基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究重樓皂苷抗腫瘤的協(xié)同機制

朱曉芹， 嚴石煥， 覃 楊， 藍慧琴， 王博龍， 朱 丹*

(1.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院， 宜春 336000； 2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 南寧 530021)

皂苷是苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷，按其配基結(jié)構(gòu)可分為螺旋甾烷類、呋喃甾烷類、呋喃螺旋甾烷類、四環(huán)三萜類、五環(huán)三萜類。皂苷類化合物廣泛分布于重樓、人參、黃芪等傳統(tǒng)中草藥，陸地高等植物及部分海洋生物中，具有抗腫瘤、抗病毒[1]、抗炎[2]、神經(jīng)保護[3]等多種藥理學(xué)活性。尤其在抗腫瘤方面，皂苷具有抑制腫瘤細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移、侵襲，逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥，抑制腫瘤血管生成[4]，影響腫瘤細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]等多重抗腫瘤機制，是一類值得深入研究的抗腫瘤化合物。

重樓為百合科植物云南重樓(ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz .)或七葉一枝花(ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara)的干燥根莖，是臨床腫瘤治療的常用中藥之一。重樓富含皂苷、黃酮、甾醇等多種化學(xué)物質(zhì)，其中的皂苷不僅含量最多且活性很高，是重樓的主要藥效物質(zhì)。中外有關(guān)重樓皂苷抗腫瘤研究多集中在重樓皂苷Ⅰ[6]、Ⅱ[7]、Ⅵ[8]、Ⅶ[9]，薯蕷皂苷[10]等皂苷單體的點狀或線性機制上，不能整體揭示重樓皂苷多成分、多靶點、多通路抗腫瘤的協(xié)同機制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)為基礎(chǔ)，通過構(gòu)建成分、靶點、通路、疾病之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，能夠全面探討多成分藥物的復(fù)雜機制[11]?，F(xiàn)基于文獻挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選重樓皂苷抗腫瘤的主要成分，構(gòu)建主要皂苷成分-主要作用靶點-主要通路的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，篩選重樓皂苷抗腫瘤的核心成分、核心靶點及核心通路，旨在全方位展現(xiàn)重樓皂苷抗腫瘤的網(wǎng)狀機制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件

(1)靶點數(shù)據(jù)庫：Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)；GenCLip 3(http://ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php)；GeneCards(https://www.genecards.org/)；CTD(http://ctdbase.org/)。

(2)蛋白互作平臺：STRING(https://string-db.org/)。

(3)富集分析工具：KOBAS 3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3)；DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)。

(4)網(wǎng)絡(luò)分析及作圖軟件：Cytoscape 3.6.1；FunRich；Origin 2019b。

1.2 挖掘重樓抗腫瘤的主要皂苷成分及其靶點

基于含量高低與活性大小的綜合考量，查閱文獻篩選重樓抗腫瘤的主要皂苷成分。再運用Swiss Target Prediction、GenCLip 3及CTD檢索主要皂苷成分的潛在靶點，合并以上3個來源的靶點，構(gòu)建重樓主要皂苷成分的靶點集合。分別在GeneCards、GenCLiP 3中檢索癌癥相關(guān)靶點，根據(jù)相關(guān)度分值從高到低各篩前500 個，將以上2個數(shù)據(jù)庫獲取的癌癥靶點與主要皂苷成分靶點輸入FunRich軟件，取三者交集作為重樓主要皂苷成分的抗腫瘤靶點，將上述靶點及對應(yīng)成分導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建重樓主要皂苷成分-抗腫瘤靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及主要作用靶點篩選

在STRING平臺構(gòu)建重樓主要皂苷成分抗腫瘤靶蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為medium confidence=0.4，其他參數(shù)保持默認值。自由度中心性(degree centrality，DC)及介度中心性(betweenness centrality，BC)是判斷節(jié)點中心特性的重要參數(shù)，DC可反映網(wǎng)絡(luò)中某一個節(jié)點與其他節(jié)點的連接數(shù)目，BC是網(wǎng)絡(luò)中所有最短的路徑中經(jīng)過該節(jié)點的路徑的數(shù)目與最短路徑總數(shù)的比值，節(jié)點的DC、BC越高，該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的影響力就越大。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入CytoNCA插件，篩選DC、BC均大于平均值的主要作用靶點進一步分析。

