紋黨和紅芪加工廢棄物中活性多糖對衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和抗疲勞作用的影響

葉文斌，楊文，陳耀年，宮崢嶸，何玉鵬

(隴南師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，甘肅 成縣 742500)

近年來國家將中醫(yī)藥發(fā)展作為經(jīng)濟社會發(fā)展的重要戰(zhàn)略舉措，引導(dǎo)大量資金向中藥農(nóng)業(yè)輸入，鼓勵中藥企業(yè)將藥材加工等工業(yè)前處理環(huán)節(jié)向中藥材產(chǎn)區(qū)轉(zhuǎn)移，延伸中藥材產(chǎn)業(yè)鏈.甘肅省依據(jù)國家的指導(dǎo)方針，大力實施隴藥振興計劃，明確支持建立中藥材生產(chǎn)基地，甘肅道地中藥材紋黨[Codonopisispilosula(Franch.)Nannf.]和紅芪(HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.)是主要支持和推廣種植的中藥材，而隴南市文縣和武都區(qū)是這兩種藥材的道地產(chǎn)區(qū)，也是中國國家地理標志產(chǎn)品[1-3].近幾年隴南市紋黨和紅芪年產(chǎn)量超過600萬t，已成為中國最大的紋黨和紅芪的生產(chǎn)、加工和銷售基地[1].隨著紋黨和紅芪2種中藥材種植和加工規(guī)模的擴大，在采收和加工過程中會產(chǎn)生頭、須、根、渣、皮等數(shù)量巨大的加工廢棄物，這些廢棄物的資源化再利用沒有得到較好的解決，而是大量堆放，最后作為肥料流入大田，這樣不但會對農(nóng)作物產(chǎn)生不良影響，污染農(nóng)田和環(huán)境，而且這些廢棄物中含有的生物活性成分也嚴重浪費了.為了減少資源的浪費，提高廢棄物資源化再利用，本文以紋黨和紅芪加工廢棄物提取的多糖為研究材料，通過頸部皮下注射D-半乳糖構(gòu)建的小鼠亞急性衰老模型，用2種多糖對衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和抗疲勞作用進行研究，對衰老模型動物進行評價，評估兩種多糖的抗衰老和抗疲勞功效，以期為紋黨和紅芪加工廢棄物的綜合開發(fā)和利用提供技術(shù)參考.

1 材料與方法

1.1 試驗動物

SPF KM小鼠，雄性，體質(zhì)量22～28 g，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心，許可證號：SCXK(甘)2015-0001.小鼠飼養(yǎng)于鼠籠內(nèi)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為 22～25 ℃，濕度為35%～50%.

1.2 主要材料與儀器

紋黨與紅芪加工廢棄物多糖由隴南師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院固體廢棄物實驗室提供，紋黨多糖和紅芪多糖占廢棄物總成分質(zhì)量分數(shù)分別為16.52%和13.96%，純度分別為99.65%和99.38%[1].D-半乳糖購自上海禾豐制藥有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海千載科技有限公司；TGL-16G高速臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；UV759紫外-可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；全自動生化分析儀AU5800，貝克曼庫爾特有限公司.

1.3 試驗方法

1.3.1 亞急性衰老小鼠模型的建立 用0.9%生理鹽水配制5%的D-半乳糖(D-galactose)溶液，備用.取80只適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d的小鼠，隨機取10只小鼠飼喂基礎(chǔ)鼠飼料作為CK(0)組，將其余70只小鼠按照體質(zhì)量0.5 mL/10g的劑量標準頸部皮下注射5% D-半乳糖，42 d后，測定各組小鼠體質(zhì)量和血清中SOD、CAT活性及MDA含量.如與對照組相比有顯著性差異，則視為亞急性衰老小鼠造模成功[14-15].

1.3.2 小鼠衰老試驗中紋黨多糖和紅芪多糖濃度的篩選 取建模成功的小鼠60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將60只隨機分為兩大組，建立紋黨多糖和紅芪多糖試驗組，每一大組分為6小組，每一小組5只.按50、100、200、400、600 mg/kg標準每天分別灌胃紋黨多糖(CPP)和紅芪多糖(CHP)一次；另取建模成功的小鼠10只，5只喂食與多糖等量的生理鹽水為對照組(CK0)，剩余5只備用.篩選最佳紋黨多糖和紅芪多糖的使用劑量便于后續(xù)試驗.在試驗期間，保證小鼠自由飲食和活動，灌胃紋黨多糖和紅芪多糖14 d后，測定各組小鼠血清中SOD、CAT活性及MDA含量，小鼠采血前禁食12 h后，斷尾采血1.0 mL在4 000 r/min離心15 min分離出血清，測定指標的所有操作均按試劑盒說明書進行.

