兩色金雞菊提取物對家兔離體十二指腸收縮的影響及其機制

沙愛龍

(重慶三峽學院生物與食品工程學院，重慶市渝東北特色生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，重慶三峽學院教師教育學院，重慶 404120)

兩色金雞菊(CoreopsistinctoriaNutt.)，又名高寒香菊、雪菊等，屬菊科金雞菊屬植物，在我國主要分布于新疆和田、喀什等地區(qū)[1].新疆各中醫(yī)院和維吾爾族民間已將其作為藥材使用，具有清熱解毒、抗炎消腫、和胃健脾等功效，有廣闊的應(yīng)用前景[1].已有研究表明，兩色金雞菊提取物具有改善學習記憶、舒張血管、保護心肌、抗氧化、降血壓、降血脂等藥理作用[2-7]，本課題組前期研究表明兩色金雞菊提取物還具有抗疲勞和耐缺氧[1]、抗衰老[8]和延緩動物的腦及臟器萎縮與退化的作用[9].已有研究報道常熟、恰特草等植物提取物可抑制小腸收縮[10-11]，通過本課題組預試驗發(fā)現(xiàn)兩色金雞菊提取物也能抑制小腸收縮.目前兩色金雞菊提取物對小腸收縮的影響尚未見報道，本試驗通過研究兩色金雞菊提取物對家兔離體十二指腸收縮的影響及機制，以期為新藥的研發(fā)提供新思路，也為治療胃腸運動功能紊亂和兩色金雞菊臨床新用途提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗動物

共56只健康成年家兔(方法“1.5”中用量8只、“1.6”16只、“1.7”32只)，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，雌雄不拘，由新疆醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心提供.

1.2 藥品與儀器

兩色金雞菊，采自新疆維吾爾自治區(qū)和田地區(qū)皮山縣克里陽鄉(xiāng)喀熱曼村，經(jīng)課題組鑒定.蛋白酶抑制劑、Bay K8644購自Sigma公司，乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(Acetylcholine transferase，ChAT)測定試劑盒、乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，A-CHE)測試盒、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)ELISA試劑盒購于美國ProSci公司，鹽酸維拉帕米購自國藥集團化學試劑有限公司，樂氏液(KCl 0.42 g，NaCl 9 g，NaHCO30.2 g，CaCl20.24 g，葡萄糖1.0 g，蒸餾水1 000 mL；所用試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司).

MedLab-U/4C501型生物信號采集處理系統(tǒng)，南京美易科技有限公司；JZ101型張力換能器，北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司；HW-400E恒溫平滑肌槽，成都泰盟科技有限公司；紫外可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司；723型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；PowerWave XS全波長酶標儀，購于美國Bio-Tek寶特；低速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；精密電子天平，上海精科天平；電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司.

1.3 兩色金雞菊提取物的制備

按照課題組先前的研究方法制備兩色金雞菊提取物[1,8]：準確稱取磨碎后的兩色金雞菊粉末(過40目篩)10 g，加入10倍質(zhì)量的蒸餾水，常溫浸泡24 h(過夜)，提取3次，過濾，洗滌濾渣，合并濾液于同一瓶中，將濾液濃縮后，以蒸餾水定容至100 mL，即得100 mg/mL高質(zhì)量濃度兩色金雞菊提取物，后稀釋兩次，各稀釋一倍，得50 mg/mL中質(zhì)量濃度和25 mg/mL低質(zhì)量濃度的兩色金雞菊提取物.

1.4 家兔離體十二指腸平滑肌標本的制備

通過耳緣靜脈空氣栓塞法處死家兔，迅速剖開腹腔，將十二指腸殘留內(nèi)容物攆至空腸，沿邊緣分離腸系膜后取1～2 cm長的十二指腸腸段.將腸段置于樂氏液中反復洗凈，后用絲線結(jié)扎腸段兩端，將腸段下端固定于恒溫平滑肌槽試驗管底端L形鉤上，上端用絲線連于張力換能器彈性梁上，通過恒溫平滑肌槽內(nèi)置氣泵每秒鐘向試驗管底端通入1～2個氣泡.通過MedLab生物信號采集處理系統(tǒng)采集、記錄腸段收縮曲線，穩(wěn)定10 min后，開始試驗，記錄指標包括收縮幅度和頻率.

1.5 不同質(zhì)量濃度兩色金雞菊提取物對家兔離體十二指腸收縮幅度和頻率的影響

待腸段收縮曲線穩(wěn)定后，向試驗管內(nèi)加入低質(zhì)量濃度的兩色金雞菊提取物，記錄、觀察后用37 ℃樂氏液沖洗3次，待收縮曲線恢復后再依次加入中、高質(zhì)量濃度兩色金雞菊提取物，分別記錄、觀察15 min，以加藥前的收縮曲線作為對照，記錄、分析不同質(zhì)量濃度兩色金雞菊提取物對家兔離體十二指腸收縮幅度和頻率的影響，并計算抑制率.

