卵巢癌患者T細(xì)胞、微血管密度與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移預(yù)后的關(guān)系

劉小麗，楊志明，王黎黎，馬華，王靜

卵巢癌惡性程度極高，臨床死亡率位居?jì)D科腫瘤之首，由于早期缺乏典型的臨床癥狀，確診時(shí)多處于中晚期，其術(shù)后5年總生存率為25%～35%[1]。尋找可靠、有效的用于臨床診治和輔助判斷預(yù)后的指標(biāo)及方法在卵巢癌治療中顯得尤為重要。卵巢癌患者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的含量能夠提示機(jī)體免疫以及抗腫瘤的狀態(tài)，對于評價(jià)預(yù)后有重要的臨床意義。微血管的形成為腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及生長提供了更多選擇性以及機(jī)會(huì)，為腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為提供營養(yǎng)支持，目前有研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌是具有血管生成力的典型腫瘤之一[2-4]。與非新生血管內(nèi)皮相比，CD34 抗原于新生血管內(nèi)皮的表達(dá)顯著提高，因此本研究選用CD34抗原來標(biāo)記微血管密度(microvessel density，MVD)[5-6]，并探究T細(xì)胞和MVD與卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移預(yù)后之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1～12月河北省冀中能源峰峰集團(tuán)總醫(yī)院北院區(qū)婦產(chǎn)科經(jīng)過病理確診的65例卵巢癌患者為卵巢癌組，平均年齡(49.24±15.78)歲。其中年齡≤50歲的30例，>50歲的35例；組織低分級的26例，組織中、高分級的39例；組織類型為漿液性癌37例，子宮內(nèi)膜樣癌20例，其他類型8例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期32例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移46例，未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移19例。

另選取術(shù)中卵巢組織病理學(xué)檢測結(jié)果為良性的30例為良性卵巢瘤組，平均年齡(48.15±14.98)歲。選取因子宮脫垂、子宮肌瘤等行子宮+卵巢切除術(shù)卵巢正常者35例為對照組，平均年齡(49.33±14.98)歲。

所有患者于術(shù)前一天統(tǒng)一抽取外周血，手術(shù)留取卵巢組織，用濃度為10%的福爾馬林進(jìn)行固定備用。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情同意。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：① 卵巢癌患者由影像和病理雙重確診；② 所有患者均是卵巢癌首次手術(shù)治療患者；③ 此前無手術(shù)以及放化療治療史；④ 均無精神疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 排除復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性卵巢癌；② 患血液系統(tǒng)??；③ 患感染性疾病；④ 心、肝、腎功能受損患者。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞

采用FACSCantoⅡ型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)分別對卵巢癌組和對照組的外周血樣進(jìn)行檢測，檢測血清中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的占比以及計(jì)算CD4+/CD8+的比值。

1.4 免疫組化法檢測微血管密度

對樣本組織制作5 μm厚的石蠟切片，脫蠟后進(jìn)行熱修復(fù)和PBS沖洗，封閉后加入CD34一抗，4℃孵育過夜，重復(fù)操作再滴加二抗，經(jīng)過PBS反復(fù)沖洗用DAB進(jìn)行顯色，蘇木素固色，使用梯度濃度的酒精脫水處理，滴加二甲苯使切片透明，最后使用中性樹膠進(jìn)行封片。 MVD計(jì)數(shù)方法：每例樣本選擇5個(gè)視野，200倍高倍鏡下觀察，棕黃色為CD34在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的陽性染色，當(dāng)多個(gè)被染色的內(nèi)皮細(xì)胞連成一條管腔時(shí)記為一條微血管，計(jì)算每例樣本的MVD均數(shù)為該卵巢癌患者的MVD值。

1.5 預(yù)后隨訪

術(shù)后兩年內(nèi)對每例患者進(jìn)行每3月一次的電話隨訪，兩年后每5個(gè)月隨訪一次，隨訪截止時(shí)間為2020年3月，隨訪時(shí)間為3～39個(gè)月。總生存期(overall survival，OS)即為手術(shù)之日起至患者死亡或者隨訪結(jié)束的月數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組與對照組T細(xì)胞比較