1.3.3 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的測定 迷宮長寬各為150 cm，高75 cm，迷宮路徑寬35 cm，迷宮均有4個分區(qū)，只有一個入口和一個出口，迷宮上方有一攝像機對試驗小鼠活動進行全程跟蹤攝錄.將建模成功的小鼠用篩選出來的紋黨多糖和紅芪多糖以400 mg/kg劑量標準每天灌胃一次，按170 mg/kg劑量每天灌胃一次VE為陽性對照組(VE組)，喂食與VE等量的生理鹽水為對照組(CK0)；在試驗期間，保證小鼠自由飲食和活動，連續(xù)灌胃紋黨多糖和紅芪多糖第 4周后進行學(xué)習(xí)記憶能力測試，試驗前禁食不禁水24 h，在出口放置鼠糧，放入小鼠后迅速關(guān)閉入口，用小鼠找到鼠糧所需的時間表示小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力.每日將小鼠放入入口，試驗過程鼠糧位置保持不變，詳細記錄小鼠從入口到達鼠糧放置的出口所需時間作為學(xué)習(xí)和記憶成績，若在設(shè)定時間內(nèi)小鼠未找到出口，則停止跟蹤計時，休息10 min后再次開始訓(xùn)練.試驗在隔音安靜的房間內(nèi)進行[14-15].

1.3.4 小鼠游泳時間和爬桿時間的測定 小鼠游泳試驗設(shè)置的水溫為28 ℃，所有小鼠游泳箱內(nèi)的水深控制在 35 cm左右，迫使其不停游泳.記錄小鼠從入水至全部身體沉入水中的時間，作為小鼠游泳的時間.在整個試驗過程中保持安靜，以免小鼠受到驚嚇，將模型小鼠和對照小鼠放置在長30 cm的玻璃棒上，玻璃棒的直徑控制在10 mm左右，要使小鼠身體各部位肌肉保持緊張感覺，記錄小鼠從入桿至全部身體滑下之間的時間，作為小鼠爬桿的時間[15-16].

1.3.5 小鼠常壓耐缺氧時間的測定 將所有小鼠依次放置在放有100 g石灰的干燥瓶中，當(dāng)小鼠進入大瓶后及時密封瓶口，觀察小鼠活動.在缺氧環(huán)境中，小鼠活動受氧氣限制，持續(xù)一段時間后，會發(fā)生缺氧表現(xiàn).以小鼠靜臥3 min為界，將記錄小鼠從進入瓶中到靜臥前的時間記為耐缺氧時間[15-16].

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0軟件進行t檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 衰老動物模型的建立

亞急性衰老小鼠模型建立前后指標變化見圖1～4.建模前CK(0)與模型組小鼠相比在體質(zhì)量、SOD和CAT活性以及MDA含量上幾乎一致，均無顯著性差別.模型組小鼠通過頸部皮下注射D-半乳糖42 d后，與對照組相比，小鼠體質(zhì)量降低明顯，衰老小鼠體內(nèi)血液中SOD和CAT 2種酶活性顯著降低，MDA含量顯著升高，所有檢測指標均存在極顯著性差異(P<0.01)，視為亞急性衰老小鼠建模成功.建模成功的小鼠身體瘦弱、毛色枯黃、行動遲緩、反應(yīng)遲鈍、精神萎靡.

2.2 小鼠衰老試驗中紋黨多糖和紅芪多糖濃度的篩選

不同濃度的紋黨多糖(CCP)和紅芪多糖(CHP)對小鼠衰老指標的影響見圖5～12.CCP和CHP均能促進正常小鼠血清中的SOD和CAT活力，降低血清中的MDA含量，50、100 mg/kg的劑量處理與CK0組相比均無顯著差異(P>0.05)，200 mg/kg劑量處理與CK0組相比存在顯著差異(P<0.05)，400、600 mg/kg劑量處理與CK0組相比都存在極顯著差異(P<0.01)，400、600 mg/kg的CCP和CHP劑量處理之間比較均無顯著性差異(P>0.05)，這說明，400、600 mg/kg的CCP和CHP劑量對正常小鼠的衰老指標影響差異不大.所以將2種中藥多糖的劑量篩選為400 mg/kg進行后續(xù)的研究.

