯著高于對照C0t處理，其中增施生物炭處理土壤微生物對D-木糖、D-半乳糖醛酸、N-乙?；?D-葡萄胺、L-天冬酰胺酸、L-蘇氨酸、吐溫-40、吐溫80、肝糖和腐胺的利用能力顯著高于C0t處理。C0t處理土壤微生物活性極其弱，但隨著生物炭的添加，C0t處理不能利用22種碳源的利用強(qiáng)度和種類逐漸增多，其中苯乙基胺(胺類)和D,L-α-甘油(碳水化合物類)在生物炭添加到30 t·hm-2時(shí)，為土壤微生物利用；而葡萄糖-1-磷酸鹽(碳水化合物類)和2-羥苯甲酸(酚酸類)則需要生物炭添加到60 t·hm-2時(shí)，為土壤微生物利用。

3 討 論

Biolog-Eco技術(shù)通過對碳源利用的吸光值變化來表征土壤微生物活性，其值越高表明土壤微生物群落的代謝活性越強(qiáng)[15]。施用有機(jī)質(zhì)和生物炭有利于土壤微生物群落和活性的增加[16-17]。本研究中，隨著生物炭施加量的增加，AWCD、多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和Simpson指數(shù)亦增加，均顯著的高于C0t處理，表明增施生物炭可顯著提高酸性土壤微生物碳源利用的能力、強(qiáng)度和群落功能多樣性。這主要是由于生物炭施用后土壤pH和C/N顯著提升，土壤容重下降，土壤孔隙度增加，為土壤微生物的生長和繁殖營造了良好的生存環(huán)境條件[18-19]。此外，生物炭添加還會引起植物根系分泌吲哚乙酸(IAA)增加，植物防御系統(tǒng)激活等，這些均會造成土壤微生物活性和多樣性增加[20-22]。Zhu等[9]研究表明，隨著生物炭量的增加，AWCD值呈下降的變化趨勢，且對多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)和Simpson指數(shù)沒有影響，這是由于土壤中缺少可利用的底物[23]，或是土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[24]。有研究表明，在白漿土、潮土、灰漠土和棕壤土上施用玉米芯生物炭，試驗(yàn)前期未添加生物炭處理的AWCD以及多樣性指標(biāo)均高于添加生物炭處理[10]。在肥力較高、土壤屬性優(yōu)于白漿土的黑土耕地上的研究表明，低質(zhì)量分?jǐn)?shù)外源生物炭的添加可以促進(jìn)黑土土壤微生物代謝活性增加，而高濃度生物炭的添加則抑制土壤微生物的代謝活性[25]。不同試驗(yàn)產(chǎn)生的結(jié)論不同，主要與試驗(yàn)所用生物炭的原料及生產(chǎn)工藝不同從而使生物炭的理化性質(zhì)不同有關(guān)，主要體現(xiàn)在全碳含量及生物炭的pH值上，此外與土壤本身的質(zhì)地和酸堿度有關(guān)；另一方面與作物根系活力及生育時(shí)期有關(guān)，作物將40%以上光合固定的碳源以根系分泌物等形式釋放到土壤環(huán)境中，因此根系活動(dòng)及與微生物的相互作用最為密切，是直接導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的因素[26]。

主成分分析結(jié)果表明，不同生物炭量添加處理在PC1和PC2軸上的得分系數(shù)差異顯著，C0t處理和C1t、C2t、C3t處理對第一主成分(PC1)相關(guān)碳源的利用率較大；C1t、C2t和C3t處理對第二主成分(PC2)相關(guān)的碳源的利用率較大。PC1和PC2得分系數(shù)與31種碳源吸光值相關(guān)系數(shù)，相關(guān)系數(shù)越大表明該碳源主成分的影響越大[27]。朱珂等[28]在白漿土玉米不同生育時(shí)期根際細(xì)菌群落代謝特征的研究表明，根際細(xì)菌群落主要利用的碳源是碳水化合物類和氨基酸類，占碳源利用的55%以上。而本研究中白漿土在添加生物炭后土壤微生物主要利用碳水化合物類和胺類。碳代謝指紋圖譜結(jié)果表明，C0t處理的碳代謝能力最低，增施生物炭后土壤微生物對吐溫80、D-木糖、D-半乳糖醛酸、N-乙?；?D-葡萄胺、L-天冬酰胺酸、肝糖、L-蘇氨酸、吐溫-40和腐胺的利用能力增強(qiáng)且顯著高于C0t處理，表明增施生物炭改變了土壤微生物群落組成，進(jìn)而影響了對某些碳源的代謝。生物炭添加量不同對土壤微生物利用糖類、氨基酸類、羧酸類、聚合物類碳源的微生物的代謝活性和多樣性的影響不同。這可能是由于增施生物炭后引起植物殘?bào)w和根系分泌物增多，為土壤微生物存活提供了大量可利用的碳水化合物類、氨基酸類等能源物質(zhì)，進(jìn)而引起土壤微生物活性和碳源代謝能力增強(qiáng)[29]。

C2t和C3t處理的豐富度指數(shù)、Shannon-wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)較為接近，兩者對六類碳源的利用能力也類似。分析其原因可能是該處理土壤微生物對碳源的利用能力有限，從而導(dǎo)致土壤微生物的豐富度增加不明顯。因此，應(yīng)根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)以及對土壤微生態(tài)環(huán)境的影響需要適量添加生物炭。土壤微生物功能多樣性可作為評價(jià)土壤質(zhì)量變化的敏感指標(biāo)。Biolog代謝指紋圖譜能夠較為全面快速反映微生物群落碳源代謝活性和功能差異，但無法明確具體產(chǎn)生這種差異的微生物來源。今后的研究中，在分析微生物群落功能差異的同時(shí)，還應(yīng)該綜合宏基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)等分子生物學(xué)方法，分析生物炭施用量對土壤微生物多樣性、土壤環(huán)境因子以及根系分泌物之間的關(guān)系，這樣才能全面揭示生物炭添加對土壤微生物群落功能影響的生態(tài)學(xué)過程和發(fā)生顯著變化的內(nèi)在機(jī)制，從而為指導(dǎo)生產(chǎn)提供更可靠詳實(shí)的理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

(1)增施生物炭能夠顯著提高土壤微生物的碳源利用能力，且隨著生物炭施用量的增加，AWCD值逐漸增強(qiáng)。

(2)增施生物炭改變土壤微生物群落功能，碳源相對利用率從多聚物類向碳水化合物類和氨基酸類碳源轉(zhuǎn)變。

(3)白漿土土壤生物炭最理想的添加量為30 t·hm-2。