卵巢癌組患者的血清中T淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+的百分比含量以及CD4+/CD8+的比值較對照組低，CD8+的百分比含量較對照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見下頁表1。

表1 卵巢癌組與對照組T細(xì)胞比較

2.2 各組卵巢組織微血管密度比較

卵巢癌組、良性卵巢瘤組、對照組的卵巢組織MVD比較[(50.01±2.32)、(22.56±1.20)、(7.89±3.11)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.122，P<0.05)。卵巢癌組和良性卵巢瘤組的MVD較對照組高(t=2.311，3.534，P<0.05)；卵巢癌組較良性卵巢瘤組的MVD高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.276，P<0.05)。

2.3 卵巢癌患者血清T細(xì)胞、組織微血管密度與病理特征關(guān)系

在不同組織類型卵巢癌患者中，血清T細(xì)胞以及組織MVD的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；卵巢癌患者年齡≤50歲較>50歲患者T淋巴細(xì)胞CD3+、CD8+的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，年齡>50歲的患者較年齡≤50歲者CD4+和CD4+/CD8+的比值降低，MVD上升(P<0.05)；組織高分級的卵巢癌患者較組織低分級的患者CD3+、CD4+和CD4+/CD8+上升，CD8+和MVD降低(P<0.05)；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期較Ⅲ～Ⅳ期的患者CD3+、CD4+和CD4+/CD8+上升，CD8+和MVD降低(P<0.05)；癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者較未轉(zhuǎn)移患者的CD3+、CD4+和CD4+/CD8+降低，CD8+和MVD上升(P<0.05)，詳見表2。

表2 卵巢癌患者血清T細(xì)胞、組織微血管密度與病理特征關(guān)系

2.4 卵巢癌患者T細(xì)胞水平、微血管密度與預(yù)后關(guān)系

以T淋巴細(xì)胞CD3+細(xì)胞的水平高低來表示卵巢癌患者T細(xì)胞水平的高低，可知T細(xì)胞高水平組患者的中位OS為33.00個(gè)月，較T細(xì)胞低水平患者OS 20.50個(gè)月顯著上升(P<0.05)；MVD低表達(dá)的卵巢癌患者術(shù)后中位OS為38.00個(gè)月，較MVD高表達(dá)的卵巢癌患者22.00個(gè)月顯著升高(P<0.05)。詳見下頁圖1。

注：A圖代表T細(xì)胞水平分組；B圖代表MVD水平分組。

2.5 卵巢癌患者預(yù)后影響因素分析

單因素分析顯示，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、T細(xì)胞低水平及MVD高水平是影響卵巢癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)；多因素分析顯示，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、T細(xì)胞低水平以及MVD高水平是影響卵巢癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，詳見表3，表4。

