高郵鴨卵巢中雙黃蛋性狀相關(guān)lncRNA表達(dá)差異分析

唐現(xiàn)文，張蕾，章敬旗，章瑋玥，張響英

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

長鏈非編碼RNA簡(jiǎn)稱為lncRNA(long non-coding RNA)，為長度超過200 bp且不編碼蛋白質(zhì)的RNA長鏈分子[1].隨著高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，對(duì)cDNA文庫的注釋不斷增加，越來越多的lncRNA被逐漸發(fā)現(xiàn)[2-4].研究表明，lncRNA在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多層面調(diào)控基因的表達(dá)，它們參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)過程[5]，lncRNA作為調(diào)控性非編碼RNA的重要成員，目前已成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn).

近年來，lncRNA在畜禽動(dòng)物中的研究越來越受到人們的重視.Arriaga等[6]對(duì)雞胚發(fā)育過程中的性腺進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)lncRNA-αGT在雞發(fā)育晚期上調(diào)表達(dá)，是雞胚發(fā)育成熟的重要參與者.Li等[7]通過新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)雞肝臟脂質(zhì)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)lncRNA和miRNA這類非編碼RNA在肝臟脂質(zhì)代謝生理過程中發(fā)揮著重要的作用.任晉東[8]綜合分析了青年期、初產(chǎn)期以及老齡期鴨卵巢組織lncRNA與編碼基因的差異表達(dá)情況，驗(yàn)證了lncRNA作為高產(chǎn)蛋鴨分子標(biāo)記物的潛在可能.以上研究表明，lncRNA參與家禽的發(fā)育及生理機(jī)能調(diào)控.

高郵鴨因擅產(chǎn)雙黃蛋而聞名海內(nèi)外，針對(duì)其雙黃蛋性狀的研究在DNA和mRNA層面相對(duì)比較完善，而對(duì)lncRNA介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控研究還比較匱乏.與高郵鴨性狀相關(guān)的lncRNA研究是探索其卵巢和卵泡發(fā)育機(jī)理的重要途徑，對(duì)于完善高郵鴨雙黃蛋性狀的調(diào)控機(jī)制具有重要意義.本研究利用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，分析雙黃蛋高、低產(chǎn)組高郵鴨卵巢組織中差異表達(dá)的lncRNA，為進(jìn)一步探索lncRNA在高郵鴨雙黃蛋性狀中的調(diào)控機(jī)制提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)所用的高郵鴨由江蘇省泰州市豐達(dá)水禽育種場(chǎng)提供，選擇同一來源(同批孵化、同批出雛、同一環(huán)境下個(gè)體籠養(yǎng)、予以全價(jià)日糧)的健康鴨群，籠養(yǎng)330日齡并記錄個(gè)體產(chǎn)蛋數(shù)據(jù).

1.2 樣品采集

根據(jù)個(gè)體產(chǎn)蛋記錄，篩選出雙黃蛋高產(chǎn)組(樣品編號(hào)G1，G2，G3)、低產(chǎn)組(樣品編號(hào)D4，D5，D6)個(gè)體各3只.按照國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理行為準(zhǔn)則進(jìn)行屠宰，并立即采取卵巢組織，將卵黃釋放后整體勻漿，放入無酶凍存管，經(jīng)液氮速凍后，于-80 ℃保存?zhèn)溆?

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 通過Trizol法進(jìn)行高郵鴨卵巢組織總RNA提取，Nanodrop檢測(cè)提取的RNA純度，Qubit 2.0檢測(cè)提取的RNA濃度，Aglient 2100檢測(cè)RNA的完整性.所有樣品RNA提取并檢測(cè)合格后，送至上海歐易生物技術(shù)有限公司，應(yīng)用Illumina HiSeq2500高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析[9].