1.6 兩色金雞菊提取物對Bay K8644誘導的家兔離體十二指腸收縮頻率和幅度的影響

待腸段收縮曲線穩(wěn)定后，向試驗管內(nèi)加入Bay K8644(0.5 μmol/L)，作用5 min后加入高質(zhì)量濃度兩色金雞菊提取物(100 mg/mL)，此期間觀察記錄家兔離體十二指腸收縮頻率和幅度的變化.另設(shè)一組用鹽酸維拉帕米(0.1 μmol/L)作為陽性對照.

1.7 兩色金雞菊提取物對家兔離體十二指腸ChAT、A-CHE和TH活性的影響

隨機將32只家兔平均分為4組，即樂氏液組和低、中、高質(zhì)量濃度兩色金雞菊提取物組.制備各組家兔離體十二指腸平滑肌標本，分別取樂氏液和低、中、高質(zhì)量濃度兩色金雞菊提取物浸浴各組離體十二指腸腸段，15 min后，將腸段剪碎.其中一部分十二指腸組織置于9倍的預冷生理鹽水中，冰水浴勻漿10 min制成10%組織勻漿，3 000 r/min離心10 min后取上清液，按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書分別測定各組ChAT、A-CHE活性和蛋白質(zhì)含量.各組另一部分十二指腸組織置于9倍的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，加入蛋白酶抑制劑后用冰水浴勻漿10 min制成10%組織勻漿，經(jīng)反復凍融3次后，5 000 r/min離心5 min后取上清液，按照ELISA試劑盒說明書分別測定各組家兔離體十二指腸TH活性.

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 兩色金雞菊提取物對家兔離體十二指腸收縮幅度的影響

如表1和圖1所示，與給藥前相比，高、中、低質(zhì)量濃度組的兩色金雞菊提取物對家兔離體十二指腸收縮幅度都具有抑制作用，其中低、高質(zhì)量濃度組差異均不顯著(P>0.05)，但中質(zhì)量濃度組差異極顯著(P<0.01)，說明50 mg/mL中質(zhì)量濃度是抑制家兔離體十二指腸收縮幅度的最適質(zhì)量濃度.

表1 兩色金雞菊提取物對家兔離體十二指腸收縮幅度的影響

圖1 兩色金雞菊提取物(CTE)對家兔離體十二指腸收縮的影響Figure 1 Effects of CTE on the contraction of the isolated duodenum in rabbits

2.2 兩色金雞菊提取物對家兔離體十二指腸收縮頻率的影響

由表2和圖1可知，與給藥前相比，兩色金雞菊提取物高、中、低質(zhì)量濃度組對家兔離體十二指腸收縮頻率都具有抑制作用，抑制率隨質(zhì)量濃度升高而逐漸增強，呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng).其中高質(zhì)量濃度組差異顯著(P<0.05)，但低、中質(zhì)量濃度組差異均不顯著(P>0.05).

2.3 兩色金雞菊提取物對Bay K8644誘導的家兔離體十二指腸收縮頻率和幅度的影響

由表3和圖2可知，與給藥前相比，單獨應(yīng)用Bay K8644極顯著地增加了家兔離體十二指腸收縮頻率和幅度(P<0.01).加入高質(zhì)量濃度兩色金雞菊提取物(100 mg/mL)后，收縮頻率和幅度均顯著降低(P<0.05)，作用效果與鹽酸維拉帕米陽性對照相比要差一些，鹽酸維拉帕米與Bay K8644相比差異極顯著(P<0.01).

表2 兩色金雞菊提取物對家兔離體十二指腸收縮頻率的影響

表3 兩色金雞菊提取物對Bay K8644誘導的家兔離體十二指腸收縮頻率和幅度的影響

2.4 兩色金雞菊提取物對家兔離體十二指腸ChAT、A-CHE和TH活性的影響

如表4所示，與正常對照組相比，經(jīng)不同質(zhì)量濃度兩色金雞菊提取物處理后家兔ChAT活性均降低，其中中、高質(zhì)量濃度組差異顯著(P<0.05)，但低質(zhì)量濃度組差異不顯著(P>0.05).經(jīng)不同質(zhì)量濃度兩色金雞菊提取物處理后家兔離體十二指腸A-CHE和TH活性均高于正常對照組，且均呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)趨勢，其中,中、高質(zhì)量濃度組差異都顯著(P<0.05)，但低質(zhì)量濃度組差異都不顯著(P>0.05).

