粗飼料顆粒替代玉米青貯對肉牛瘤胃發(fā)酵及微生物菌群的影響

祁有鵬，左志，石斌剛，董巧霞，張雪萍，趙芳芳，趙世杰，李少斌，權(quán)金鵬，甘輝林，胡江

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅省草食動物生物技術(shù)重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2.張掖市草原工作站，甘肅 張掖 734000)

農(nóng)作物秸稈是草食動物重要的粗飼料資源.我國農(nóng)作物秸稈資源豐富，據(jù)估計秸稈理論收集量10.4億t，實際可收集量8.26億t，玉米、水稻和小麥3類秸稈占總量的79.19%[1].秸稈粗纖維含量高、質(zhì)地粗硬、適口性差，且不易長途運輸?shù)纫蛩赜绊懥孙暳匣肹2].為提高秸稈資源的利用率，充分發(fā)掘其飼用潛力，很多學(xué)者開展了不同研究，如青貯[3]、混貯[4]、氨化[5]、顆?；痆6]等.顆粒化是秸稈等粗飼料的重要處理方式之一.秸稈制成顆粒，其密度較玉米秸稈增加10倍，體積減小而容重增加，便于長途運輸和儲藏[7-8]；秸稈制粒后適口性也有所改善，可提高動物的采食量和利用率[9].

秸稈等粗飼料是飼喂反芻動物的重要飼料資源.反芻動物瘤胃中多種微生物相互協(xié)作，將攝入的飼料營養(yǎng)物質(zhì)分解為揮發(fā)性脂肪酸(VFA)、氨基酸、肽鏈和NH3-N，并成為體內(nèi)代謝和合成過程的重要前體物質(zhì)及調(diào)節(jié)物質(zhì)，為動物生長、生產(chǎn)提供能量和營養(yǎng)，同時影響瘤胃中其他微生物活動[10-11].粗飼料類型及物理狀態(tài)是影響瘤胃發(fā)酵和微生物菌群的重要因素[12].許多研究表明，反芻動物瘤胃pH、NH3-N濃度、VFA含量及組成等受粗飼料物理形態(tài)影響，也受采食量、飼料組成、營養(yǎng)成分消化率、微生物利用率和瘤胃排出速度等因素共同作用[13].如結(jié)構(gòu)粗糙的飼料，動物采食、咀嚼及反芻時間延長，唾液增多以加強對瘤胃緩沖，進而影響瘤胃發(fā)酵[14].瘤胃微生物區(qū)系隨反芻動物品種、年齡、生理、飼養(yǎng)管理條件及日糧組成等改變而發(fā)生動態(tài)變化，其中粗飼料物理形態(tài)和組成影響瘤胃微生物種類.Yang等[15]報道，飼料顆粒大小影響其在瘤胃內(nèi)消化、外流速度，進而影響微生物蛋白合成及其在腸道消化；楊宏波等[16]研究表明，高精料全價顆粒飼料可抑制奶公犢牛瘤胃纖維降解菌和厭氧真菌生長；周封文[17]報道，飼喂秸稈顆粒日糧時，小尾寒羊瘤胃原蟲數(shù)量減少而總細菌數(shù)量增加.因此，粗飼料種類和狀態(tài)顯著影響瘤胃生態(tài)環(huán)境，而瘤胃環(huán)境反作用于微生物活動，最終影響粗飼料在瘤胃中的降解速率[18-19].