1.3.2 lncRNA表達(dá)水平分析 對(duì)測(cè)序慮得的clean data，通過TopHat2軟件進(jìn)行序列比對(duì)，獲得高郵鴨卵巢組織樣本特異序列信息，并進(jìn)行基因組定位分析；基于每個(gè)樣本的基因組比對(duì)結(jié)果，應(yīng)用StringTie軟件[10]流神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，重新組裝并篩除已知編碼轉(zhuǎn)錄本或已知基因座的新轉(zhuǎn)錄本，用Cuffcompare軟件[11]分析轉(zhuǎn)錄本的位置類型，篩選出“i”、“u”、“x”、“o”字樣、長度大于200 bp、不具有編碼潛能的lncRNA轉(zhuǎn)錄本.用FEELnc軟件[12]分析lncRNA與已知蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本的位置關(guān)系，統(tǒng)計(jì)lncRNA類型.用Bowtie2[13]和eXpress[14]估算FPKM(fragments per kb per million fragments，F(xiàn)PKM)，獲得lncRNA在各樣本中的表達(dá)豐度.

1.3.3 差異表達(dá)lncRNA篩選 利用DESeq[15]軟件對(duì)各個(gè)樣本lncRNA的counts數(shù)目進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算差異倍數(shù)，并采用NB(負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)的方式)對(duì)reads數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，以|log2Fold change|≥2(P<0.05)為閾值進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選，結(jié)合GO(gene ontology，基因本體)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，京都基因與基因組百科全書)數(shù)據(jù)庫對(duì)篩選獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋及通路富集分析.

1.3.4 qRT-PCR檢測(cè) 隨機(jī)選取1.2.2中獲得的4個(gè)差異lncRNA，采用Oligo 7.5軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表1)，以反轉(zhuǎn)錄得到的開產(chǎn)前后高郵鴨卵巢組織樣本(樣本號(hào)1～6)的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證上述基因的表達(dá)規(guī)律與全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是否一致.

表1 qRT-PCR引物信息

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 lncRNA鑒別和表達(dá)水平分析

本試驗(yàn)共構(gòu)建雙黃蛋高、低產(chǎn)組高郵鴨6個(gè)卵巢組織轉(zhuǎn)錄組文庫，分別獲得了84 540 140～87 479 660個(gè)有效數(shù)據(jù)(clean data)[9].在此基礎(chǔ)上，對(duì)轉(zhuǎn)錄本重新組裝并篩選后，最終獲得新的lncRNA共計(jì)962條(表2)，lncRNA長度在201～10 125 bp之間.以100 bp為間隔區(qū)域，對(duì)上述獲得的新lncRNA進(jìn)行序列長度分布統(tǒng)計(jì)(圖1)，本試驗(yàn)獲得的lncRNA最多分布在200～500 bp以及≥2 000 bp的范圍內(nèi).

結(jié)合FEELnc軟件，將上述獲得的新lncRNA與已知蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行位置對(duì)比分析，對(duì)lncRNA所在方向(正鏈、反鏈)，類型(基因內(nèi)、基因間)和位置(上游、下游、內(nèi)含子、外顯子)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示新lncRNA最多分布于反鏈基因內(nèi)含子(126個(gè))以及正鏈基因外顯子(193個(gè))中，基因間下游區(qū)域分布最少(圖1).

通過轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平估算，對(duì)所有樣本lncRNA的FPKM作密度分布圖(圖3-A)，發(fā)現(xiàn)FPKM值在0～0.5之間的轉(zhuǎn)錄本最多，有7 796～9 643個(gè)；FPKM值≥10的轉(zhuǎn)錄本在992～2 278之間；FPKM在0.5～1之間轉(zhuǎn)錄本共計(jì)有6 199個(gè)；而FPKM值在1～10之間的轉(zhuǎn)錄本最少，僅占總數(shù)的 3.54 %.另外，還發(fā)現(xiàn)6個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)豐度模式基本相同(圖3-B).

2.2 差異表達(dá)lncRNA篩選與分析

以|log2Fold change|≥2(P<0.05)為閾值對(duì)lncRNA進(jìn)行顯著表達(dá)篩選，共獲得279條差異表達(dá)lncRNA，其中顯著性上調(diào)差異表達(dá)lncRNA 109個(gè)，顯著性下調(diào)差異表達(dá)lncRNA 170個(gè)(圖4).