1.4 GO生物過程和KEGG通路富集分析

將1.3節(jié)項得到的主要作用靶點分別導(dǎo)入DAVID 6.8和KOBAS 3.0，進行GO(gene ontology)富集分析及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，依據(jù)P<0.001篩選富集到的生物功能及信號通路。

1.5 重樓抗腫瘤主要皂苷成分-主要作用靶點-主要通路關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將重樓抗腫瘤的主要皂苷成分、主要作用靶點及主要通路導(dǎo)入Origin 2019b，構(gòu)建主要皂苷成分-主要作用靶點-主要通路關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，利用CytoNCA插件篩選該網(wǎng)絡(luò)中DC、BC均大于平均值的節(jié)點，作為重樓皂苷抗腫瘤的核心成分、核心靶點及核心通路，以明確其抗腫瘤的協(xié)同機制。

2 結(jié)果

2.1 重樓皂苷抗腫瘤主要成分及其靶點網(wǎng)絡(luò)

挖掘中國知網(wǎng)、萬方、維普及PubMed等數(shù)據(jù)庫的重樓皂苷抗腫瘤文獻[6-10,12-14]，發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅰ(PolyphyllinⅠ)、重樓皂苷Ⅱ(Polyphyllin II)、重樓皂苷Ⅵ(Polyphyllin Ⅵ)、重樓皂苷Ⅶ(Polyphyllin Ⅶ)、重樓皂苷H(Polyphyllin H)、薯蕷皂苷(Dioscin)及纖細薯蕷皂苷(Gracillin)的抗腫瘤活性高且含量豐富，故以此7 種皂苷作為重樓抗腫瘤的主要成分。分別從Swiss Target Prediction、GenCLip 3及CTD得到重樓主要皂苷成分靶點275、241、91 個，合并去重后得到主要皂苷成分靶點519 個。再從GeneCards、GenCLiP 3數(shù)據(jù)庫分別挖掘癌癥靶點各500 個，取得三者交集后得到重樓的132 個抗腫瘤靶點(圖1)，將132 個抗腫瘤靶點及7 個皂苷成分導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件，構(gòu)建主要皂苷成分-抗腫瘤靶點網(wǎng)絡(luò)(圖2)。

圖1 主要皂苷成分-抗腫瘤靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of main saponins-antitumor targets

圖2 主要皂苷成分-抗腫瘤靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Network of main saponins-antitumor targets

2.2 抗腫瘤靶蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

如圖3所示，每個圓圈代表參與互作的靶點，圓圈面積越大表示DC越高，節(jié)點的顏色越深，對應(yīng)的BC越高。結(jié)果PPI網(wǎng)絡(luò)共有132個節(jié)點(所有靶蛋白均參與)及3 726條作用連線，平均DC為56.5，平均BC為75.0，DC、BC同時在平均值之上的主要作用靶點有38 個(表1)。包括轉(zhuǎn)錄與凋亡相關(guān)的TP53、AKT1、MYC、CASP3、JUN、MAPK3、ERBB2、STAT3、SRC、MAPK8、BCL2L1、CTNNB1、MAPK1、CREB1、FOXO1、CASP8、FOS；炎癥反應(yīng)相關(guān)的IL6、TNF、IL1B、PTGS2、IL2；血管生成相關(guān)的EGFR、VEGFA、EGF、FGF2等。

圖3 抗腫瘤靶蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of antitumor target proteins

2.3 GO生物過程富集分析

將主要作用靶點導(dǎo)入DAVID 6.8進行GO生物過程富集分析，設(shè)置閾值P<0.001，共得到103個條目。圖4是前20 個與腫瘤相關(guān)的生物過程，包括DNA轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程的調(diào)控、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、細胞增殖的調(diào)控、磷脂酰肌醇3-激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控等，其中富集靶點數(shù)目最多的是DNA轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控與RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，富集因子(rich factor)最大兩個生物過程是ERBB2信號通路、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控。表明重樓皂苷抗腫瘤的作用機制可能與DNA、RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)磷酸化，細胞凋亡、增殖等密切相關(guān)。