秸稈的合理加工調(diào)制是提高粗飼料品質(zhì)，進而改善反芻動物瘤胃環(huán)境以提高微生物對其利用效率的重要措施.目前，粗飼料顆粒對肉牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)及微生物的影響報道很少.本試驗采用玉米秸稈和苜蓿干草混合制成粗飼料顆粒，替代部分全株玉米青貯飼料育肥架子牛，評估粗飼料結(jié)構(gòu)及加工方式對肉牛瘤胃發(fā)酵和菌群的影響，為秸稈資源合理利用和肉牛飼料科學(xué)配制提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設(shè)計

肉牛育肥試驗于2018年9月4日至2019年1月16日，在甘肅省民樂縣希諾農(nóng)牧業(yè)有限公司進行.選擇18月齡、體質(zhì)量約(424.98±19.07)kg的健康西門塔爾雜種公牛(西門塔爾?！帷帘镜攸S?！?20頭，分為4組，每組5頭；試驗組1、2和3的粗飼料組成分別為粗飼料顆粒20%+全株青貯玉米80%、粗飼料顆粒50%+全株青貯玉米50%和粗飼料顆粒80%+全株青貯玉米20%，對照組粗飼料全部為全株青貯玉米.試驗牛預(yù)飼期15 d，正飼期120 d(前期90 d，后期30 d).育肥期結(jié)束后，每組選擇3頭體質(zhì)量接近的肉牛采集瘤胃液，測定4組瘤胃發(fā)酵參數(shù)，經(jīng)表型性狀篩選后，運用16S rDNA高通量測序分析試驗組3和對照組的瘤胃菌群多樣性.

1.2 試驗日糧

粗飼料顆粒為風干玉米秸稈和苜蓿干草粉碎后，按1∶1比例混合，使用PELLET MILL環(huán)模制粒機(SZLH-420)制粒.其中秸稈原料粉碎粒度8 mm，總水分含量8%，環(huán)?？讖? mm，顆粒長度3～4 cm.按照《肉牛飼養(yǎng)標準 NY/T 815-2004》[20]配制試驗牛各階段日糧，日糧組成及營養(yǎng)成分見表1.

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗肉牛編號入舍，預(yù)飼期用伊維菌素驅(qū)蟲，小蘇打健胃；試驗期肉牛拴系飼養(yǎng)，人工飼喂，自由采食；每天6∶00和17∶00飼喂1次，飼喂后2 h飲水.

表1 試驗牛日糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

每天清掃圈舍，定期消毒.

1.4 樣品采集

育肥期結(jié)束，每組選擇3頭體質(zhì)量接近的肉牛晨飼前屠宰，迅速從腹腔取出瘤胃，立即打開瘤胃，從瘤胃不同部位取出內(nèi)容物、混勻，取約200 mL瘤胃液四層紗布過濾，分裝到4個50 mL離心管中，立即投入液氮中帶回實驗室，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，分別用于揮發(fā)性脂肪酸、氨氮濃度及微生物區(qū)系測定.

1.5 測定方法

1.5.1 NH3-N測定 NH3-N測定采用比色法[21].本試驗確定的標準曲線為：

y=1.501 8x+0.021 7R2=0.992 6

式中：y為氨氮濃度(mmol/L)；x為光密度讀數(shù)；R2為常數(shù).

1.5.2 瘤胃揮發(fā)性脂肪酸(VFA)測定 瘤胃液解凍后，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，5 400 r/min離心10 min，取1 mL上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入0.2 mL含有內(nèi)標物2-乙基丁酸的25%(W/V)偏磷酸溶液混勻，冰浴30 min以沉降蛋白，10 000 r/min離心10 min，再將上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中4℃保存待測.VFA采用安捷倫(Agilent)6890N 型氣相色譜儀測定瘤胃液中VFA含量.色譜柱為HP 19091N-213毛細管柱，進樣量0.6 μL.色譜條件：進樣口溫度220 ℃、N2流量2.0 mL/min、分流比40∶1，程序升溫模式(120℃保持3 min，而后10 ℃/min升高至180℃保持1 min)，色譜儀內(nèi)裝氫離子火焰檢測器(FID)，載氣為高純氮氣，F(xiàn)ID 250 ℃，F(xiàn)ID空氣、H2和N2流量分別為450、40、45 mL/min.

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 24.0的one-way ANOVA對VFA和氨氮濃度測定數(shù)據(jù)進行方差分析，用Duncan法進行多重比較；用t檢驗進行菌群多樣性分析；利用Welch′st檢驗?zāi)Ｐ丸b別兩比較組間差異KEGG通路.