表2 lncRNA序列信息統(tǒng)計(jì)表

圖1 lncRNA序列長度分布圖Figure 1 Length distribution of lncRNA

A：新lncRNA正反鏈分布圖； B：新lncRNA類型統(tǒng)計(jì)匯總圖.A：Novel lncRNA distribution between antisense and sense;B：Novel lncRNA classification summary chart.圖2 新lncRNA類型統(tǒng)計(jì)圖Figure 2 Novel lncRNA classification

A：FPKM表達(dá)量分布圖； B：豐度分布曲線圖.A：Transcript expression (FPKM) in each sample;B：Transcript expression density in each sample.圖3 FPKM表達(dá)量及豐度分布圖Figure 3 Transcript expression (FPKM) and density in each sample

A：差異表達(dá)lncRNA火山圖，灰色為非顯著性差異的lncRNA，紅色為顯著性上調(diào)lncRNA，綠色為顯著性下調(diào)lncRNA；B：差異表達(dá)lncRNA統(tǒng)計(jì)柱狀圖，紅色為顯著性上調(diào)lncRNA，藍(lán)色為顯著性下調(diào)lncRNA.A：Volcano plots of differently expressed lncRNA,grey colour represents non-differently expressed lncRNA,red colour represents up-regulated expressed lncRNA,green colour represents down-regulated lncRNA； B：Statistic of differently expressed lncRNA,red colour represents up-regulated expressed lncRNA,blue colour represents down-regulated lncRNA.圖4 差異表達(dá)lncRNA結(jié)果統(tǒng)計(jì)Figure 4 Statistic of differently expressed lncRNA

獲得差異表達(dá)lncRNA后，為進(jìn)一步了解每個(gè)差異lncRNA的功能，結(jié)合差異表達(dá)lncRNA的來源及臨近基因進(jìn)行GO富集分析，以對(duì)其功能進(jìn)行描述.利用超幾何分布計(jì)算，篩選出對(duì)應(yīng)差異lncRNA數(shù)目大于2的GO條目，再按照每個(gè)條目對(duì)應(yīng)的-lgP由大到小排列，根據(jù)差異表達(dá)lncRNA上調(diào)及下調(diào)分類，列舉出上調(diào)和下調(diào)各組前30項(xiàng)GO條目，如圖5所示.

為顯示差異表達(dá)lncRNA富集的GO節(jié)點(diǎn)及其層次關(guān)系，按照上述生物過程、細(xì)胞成分以及分子功能三大類，對(duì)富集到的GO條目進(jìn)行有向無環(huán)圖繪制，以顯示差異表達(dá)lncRNA之間的上下調(diào)控關(guān)系和所涉及的功能描述.圖6中分支代表包含關(guān)系，從上至下所定義的功能描述范圍越來越具體，從生物過程有向無環(huán)圖(6-A)可以看出，所富集到的lncRNA最終主要匯集于5個(gè)生物過程，分別是：細(xì)胞質(zhì)翻譯(GO：0002181)，神經(jīng)酰胺代謝過程(GO：0006672)，一氧化氮生物合成過程正向調(diào)控(GO：0045429)，心臟隔緣形成(GO：0060347)，以及內(nèi)皮細(xì)胞分化正向調(diào)控(GO：0045603)；細(xì)胞成分有向無環(huán)圖(6-B)最終富集到：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè)(GO：0098556)，胞漿小核糖體亞單位(GO：0022627)和剪接體snRNP組分(GO：0097525)3個(gè)過程；分子功能有向無環(huán)圖(6-C)最終歸為4個(gè)主要功能：mRNA鳥苷基轉(zhuǎn)移酶活性(GO：0004484)，多核苷酸5′-磷酸酶活性(GO：0004651)，三磷酸酶活性(GO：0050355)以及磷脂酰肌醇-3-磷酸結(jié)合(GO：0032266).