2.4 KEGG通路富集分析

依據(jù)P<0.001，篩得抗腫瘤主要KEGG通路39 條(表2)，包括卡波濟肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染、人乳頭瘤病毒感染、T細胞白血病病毒感染等8條病毒通路，乳腺癌、大腸癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤、肝細胞癌等16 條腫瘤專屬通路，以及PI3K-Akt、TNF、ErbB、MAPK、IL-17、FoxO、細胞凋亡、雌激素、HIF-1、Jak-STAT等15 條一般通路。

表1 主要作用靶點及其拓撲參數(shù)Table 1 Main targets and their topological parameters

圖4 主要作用靶點的生物過程Fig.4 Biological processes of main targets

2.5 主要皂苷成分-主要作用靶點-主要通路關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)

將重樓抗腫瘤的7個皂苷成分、38個主要作用靶點及39條信號通路導(dǎo)入Origin 2019b，構(gòu)建主要皂苷成分-主要作用靶點-主要通路關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。如圖5所示，重樓皂苷成分、主要作用靶點、信號通路相互交織成網(wǎng)，說明重樓皂苷可通過多靶點、多信號通路起到抗腫瘤的作用。該網(wǎng)絡(luò)平均DC為15.1，平均BC為95.0，DC、BC同時在平均值之上的節(jié)點有24個(表3)，包括2個核心成分(重樓皂苷Ⅰ、薯蕷皂苷)，15個核心靶點(MAPK1、PIK3CA、AKT1、MAPK3、KRAS、CDKN1A、CCND1、TP53、EGFR、JUN、BCL2L1、STAT3、CASP3、VEGFA、MTOR)，7條核心通路(卡波濟肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細胞病毒感染、人乳頭瘤病毒感染、PI3K-Akt、乳腺癌、前列腺癌、MAPK)。

3 討論

皂苷是重樓的主要藥效物質(zhì)，2015年版的《中國藥典》就以重樓皂苷I、II、VI、VII 作為質(zhì)控指標，要求四者總量大于0.6%，但越來越多的學(xué)者對《中國藥典》重樓藥材標準提出了新的思考和建議。如黃圓圓等[12]建立了同時測定重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H，薯蕷皂苷及纖細薯蕷皂苷的分析方法，并對15 種重樓屬植物根莖中重樓皂苷的含量進行了評價，認為藥典中僅測定重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量，并不能很好地反應(yīng)藥材的品質(zhì)，應(yīng)將其中含量較高且具有顯著止血及細胞毒性的纖細薯蕷皂苷、薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅴ及重樓皂苷H考慮其中，而藥理試驗也證實了這些成分的抗腫瘤活性。如龐曉輝等[13-14]發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ、H對結(jié)腸癌細胞Lovo、SW620、SW480、Colo320具有良好的體外抗腫瘤活性，其中以重樓皂苷Ⅰ最為顯著，其體外抗腫瘤活性與結(jié)腸癌處方藥奧沙利鉑相當；薯蕷皂苷更是具有多重抗腫瘤機制，既可通過活性氧介導(dǎo)的DNA損傷[15]、線粒體凋亡途徑，以及VEGFR2[16]、ERK[17]、JNK[18]等信號通路誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，還可逆轉(zhuǎn)TGF-β1[19-20]誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。因此，選取重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、H，薯蕷皂苷及纖細薯蕷皂苷作為重樓抗腫瘤活性成分。

表2 KEGG信號通路信息Table 2 KEGG signaling pathway information

圖5 主要皂苷成分-主要作用靶點-主要通路關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Associated network of main saponins-main targets-main signaling pathways

表3 網(wǎng)絡(luò)核心節(jié)點及其拓撲參數(shù)Table 3 Core nodes and their topological parameters of network