表4 兩色金雞菊提取物對家兔離體十二指腸ChAT、A-CHE和TH活性的影響

圖2 兩色金雞菊提取物(CTE)對Bay K8644誘導的家兔離體十二指腸收縮的影響Figure 2 Effects of CTE on the contraction of the isolated duodenum in rabbits by Bay k8644

3 討論

本研究選擇十二指腸的原因包括：首先，研究表明，不同小腸段對不同化學藥物的作用存在差異.一般來說，十二指腸的作用最強，空腸次之，回腸最弱.其原因主要與小腸不同節(jié)段的神經(jīng)密度分布不同有關(guān)，小腸上部多于下部.因此，本研究選取十二指腸，更有利于研究腸肌間神經(jīng)叢抑制家兔離體十二指腸收縮的機制.而且，十二指腸是小腸的一部分，收縮頻率最快，所以很容易記錄收縮曲線.其次，十二指腸內(nèi)容物中的胰液已用預冷任氏液反復沖洗，可以排除消化液的影響.第三，十二指腸的結(jié)構(gòu)和功能與空腸和回腸相似，如果兩色金雞菊提取物能影響十二指腸的運動，也可以影響小腸其他部分的運動.

十二指腸的活動受體液和神經(jīng)因素的影響.體液因素包括十二指腸平滑肌膜上存在的多種受體，當外源性藥物、神經(jīng)遞質(zhì)與膜上受體結(jié)合時，會引起肌細胞信號轉(zhuǎn)導通路改變，從而調(diào)節(jié)其運動.神經(jīng)因素包括外來神經(jīng)(交感和副交感)和腸神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，家兔十二指腸離體后雖失去外來神經(jīng)的支配，但腸神經(jīng)系統(tǒng)仍存在[12].腸神經(jīng)系統(tǒng)包括肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)，十二指腸平滑肌運動主要受肌間神經(jīng)叢調(diào)節(jié)和支配[13]，構(gòu)成肌間神經(jīng)叢的神經(jīng)元通過釋放不同的神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)十二指腸運動，這些神經(jīng)遞質(zhì)可分為兩類，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)如乙酰膽堿(Acetylcholine，Ach)、促胃液素、5-羥色胺、P物質(zhì)等可促進十二指腸運動[14]，抑制性神經(jīng)遞質(zhì)如去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)、促胰液素、腎上腺素、生長抑素等則起抑制作用[15].

Ach是十二指腸運動的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，與肌膜上的G蛋白耦聯(lián)M受體結(jié)合后激活腺苷酸環(huán)化酶(Adenylate cyclase，AC)，使細胞內(nèi)的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)濃度升高，激活蛋白激酶A(PKA)[16]，進而激活L型鈣通道(ICa-L)使細胞外Ca2+內(nèi)流增多[17]，從而導致十二指腸平滑肌收縮增強[18].ChAT能催化體內(nèi)乙酰輔酶A和膽堿合成Ach[14]，A-CHE則能水解Ach.Bay K8644是ICa-L的激活劑，可促進細胞外大量Ca2+進入細胞內(nèi)，使十二指腸平滑肌收縮增強，當加入兩色金雞菊提取物后，其收縮效應(yīng)被明顯抑制(P<0.05)，由此推斷兩色金雞菊提取物可阻斷ICa-L，抑制Bay K8644引起的外鈣內(nèi)流，進而抑制離體十二指腸平滑肌的收縮.NE是十二指腸運動的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，也是腎上腺素能β受體激動藥，可通過激活G蛋白耦聯(lián)β受體介導的AC- cAMP- PKA信號轉(zhuǎn)導通路，從而松弛十二指腸平滑肌[19].TH是NE合成的限速酶，可作為NE能神經(jīng)元活性的標志，TH表達升高直接引起NE合成增多[20].由本試驗結(jié)果可知，兩色金雞菊提取物高、中、低質(zhì)量濃度組均能使家兔ChAT活性降低、A-CHE和TH活性升高，表明兩色金雞菊提取物可通過調(diào)節(jié)腸肌間神經(jīng)叢運動神經(jīng)元的活動而抑制十二指腸運動：①可通過抑制膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)ACh的合成且促進已釋放ACh的分解，從而可能進一步抑制G蛋白耦聯(lián)M受體介導的AC- cAMP- PKA信號轉(zhuǎn)導通路，最終導致離體十二指腸平滑肌收縮減弱；②可通過抑制肌膜ICa-L從而抑制外鈣內(nèi)流，進而可能抑制Ca2+-鈣調(diào)蛋白(CaM)信號通路；③可通過升高TH活性引起NE增多，再可能進一步激活G蛋白耦聯(lián)β受體介導的AC- cAMP- PKA信號轉(zhuǎn)導通路，從而松弛離體十二指腸平滑肌.

4 結(jié)論

兩色金雞菊提取物有望在胃腸運動功能亢進等疾病的新藥研發(fā)中發(fā)揮作用，本研究也為拓展兩色金雞菊臨床新用途提供了基礎(chǔ)理論依據(jù).兩色金雞菊提取物有望應(yīng)用于小腸平滑肌的舒張，能抑制腸道痙攣、緩解腸胃疼痛、抗損傷腸管的劇烈蠕動，對治療胃腸動力疾病如腹瀉、腹痛、胃腸痙攣等有效.