A：調(diào)表達(dá)lncRNA GO注釋分析TOP30；B：下調(diào)表達(dá)lncRNA GO注釋分析TOP30.A：Top 30 GO term of up-regulated lncRNA；B：Top 30 GO term of down-regulated lncRNA.上調(diào)：神經(jīng)管閉合，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架形成，蛋白質(zhì)穩(wěn)定，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞遷移的正調(diào)控，細(xì)胞周期，細(xì)胞遷移，多細(xì)胞生物發(fā)育，凋亡過程，細(xì)胞分化，肌動(dòng)蛋白絲，線粒體膜，褶邊，核仁周圍，基底膜，GABA能突觸，細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞骨架，膜，細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列特異性DNA結(jié)合，絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，信號(hào)受體活性，肝素結(jié)合，鋅離子結(jié)合，肌動(dòng)蛋白結(jié)合，ATP結(jié)合，蛋白激酶結(jié)合，金屬離子結(jié)合；下調(diào)：初生胚層的形成，管子成形，細(xì)胞質(zhì)翻譯，成肌細(xì)胞增殖，內(nèi)皮細(xì)胞分化的正調(diào)控，神經(jīng)酰胺代謝過程，翻譯，內(nèi)皮細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控，細(xì)胞極性的建立，腎水穩(wěn)態(tài)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè)，多核糖體，胞漿小核糖體亞單位，回收內(nèi)膜，核斑點(diǎn)，胞質(zhì)囊泡膜，核質(zhì)，核基質(zhì)，細(xì)胞膜結(jié)合細(xì)胞器，質(zhì)膜，磷脂酰肌醇-3-磷酸結(jié)合，醛固醇：NADP+1-氧化還原酶活性，乙醇脫氫酶(NADP+)活性，核糖體的結(jié)構(gòu)組成，激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，E-box結(jié)合，氧化還原酶活性，磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸結(jié)合，蛋白質(zhì)二聚活性，β連環(huán)素結(jié)合.Up-regulated：neural tube closure,actin cytoskeleton organization,protein stabilization,signal transduction,positive regulation of cell migration,cell cycle,cell migration,multicellular organism development,apoptotic process,cell differentiation,actin filament,mitochondrial membrane,ruffle,perikaryon,basement membrane,GABA-ergic synapse,extracellular matrix,cytoskeleton,membrane,intracellular,transcription regulatory region sequence-specific DNA binding,protein serine/threonine kinase activity,transcription factor binding,signaling receptor activity,heparin binding,zinc ion binding,actin binding,ATP binding,protein kinase binding,metal ion bindingx;Down-regulated：formation of primary germ layer,tube formation,cytoplasmic translation,myoblast proliferation,positive regulation of endothelial cell differentiation,ceramide metabolic process,translation,negative regulation of endothelial cell proliferation,establishment of cell polarity,renal water homeostasis,cytoplasmic side of rough endoplasmic reticulum membrane,polysomal ribosome,cytosolic small ribosomal subunit,recycling endosome membrane,nuclear speck,cytoplasmic vesicle membrane,nucleoplasm,nuclear matrix,intracellular membrane-bounded organelle,plasma membrane,phosphatidylinositol-3-phosphate binding,alditol:NADP+1-oxidoreductase activity,alcohol dehydrogenase (NADP+) activity,structural constituent of ribosome,activating transcription factor binding,E-box binding,oxidoreductase activity,phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate binding,protein dimerization activity,beta-catenin binding.圖5 差異表達(dá)lncRNA GO注釋Figure 5 GO annotation of diferentially expressed lncRNA

圖6 GO條目有向無環(huán)圖Figure 6 Directed acyclic graph of GO annotation

將上述生物過程、細(xì)胞成分以及分子功能三大類最終匯集到的12個(gè)GO條目進(jìn)行匯總，獲得25個(gè)差異表達(dá)lncRNA轉(zhuǎn)錄本(圖7-A)，其中包含6個(gè)雙黃蛋低產(chǎn)組高郵鴨卵巢特異性lncRNA，1個(gè)雙黃蛋高產(chǎn)組高郵鴨卵巢特異性lncRNA，兩組共表達(dá)差異lncRNA 18個(gè).基于lncRNA作用模式，對(duì)上述25個(gè)差異表達(dá)lncRNA進(jìn)行染色體位置和靶基因預(yù)測(cè)，合并歸屬于同一基因位置的lncRNA，共獲得18條特異lncRNA及其對(duì)應(yīng)的靶基因(表3)，并且其中有兩對(duì)差異表達(dá)lncRNA和靶基因之間存在著潛在調(diào)控關(guān)系(圖7-B)：XLOC_000924和LOC106018336分別位于CREK基因正義鏈的上游區(qū)域和反義鏈的下游區(qū)域，LOC106018964和LOC113843289同時(shí)位于LOC101797459正義鏈的下游區(qū)域.以上這些潛在調(diào)控關(guān)系為研究lncRNA對(duì)高郵鴨雙黃蛋性能的綜合調(diào)控作用提供了新的素材.