* P<0.05，** P<0.01.圖1 衰老小鼠模型建立前后體質(zhì)量的變化Figure 1 Changes of body weight of mice before and after model establishment.

* P<0.05，** P<0.01.圖2 衰老小鼠模型建立前后SOD酶活性的變化Figure 2 Changes of superoxide dismutase activity of mice before and after model establishment

* P<0.05，** P<0.01.圖3 衰老小鼠模型建立前后CAT酶活性的變化Figure 3 Changes of catalase activity of mice before and after model establishment

* P<0.05，** P<0.01.圖4 衰老小鼠模型建立前后MDA含量的變化Figure 4 Changes of malondialdehyde contents of mice before and after model establishment

* P<0.05，** P<0.01.圖5 紋黨多糖對小鼠體質(zhì)量的影響Figure 5 Effect of CPP on body weight in mice

* P<0.05，** P<0.01.圖6 紋黨多糖對小鼠SOD酶活性的影響Figure 6 Effect of CPP on superoxide dismutase activity in mice

* P<0.05，** P<0.01.圖7 紋黨多糖對小鼠CAT酶活性的影響Figure 7 Effect of CPP on catalase activity in mice

* P<0.05，** P<0.01.圖8 紋黨多糖對小鼠MDA含量的影響Figure 8 Effect of CPP on malondialdehyde contents in mice

* P<0.05，** P<0.01.圖9 紅芪多糖對小鼠體質(zhì)量的影響Figure 9 Effect of CHP on body weight in mice

* P<0.05，** P<0.01.圖10 紅芪多糖對小鼠SOD酶活性的影響Figure 10 Effect of CHP on superoxide dismutase activity in mice

* P<0.05，** P<0.01.圖11 紅芪多糖對小鼠CAT酶活性的影響Figure 11 Effect of CHP on catalase activity in mice

* P<0.05，** P<0.01.圖12 紅芪多糖對小鼠MDA含量的影響 Figure 12 Effect of CHP on malondialdehyde contents in mice

2.3 紋黨多糖和紅芪多糖對衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

CCP和CHP對造模成功后的亞急性衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響見圖13.衰老小鼠模型組走迷宮所用的學(xué)習(xí)記憶時間最長，與CK0組相比均呈極顯著差異(P<0.01)；連續(xù)灌胃VE治療28 d 后衰老小鼠走迷宮所用的學(xué)習(xí)記憶時間稍長于CK0組，兩者相比無顯著差異(P>0.05).衰老小鼠分別用400 mg/kg CCP和CHP連續(xù)灌胃給藥28 d后，小鼠走迷宮所用的學(xué)習(xí)記憶時間逐漸縮短，與模型組相比均差異顯著(P<0.05)，與VE組和CK0組相比小鼠所用的學(xué)習(xí)記憶時間均存在極顯著差異(P>0.01)，雖然CCP對衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的治療效果優(yōu)于CHP，但兩者間無顯著性差異(P>0.05).CCP和CHP聯(lián)合灌胃給藥28 d后，小鼠所用的學(xué)習(xí)記憶時間與模型組相比存在極顯著差異(P<0.01)，與VE組和CK0相比沒有顯著差異(P>0.05).以上結(jié)果表明，CCP對亞急性衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力具有較好的恢復(fù)作用，且效果優(yōu)于CHP，而CCP和CHP聯(lián)合用藥對亞急性衰老小鼠恢復(fù)學(xué)習(xí)記憶能力作用最明顯，與VE組無差異.

與CK0組比較，* P<0.05，** P<0.01，與模型組比較，# P<0.05，## P<0.01，與VE組比較，☆ P<0.05，☆☆ P<0.01.Compared with CK0 group,* P<0.05,** P<0.01,compared with modle group,# P<0.05,## P<0.01，compared with VE group,☆ P<0.05,☆☆ P<0.01.圖13 紋黨多糖和紅芪多糖對衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶時間的影響Figure 13 Effects of CPP and CHP on The time of learning and memory in aging mice