表3 影響卵巢癌患者預(yù)后的單因素分析

表4 影響卵巢癌患者預(yù)后的多因素分析

3 討論

卵巢癌的的主要特點(diǎn)為早期難確診、高惡性、易轉(zhuǎn)移、手術(shù)徹底治愈率低以及易出現(xiàn)耐藥性，故其死亡率在生殖系統(tǒng)惡性腫瘤疾病中位居前列。阻止癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是防止卵巢癌腫瘤惡性程度進(jìn)一步加深的關(guān)鍵性舉措，探究影響患者手術(shù)預(yù)后的相關(guān)因素也是為患者術(shù)后爭取更多生存時(shí)間的重要突破口。研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展其本質(zhì)是與免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)互相影響和作用的結(jié)果，機(jī)體的免疫狀態(tài)紊亂與癌細(xì)胞的增殖、侵襲和卵巢癌發(fā)展預(yù)后存在著緊密的聯(lián)系[7]。免疫T細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)的重要參與部分，細(xì)胞免疫相關(guān)指標(biāo)的檢測對于評估腫瘤發(fā)展預(yù)后有重要的臨床價(jià)值[8]。常用T細(xì)胞亞群檢測評價(jià)免疫功能，CD3+的水平代表機(jī)體整體細(xì)胞免疫的水平高低，CD4+作為輔助性T細(xì)胞的重要標(biāo)志能夠通過刺激其他淋巴細(xì)胞參與免疫反應(yīng)，并輔助調(diào)控其他細(xì)胞發(fā)揮功能，CD8+能夠?qū)?xì)胞免疫和抗體的形成負(fù)向調(diào)節(jié)，健康者血清中CD4+和CD8+的比值處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)展過程中CD8+經(jīng)誘導(dǎo)刺激會(huì)有所增多[9]，CD4+和CD8+的比值發(fā)生顯著改變，免疫平衡被打破，對卵巢癌患者的疾病發(fā)展和身體恢復(fù)都會(huì)產(chǎn)生影響[10-13]。臨床試驗(yàn)以及動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)，腫瘤在失去血管提供營養(yǎng)后最大能夠長至2 mm就不再生長，腫瘤微血管為腫瘤的生長及侵襲均提供了營養(yǎng)支持。腫瘤微血管長度與細(xì)胞分裂增殖的速度成反比，說明MVD對于腫瘤生長起著決定性的作用，沒有微血管系統(tǒng)的營養(yǎng)支持，腫瘤組織生長將會(huì)靜止停滯，體積增長受限。本試驗(yàn)主要研究T細(xì)胞、MVD與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移預(yù)后的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者CD3+、CD4+的百分比含量以及CD4+/CD8+的比值較健康者顯著降低，CD8+的百分比含量顯著升高，說明卵巢癌患者的機(jī)體免疫功能較健康者顯著下降，提高機(jī)體免疫功能對于卵巢癌的疾病轉(zhuǎn)歸有重要的意義。卵巢癌和良性卵巢瘤組織中的MVD較正常卵巢組織中顯著上升，卵巢癌組織較良性卵巢瘤組織中的MVD顯著上升，說明腫瘤組織MVD會(huì)隨著病理組織的惡性程度增加而變大，進(jìn)一步驗(yàn)證了微血管為腫瘤生長及惡性生物學(xué)行為提供營養(yǎng)支持的說法，提示抑制腫瘤微血管生成也是治療該病的關(guān)鍵。卵巢癌患者年齡≤50歲與>50歲患者T淋巴細(xì)胞CD3+、CD8+的含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，年齡>50歲的患者較年齡≤50歲者CD4+和CD4+/CD8+的比值顯著降低，MVD顯著上升，說明隨著年齡的增大，機(jī)體免疫系統(tǒng)的不穩(wěn)定因素增多導(dǎo)致免疫功能出現(xiàn)紊亂。組織中高分級、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期較組織低分級、Ⅲ～Ⅳ期的患者CD3+、CD4+和CD4+/CD8+顯著上升，CD8+和MVD顯著降低，說明卵巢癌的發(fā)展越到后期，患者的免疫功能越弱，組織微血管的密度越大，并且可能形成這種免疫功能降低、MVD增加促進(jìn)卵巢癌疾病發(fā)展的惡性循環(huán)。癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者較未轉(zhuǎn)移患者的CD3+、CD4+和CD4+/CD8+顯著降低，CD8+和MVD顯著上升。T細(xì)胞高水平組患者的中位OS較T細(xì)胞低水平患者OS 顯著上升；MVD低表達(dá)的卵巢癌患者術(shù)后中位OS較MVD高表達(dá)的卵巢癌患者顯著升高。說明患者免疫功能降低和MVD增大促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移以及提示患者的不良預(yù)后。多因素分析顯示：臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、T細(xì)胞低水平以及MVD高水平是影響卵巢癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，這一結(jié)論為卵巢癌的預(yù)后危險(xiǎn)因素排除提供了方向。

綜上所述，卵巢癌患者T細(xì)胞、MVD與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切，有望用于卵巢癌臨床治療方案選擇及預(yù)后評估。