A：GO富集lncRNA韋恩分析；B：lncRNA和基因之間存在的潛在調(diào)控關(guān)系.A：Venn analysis table of lncRNA by GO enrichment；B：Potential regulatory relationships between lncRNA and genes圖7 GO富集lncRNA聚類分析Figure 7 Cluster analysis by GO enrichment

表3 GO富集lncRNA信息統(tǒng)計(jì)表

為進(jìn)一步探究lncRNA對(duì)靶基因的潛在調(diào)控作用，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法對(duì)本試驗(yàn)中雙黃蛋高、低產(chǎn)組卵巢樣本中的差異表達(dá)基因進(jìn)行檢測(cè)，篩選出上述lncRNA的靶基因，并檢測(cè)其是否在兩組兩本中呈現(xiàn)差異性表達(dá).從表4可以看出，本試驗(yàn)通過GO富集分析篩選出的18條特異lncRNA對(duì)應(yīng)的靶基因均呈現(xiàn)差異性表達(dá)，以P≤0.05為條件進(jìn)行二次篩選，共獲得5個(gè)差異顯著表達(dá)基因：ADAMTS1，ADGRG6，CERK，HEY2和LOC101797459，對(duì)應(yīng)lncRNA對(duì)上述差異基因的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步驗(yàn)證研究.

表4 lncRNA靶基因差異性表達(dá)

2.3 差異表達(dá)lncRNA熒光定量驗(yàn)證

為檢驗(yàn)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)篩選出的差異表達(dá)lncRNA結(jié)果是否準(zhǔn)確，篩選上述5個(gè)差異表達(dá)靶基因?qū)?yīng)的lncRNA：XLOC_000440，LOC106017612，LOC106018336，LOC110352 238和LOC1060189 64，并以β-actin為內(nèi)參基因來進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證.qRT-PCR結(jié)果顯示(圖8)：上述5個(gè)lncRNA的表達(dá)規(guī)律與全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的表達(dá)規(guī)律基本一致.所以本試驗(yàn)全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的lncRNA結(jié)果可信，可用于后續(xù)的功能驗(yàn)證分析.

圖8 差異表達(dá)lncRNA qRT-PCR驗(yàn)證Figure 8 qRT-PCR results of diferentially expressed lncRNA

3 討論

家禽的產(chǎn)蛋性能主要依賴于卵巢上卵泡的發(fā)育，而卵泡的發(fā)育是禽類機(jī)體高度協(xié)調(diào)的復(fù)雜生理過程.當(dāng)家禽性成熟時(shí)，卵巢上的原始卵泡開始生長，逐漸向等級(jí)前卵泡緩慢生長，最后優(yōu)勢(shì)卵泡破裂，卵子排出，進(jìn)入輸卵管并最終形成禽蛋[16].雙黃蛋是由于家禽卵巢上的兩個(gè)卵泡同時(shí)發(fā)育成熟并排卵，由輸卵管接納后形成，一般家禽品種的雙黃率極低.雙黃蛋雖在營養(yǎng)價(jià)值上高于單黃蛋，但在育種過程中被認(rèn)為是畸形蛋的一種，不具備孵化能力，因而研究相對(duì)滯后.Salamon等[17]研究表明，當(dāng)雙黃的大小和位置恰當(dāng)時(shí)可以孵化出健康的家禽后代，打破了雙黃蛋無法孵化的傳統(tǒng)觀點(diǎn)，進(jìn)一步說明了雙黃蛋性具能穩(wěn)定遺傳的可能.對(duì)于雙黃蛋的產(chǎn)蛋機(jī)理，目前研究多歸于生理、遺傳以及病理原因，系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)理尚未見報(bào)道.

GnRHR(gonadorelin receptor，促性腺激素釋放激素受體)參與調(diào)控FSH(follicle-stimulating hormone，卵泡刺激素)的合成與釋放，從而調(diào)控卵巢的繁殖性能.有研究結(jié)果表明GnRHR基因?qū)Π讈砗诫p黃蛋產(chǎn)蛋性能有一定的加性效應(yīng)，但其最高雙黃蛋率在開產(chǎn)初期也僅為1.06%[18].Vieaud等[19]利用引自法國的白來航雙黃蛋品系WLDJ(white Leghon double-yolked Jade)，進(jìn)行了雙黃蛋產(chǎn)蛋率與BMP15基因(bone morphogenetic protein 15，骨形態(tài)發(fā)生蛋白15)的相關(guān)性研究，未發(fā)現(xiàn)兩者之間有任何關(guān)聯(lián).以上研究均從已知的單個(gè)或多個(gè)基因多態(tài)性入手，通過基因與雙黃蛋性狀的遺傳效應(yīng)進(jìn)行分析，尚未取得有效進(jìn)展.