2 結(jié)果與分析

2.1 粗飼料顆粒對育肥肉牛瘤胃發(fā)酵的影響

育肥肉牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)測定結(jié)果見表2.粗飼料顆粒替代不同比例全株玉米青貯，對育肥肉牛瘤胃液NH3-N、乙酸、丙酸和乙酸/丙酸比值有顯著影響.NH3-N濃度隨粗飼料顆粒替代比例增加而下降，且對照組NH3-N濃度顯著高于試驗組(P<0.05)；試驗3組瘤胃液乙酸濃度最低且極顯著低于試驗1組(P<0.01)，顯著低于對照組和試驗2組(P<0.05)，丙酸濃度最高且極顯著高于其他組(P<0.01)，乙酸/丙酸比值最低且極顯著低于試驗2組(P<0.01)，顯著低于對照組和試驗1組(P<0.05).粗飼料顆粒替代比對總揮發(fā)性脂肪酸和丁酸含量無顯著影響(P>0.05).

2.2 肉牛瘤胃菌群的基因序列和多樣性分析

2.2.1 肉牛瘤胃菌群DNA的PCR擴增和高通量測序 從對照組和試驗組3中，每組各取3個肉牛瘤胃液樣品，對瘤胃菌群16S rRNA基因V3+V4高變區(qū)進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.8%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增條帶清晰，無非特異性擴增條帶.經(jīng)Illumina HiSeq測序平臺測序，2組肉牛共獲得972 358 Reads對，雙端Reads拼接、過濾后共產(chǎn)生946 944條質(zhì)控后tags(clean tags)，去除嵌合體產(chǎn)生的928 445條有效 Tags (effective tags)，每個樣品至少產(chǎn)生137 965條Clean tags，平均產(chǎn)生155 258條Clean tags.用 Uparse 軟件對所有樣品有效Tags 以97%的一致性聚類，共獲得6 004個操作分類單位(OTUs)，不同樣本的OTUs和Tags數(shù)量見圖1.

表2 粗飼料顆粒對肉牛瘤胃內(nèi)環(huán)境的影響

CK：對照組；T3：試驗組3.CK：Control group;T3：Test group 3.圖1 肉牛瘤胃菌群OTUs和Tags數(shù)量Figure 1 OTUs and tags numbers in rumen microflora of beef cattle

2.2.2 OTUs豐度及多樣性分析 根據(jù)OTUs聚類分析結(jié)果，分析不同樣品的聚類信息，依照其共有、特有的OTUs信息繪制韋恩圖(Venn graph，圖2)，對照組和試驗組3肉牛瘤胃共獲得1 473 OTUs，2組肉牛共有OTUs為802個，對照組和試驗組3肉牛瘤胃特有OTUs分別為359個和312個.

2.2.3 Alpha多樣性分析 Alpha多樣性反映瘤胃菌群的群落(within-community)豐富度和多樣性，其中Chao1 / ACE 指數(shù)主要闡明樣本的物種豐富度信息，Good’s Coverage反映樣本的低豐度OTU覆蓋情況，Observed species 表示能檢測到的OTU種類情況，Simpson / Shannon 主要綜合體現(xiàn)物種的豐富度和均勻度.對照組和試驗組3肉牛瘤胃菌群Alpha多樣性差異分析見表3，2組肉牛瘤胃菌群多樣性指數(shù)Chao1、ACE、Shannon、observed_species、Simpson和Good’s Coverage均無顯著性差異(P>0.05).