2.4 紋黨多糖和紅芪多糖對衰老小鼠抗疲勞作用和常壓耐缺氧的影響

CCP和CHP對造模成功后的亞急性衰老小鼠抗疲勞作用和常壓耐缺氧的影響見圖14.衰老小鼠模型組游泳時間、爬桿時間和耐缺氧時間都最短，與CK0組相比均呈極顯著差異(P<0.01)；連續(xù)灌胃VE治療28 d 后衰老小鼠游泳時間、爬桿時間和耐缺氧時間稍短于CK0組，與CK0相比均無顯著差異(P>0.05).衰老小鼠分別用400 mg/kg CCP和CHP連續(xù)灌胃給藥28 d后，小鼠游泳時間、爬桿時間和耐缺氧時間逐漸延長，與模型組小鼠相比均存在差異顯著(P<0.05)，而與VE組和CK0組相比無顯著差別(P<0.05).雖然CCP對衰老小鼠游泳時間、爬桿時間和耐缺氧時間均有延長作用，且效果優(yōu)于CHP，但兩種多糖處理間無顯著性差異(P>0.05).CCP和CHP聯(lián)合灌胃給藥28 d后，小鼠游泳時間、爬桿時間和耐缺氧時間與模型組相比存在極顯著性差異(P<0.01)，而與VE組和CK0相比無顯著性差異(P>0.05).以上結(jié)果表明，CCP和CHP對造模成功后的亞急性衰老小鼠抗疲勞作用和常壓耐缺氧具有顯著的延長作用.

與CK0組比較，* P<0.05，** P<0.01，與模型組比較，# P<0.05，## P<0.01，與VE組比較，☆ P<0.05，☆☆ P<0.01.Compared with CK0 group,* P<0.05,** P<0.01,compared with modle group,# P<0.05,## P<0.01 compared with VE group,☆ P<0.05,☆☆ P<0.01.圖14 紋黨多糖和紅芪多糖對衰老小鼠抗疲勞作用和常壓耐缺氧的影響Figure 14 Effects of CPP and CHP on anti-fatigue and hypoxia tolerance time in aging mice

3 討論與結(jié)論

D-半乳糖在動物體內(nèi)能轉(zhuǎn)化成醛糖和過氧化氫，引起動物機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，同時對動物基因的表達和調(diào)控產(chǎn)生影響，導(dǎo)致細胞轉(zhuǎn)錄水平降低而引起衰老[15-17]，是目前廣泛用于動物衰老模型建立的氧化損傷性致衰劑[18-19].本研究采用D-半乳糖構(gòu)建亞急性衰老小鼠模型.小鼠在D-半乳糖的致衰作用下，產(chǎn)生了大量的自由基，破壞生物膜的完整性，使生物膜的功能產(chǎn)生障礙，導(dǎo)致脂褐素堆積，膜的自由基清除能力下降，引起小鼠的衰老和死亡，最主要的表現(xiàn)就是小鼠體內(nèi)SOD和CAT活性受抑，導(dǎo)致MDA含量的急劇升高，體質(zhì)量降低.這幾個指標是檢測小鼠衰老的的主要指標，也是衰老動物模型建立成功與否的關(guān)鍵檢測指標.通過對小鼠頸部皮下注射D-半乳糖建模6周后，小鼠身體瘦弱、毛色枯黃、行動遲緩、反應(yīng)遲鈍、精神萎靡，小鼠血液中SOD和CAT 2種酶活性顯著降低，MDA含量顯著升高，所有檢測指標均存在極顯著性差異，所以視為亞急性衰老小鼠建模是成功的.

用紋黨和紅芪加工廢棄物中提取的活性多糖對亞急性衰老小鼠模型進行學(xué)習(xí)記憶能力和抗疲勞作用研究.先確定分別用400 mg/kg CCP和CHP對衰老小鼠進行灌胃給藥，連續(xù)灌胃給藥28 d后，衰老小鼠體質(zhì)量恢復(fù)明顯，小鼠走迷宮所用的學(xué)習(xí)記憶時間逐漸縮短，小鼠游泳時間、爬桿時間和耐缺氧時間逐漸延長，這說明CCP和CHP 2種多糖對亞急性衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力具有較好的恢復(fù)作用，能顯著提高衰老小鼠的抗疲勞作用和常溫耐缺氧時間，整體的治療效果CCP優(yōu)于CHP，且發(fā)現(xiàn)用相同濃度的CCP和CHP聯(lián)合對衰老小鼠灌胃治療后，小鼠很好地恢復(fù)了學(xué)習(xí)記憶能力、抗疲勞作用和常溫耐缺氧時間也逐漸增長，治療作用最為明顯，與VE組相比無差異.說明CCP和CHP均能提高衰老小鼠的抗疲勞作用，而且CCP和CHP聯(lián)用效果最好.

紋黨和紅芪加工廢棄物中活性多糖能夠有效地緩解和改善小鼠衰老，雖然兩種多糖的抗衰老和恢復(fù)學(xué)習(xí)記憶能力的作用沒有VE強烈，但作用比較持久和溫和.