高郵鴨屬于蛋肉兼用型麻鴨品種，是我國的三大名鴨之一，原產(chǎn)于江蘇高郵地區(qū)，在我國江淮地區(qū)的飼養(yǎng)歷史逾百年，因善產(chǎn)雙黃蛋而聞名海內(nèi)外，是研究雙黃蛋產(chǎn)蛋機(jī)理的優(yōu)秀品種素材[20].本研究結(jié)合個(gè)體籠養(yǎng)方法，篩選出高郵鴨雙黃蛋高、低產(chǎn)組，并對(duì)其卵巢進(jìn)行RNA-Seq全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，以此篩選與高郵鴨雙黃蛋性狀相關(guān)的lncRNA.結(jié)合lncRNA注釋和差異基因篩選，初步獲得了279條差異表達(dá)lncRNA，這些lncRNA廣泛參與了生物過程、細(xì)胞成分以及分子功能這三類調(diào)控功能，涉及范圍廣泛.為了進(jìn)一步縮小與雙黃蛋性狀相關(guān)的候選lncRNA范圍，結(jié)合生物學(xué)功能分析和向無環(huán)圖繪制，最終獲得了18條候選lncRNA，它們參與細(xì)胞質(zhì)翻譯、內(nèi)皮細(xì)胞分化正向調(diào)控和磷脂酰肌醇-3-磷酸結(jié)合等多個(gè)生物過程.其中，磷脂酰肌醇-3-磷酸結(jié)合功能中主要涉及PI3K基因(phosphoinositide-3-kinase，磷脂酰肌醇 3激酶)，PI3K作用于多種細(xì)胞外因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細(xì)胞的生長、增殖、分化和凋亡等多種生命活動(dòng)中起著重要作用[21]，顆粒細(xì)胞通過PI3K/AKT/mTOR的途徑介導(dǎo)自噬，進(jìn)一步的調(diào)整控制卵泡發(fā)育和卵泡閉鎖[22]，因此，磷脂酰肌醇-3-磷酸結(jié)合生物過程中的lncRNA可作為高郵鴨雙黃蛋性狀的候選lncRNA進(jìn)行深入驗(yàn)證和研究.

本研究還通過靶基因預(yù)測(cè)，對(duì)上述18條候選lncRNA進(jìn)行分析，其中有兩對(duì)差異表達(dá)lncRNA和靶基因之間存在著潛在調(diào)控關(guān)系：XLOC_000924和LOC106018336分別位于CREK基因正義鏈的上游區(qū)域和反義鏈的下游區(qū)域，LOC106018964和LOC113843289同時(shí)位于LOC101797459正義鏈的下游區(qū)域.另外，我們還關(guān)注到TCONS_00001086的靶基因ADAMTS1，其是I型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶[23](A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)家族成員之一.有研究表明，ADAMTS1基因與卵巢功能關(guān)系密切：在卵泡的發(fā)育階段，ADAMTS1基因參與卵巢顆粒細(xì)胞功能調(diào)控，并可進(jìn)一步促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟[24]；在卵泡的排卵階段，ADAMTS1基因通過影響卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展，從而調(diào)控排卵的順利進(jìn)行.本研究表明lncRNA可能參與了高郵鴨雙黃蛋性狀的調(diào)控，為研究高郵鴨雙黃蛋性能的綜合調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ).

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過高郵鴨雙黃蛋高、低產(chǎn)組卵巢組織全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，初步篩選出了18個(gè)差異表達(dá)lncRNA和對(duì)應(yīng)的靶基因，可能參與高郵鴨雙黃蛋性狀的調(diào)控.試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步了解高郵鴨雙黃蛋性能的綜合調(diào)控機(jī)制提供了新的參考依據(jù).