CK：對照組；T3：試驗組3.CK:Control group;T3:Test group 3.圖2 肉牛瘤胃菌群OTUs分布韋恩圖Figure 2 Venn graphs of OTUs for microflora in rumen fluid of beef cattle

2.2.4 Beta多樣性分析 對照組和試驗組3肉牛瘤胃液菌群的主坐標分析(PCoA)見圖3，PCo1 和PCo2 2個主成分貢獻值分別為28.43%和22.23%，同組肉牛瘤胃液菌群沒有明顯聚集，2組肉牛瘤胃液菌群距離沒有明顯差異.基于bray對群落結(jié)構(gòu)分析見圖4，2組肉牛瘤胃液菌群Beta多樣性無顯著差異(P>0.05).

表3 肉牛瘤胃菌群Alpha多樣性分析

CK：對照組；T3：試驗組3.CK：Control group;T3：Test group 3.圖3 基于bray curtis算法的PCoA分析Figure 3 PCoAanalysis based on Bray Curtis algorithm

2.2.5 菌群組成分析 對照組和試驗組3肉牛瘤胃菌群豐度排名前10的門和屬見表4.擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)是組成2組肉牛瘤胃液菌群的主要細菌門類，其相對豐度占瘤胃菌群比例82%以上.普雷沃氏菌屬(Prevotella_1、Prevotella_7)為對照組和試驗組3肉牛瘤胃菌群的優(yōu)勢菌屬，且試驗組3的普雷沃氏菌屬豐度較對照組高.

CK：對照組；T3：試驗組3.CK：Control group;T3：Test group 3.圖4 基于bray curtis算法的群落結(jié)構(gòu)分析Figure 4 Community structure analysis based on Bray Curtis algorithm

表4 肉牛瘤胃液菌群在門和屬水平的相對豐度

2.2.6 KEGG功能預(yù)測 利用Welch′st檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測兩組肉牛瘤胃液菌群間差異KEGG通路(圖5).結(jié)果表明有9個差異顯著的通路，包括不飽和脂肪酸的生物合成(biosynthesis of unsaturated fatty acids)、細胞色素P450(drug metabolism cytochrome P450)等.

CK：對照組；T3：試驗組3.A表示富集在KEGG的reads數(shù)目，B表示相應(yīng)的P值.CK：Control group;T3：Test group 3.A represents the number of reads enriched in KEGG.B is the corresponding P value.圖5 肉牛瘤胃菌群KEGG預(yù)測代謝途徑差異分析Figure 5 KEGG prediction for metabolic pathways of bacteria in rumen fluid of beef cattle

3 討論

3.1 粗飼料顆粒替代部分全株玉米青貯對肉牛瘤胃發(fā)酵的影響

NH3-N是瘤胃內(nèi)源氮、飼料氮和非蛋白氮分解最終產(chǎn)物，也是瘤胃微生物生長所需氮的主要來源，其為微生物提供18%～100%的氮源；NH3-N含量在一定程度上反映了飼糧蛋白質(zhì)含量、瘤胃內(nèi)降解特性、能量供應(yīng)和特定飼糧組成下蛋白質(zhì)降解與合成之間的平衡關(guān)系[23].飼料中粗蛋白水平及蛋白質(zhì)降解速度是影響瘤胃液NH3-N濃度的主要因素.本試驗表明，試驗組肉牛瘤胃液NH3-N濃度均顯著低于對照組，且隨粗飼料顆粒替代比例增加瘤胃液NH3-N有下降趨勢.本試驗制作粗飼料顆粒的原料粉碎粒度為8 mm，與青貯飼料(約2～3 cm)相比長度大幅度減小，推測粗飼料顆粒在瘤胃中稀釋率高，胃腸道形成的食糜流通速度快，停留時間短，瘤胃微生物對蛋白質(zhì)的消化率下降，使瘤胃液NH3-N濃度降低.賀鳴等[24]、鄔彩霞等[25]、曾銀等[26]、Einasron等[27]和Beauchemin等[28]均認為，瘤胃中NH3-N濃度隨粗飼料長度減小顯著下降，與本試驗結(jié)果一致.Wanapat等[29]報道瘤胃微生物生長的適宜NH3-N濃度范圍為5～28 mg/dL，本試驗中肉牛瘤胃液NH3-N濃度為5.15～10.23 mg/dL，均處于適宜范圍.

瘤胃VFA主要為乙酸、丙酸、丁酸等，是反芻動物主要的能量來源及合成乳脂肪和體脂肪的原料，VFA的含量及組成比例是衡量瘤胃消化代謝的重要指標之一，受動物、飼料及飼養(yǎng)條件等因素影響.本試驗發(fā)現(xiàn)，粗飼料顆粒替代不同比例全株玉米青貯對肉牛瘤胃總VFA濃度無顯著影響，但試驗組3乙酸比例、乙酸/丙酸比值低于其他組，而丙酸比例高于其他組.因反芻動物瘤胃消化的復(fù)雜性，粗飼料長度對瘤胃總VFA及乙酸、丙酸的影響效果，國內(nèi)外研究結(jié)果并不一致.馬冬梅等[30]、Beauchemin等[28]研究發(fā)現(xiàn)，減小粗飼料長度對奶牛瘤胃VFA總量沒有顯著影響，乙酸濃度則顯著下降.然而Krause等[31]報道，減小粗飼料長度能夠提高奶牛瘤胃VFA 含量，其中丙酸含量變化率高于乙酸，乙酸/丙酸比值降低；而Yang等[32]報道，增加奶牛粗飼料長度能提高瘤胃總VFA含量，但乙酸/丙酸比值沒有顯著變化.反芻動物飼糧中粗飼料長度降低，增大了微生物與飼料接觸表面積，進而增加了微生物對飼料的發(fā)酵，使總VFA產(chǎn)量增加；但飼料粉碎過細，可縮短其在瘤胃內(nèi)停留時間，進而減少微生物消化時間，導(dǎo)致總VFA產(chǎn)量下降.另外，試驗所測定的VFA僅代表采集時間點瘤胃液中的含量，而瘤胃壁吸收量和外流量也會影響到總VFA的產(chǎn)量.因此，瘤胃總VFA含量受粗飼料類型、飼料顆粒大小、外流速度及動物個體差異及此類因素間互作等多方面的影響[33].本試驗中，隨粗飼料顆粒替代青貯飼料比例由20%增加至80%，肉牛飼糧組成中粗飼料長度下降，但其瘤胃液總VFA濃度沒有顯著變化.以上試驗均證明飼料長度并不是唯一影響瘤胃液總VFA含量的因素.

3.2 粗飼料顆粒替代部分全株玉米青貯對肉牛瘤胃液微生物菌群的影響

反芻動物瘤胃微生物主要包括細菌、原蟲和真菌，在營養(yǎng)物質(zhì)消化代謝過程中發(fā)揮著重要作用，飼料中70%以上碳水化合物和蛋白質(zhì)的消化由瘤胃微生物完成[34]，瘤胃微生物定植于飼料，將其降解為低聚物，最終生成VFA、維生素及其他微生物生長所需輔助因子[35].因此，飼糧組成是影響瘤胃菌群結(jié)構(gòu)和功能的重要因素[23,36].瘤胃細菌種類約有7 000余種，是瘤胃中數(shù)量最豐富、種類最復(fù)雜的微生物[37]；許多研究表明，擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁桿菌門(Firmicutes)是瘤胃優(yōu)勢菌群，對瘤胃發(fā)酵起重要作用，且飼糧中纖維素和淀粉水平對此類菌群數(shù)量無明顯影響[38-40].擬桿菌門菌群，如普雷沃氏菌屬(Prevotella)主要降解瘤胃中非纖維性碳水化合物；而厚壁菌門中存在分解纖維的菌屬，如瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)等.張霞等[41]研究表明，不同育肥階段的西雜牛瘤胃擬桿菌門、厚壁菌門和軟壁菌門為優(yōu)勢菌群；Kim等[42]報道，肉牛瘤胃中絕大多數(shù)細菌屬厚壁菌門(56.1%)和擬桿菌門(30.54%)；Thoetkiattikul 等[43]報道，擬桿菌門在奶牛瘤胃中豐度最高.本試驗表明，擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)在兩組肉牛瘤胃中的相對豐度比例在82%以上，是兩組肉牛瘤胃菌群的主要細菌門類，與以上研究報道一致.

本研究也發(fā)現(xiàn)，普雷沃氏菌屬(Prevotella_1、Prevotella_7)為2組肉牛瘤胃菌群中的優(yōu)勢菌屬，且試驗組3的豐度較對照組高.普雷沃氏菌屬(Prevotella)是反芻動物瘤胃中的關(guān)鍵菌群，數(shù)量可達瘤胃菌群總量的60%～70%，雖然不降解纖維素，但卻是瘤胃中主要的蛋白降解菌之一，且對淀粉、半纖維素、木質(zhì)素和果膠降解至關(guān)重要[44-47].Grilli等[48]報道，飼喂高飼草的山羊瘤胃普雷沃氏菌屬豐度更高；Pitta等[49]研究表明，高粗蛋白的小麥秸飼喂肉牛，瘤胃普雷沃氏菌屬顯著增加.本試驗中，試驗組3肉牛用粗飼料顆粒替代80%全株玉米青貯，飼糧中半纖維素及木質(zhì)素水平升高，普雷沃氏菌屬豐度增加可能有利于此類物質(zhì)降解，也可以提高飼糧中蛋白質(zhì)、淀粉等有機物消化率.另外，普雷沃氏菌在瘤胃中發(fā)酵產(chǎn)物主要是乙酸、丙酸和琥珀酸，而琥珀酸通過微生物酶作用很快轉(zhuǎn)化為丙酸[50].本試驗中，試驗組3瘤胃VFA中丙酸比例增加，也可能與普雷沃氏菌相對豐度較高有關(guān).

Alpha多樣性和Beta多樣性均用于分析微生物種群內(nèi)的多樣性，其中Chao1 / ACE 指數(shù)可反映菌群豐度，并通過豐度反映微生物適應(yīng)特定環(huán)境及競爭營養(yǎng)物質(zhì)的能力[51]；Simpson/Shannon 指數(shù)則表示菌群的均勻度和多樣性.本試驗發(fā)現(xiàn)2組肉牛瘤胃菌群Alpha多樣性的各項指數(shù)和Beta多樣性均無顯著差異，說明粗飼料顆粒替代80%青貯飼料，對肉牛瘤胃菌群豐度和多樣性無顯著影響.李藝[52]報道，谷草替代不同比例玉米秸稈黃貯飼喂西門塔爾雜種牛，瘤胃菌群豐度和多樣性沒有顯著變化；趙娜等[53]研究表明，飼喂青貯玉米及青貯飼用油菜，不影響山羊瘤胃菌群種類和豐度；郭成等[54]報道，奶牛日糧添加低聚異麥芽糖不影響瘤胃微生物多樣性，均與本研究結(jié)果類似.而郭婷婷等[55]研究表明，添加甘露寡糖降低了奶牛瘤胃菌群的多樣性，與本研究結(jié)果并不一致.結(jié)合本研究結(jié)果也進一步表明，反芻動物瘤胃菌群多樣性可能與動物種類、發(fā)育階段、飼糧結(jié)構(gòu)及飼養(yǎng)環(huán)境等因素有關(guān).

4 結(jié)論

粗飼料顆粒替代部分玉米青貯飼喂肉牛，可影響肉牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)，但對瘤胃菌群結(jié)構(gòu)影響較小.對瘤胃總VFA濃度無顯著影響，但能降低NH3-N濃度、乙酸比例和乙酸/丙酸比值，增加丙酸比例；粗飼料顆粒替代80%全株玉米青貯，肉牛瘤胃液菌群豐度及多樣性無顯著變化，擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)為優(yōu)勢菌群門類，普雷沃氏菌屬(Prevotella)為優(yōu)勢菌屬，有增加不飽和脂肪酸的生物合成的趨勢.