檢索多個化合物靶點數(shù)據(jù)庫、疾病靶點數(shù)據(jù)庫，挖掘出132個重樓皂苷抗腫瘤靶點。借助蛋白互作及CytoNCA插件，篩選出38 個DC、BC均大于平均值的主要作用靶點，包括調(diào)控轉(zhuǎn)錄與凋亡相關(guān)的TP53、AKT1、MYC、CASP3、JUN、MAPK3、ERBB2、STAT3、SRC、MAPK8、BCL2L1、CTNNB1、MAPK1、CREB1、FOXO1、CASP8、FOS；炎癥反應(yīng)相關(guān)的IL6、TNF、IL1B、PTGS2、IL2；血管生成相關(guān)的EGFR、VEGFA、EGF、FGF2等。中外研究證實這些靶點在重樓皂苷抗腫瘤效應(yīng)中發(fā)揮重要作用，如重樓皂苷Ⅰ可調(diào)節(jié)白細胞介素6(IL6)[21]、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)[22]、β-連環(huán)蛋白(CTNNB1)[23]等蛋白，阻滯腫瘤細胞周期或誘導(dǎo)細胞凋亡；薯蕷皂苷可通過調(diào)節(jié)雌激素β受體[24]、c-myc泛素化[25]、半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)、Bcl-2蛋白家族等蛋白，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。此外，研究[26]已經(jīng)證實炎癥尤其是慢性炎癥與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，炎癥細胞促進腫瘤生長，產(chǎn)生有利于腫瘤生長的微環(huán)境，誘導(dǎo)基因突變，促進血管生成。而重樓皂苷Ⅶ能夠減少小鼠和斑馬魚模型體內(nèi)NO和前列腺素E2的產(chǎn)生，并降低了促炎細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)和誘導(dǎo)型NO合酶、環(huán)氧合酶2(COX-2)的mRNA及蛋白質(zhì)表達[27]。眾所周知，腫瘤血管生成可為腫瘤組織提供新陳代謝所需的氧氣和營養(yǎng)，同時為腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移提供能量，在促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移上產(chǎn)生關(guān)鍵作用[28]，Tong等[29]發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷可以抑制VEGFR2的諸多下游蛋白激酶，如Src，F(xiàn)ak，Akt和Erk1/2等，抑制結(jié)腸腫瘤生長及其血管生成。由此可見，重樓皂苷抗腫瘤作用涉及細胞凋亡、炎癥、血管生成等多種機制。

取38個主要作用靶點進行GO生物過程和KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)GO條目主要富集在DNA轉(zhuǎn)錄、細胞增殖及凋亡、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄、一氧化氮生物合成、磷脂酰肌醇3-激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，其中DNA和RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄、ERBB2信號通路及一氧化氮生物合成顯著性最高，表明上述生物過程深度參與重樓皂苷抗腫瘤效應(yīng)。KEGG富集通路主要分3種類型，即卡波濟肉瘤相關(guān)皰疹病毒(HHV-8)、人巨細胞病毒(HCMV)、人乳頭瘤病毒(HPV)感染等8 條病毒通路；乳腺癌、大腸癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌等16條腫瘤專屬通路；以及PI3K-Akt、TNF、MAPK、mTOR、p53等15條傳導(dǎo)通路。研究[30]表明10%～20%人類惡性腫瘤是由病毒引起的，EBV、HBV、HCV、HPV、HTLV-1、HHV-8和Merkel細胞多瘤病毒等都是國際上公認的具有致癌潛能的病原體，在人類腫瘤形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。如HCMV可見于乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肝細胞癌、膠質(zhì)母細胞瘤等90%以上的人類上皮性腫瘤中，還可影響腫瘤細胞的粘附、遷移、侵襲[31]。另外，部分病毒感染不僅直接或間接致癌，還能影響細胞內(nèi)PI3K/AKT/mTOR及MAPK等重要信號通路，從而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、分化、代謝、轉(zhuǎn)移及細胞骨架重組等[32]。龍劍文等[33]發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅰ可抑制人黑素瘤A375細胞中PI3K、Akt、mTOR的磷酸化，阻止PI3K/AKT/mTOR通路的活化，促進黑素瘤細胞自噬和凋亡，并阻滯黑素瘤細胞周期。薯蕷皂苷也被證實可通過ROS介導(dǎo)的PI3K/AKT信號、AKT/GSK3b/mTOR信號，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑制腫癌細胞增殖、侵襲以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[34-35]。

4 結(jié)論

通過文獻挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，確定了重樓抗腫瘤的主要皂苷成分，挖掘了它們的抗腫瘤靶點、生物過程以及信號通路，發(fā)現(xiàn)重樓皂苷主要通過促凋亡、抗炎、抗病毒、抗腫瘤血管生成及影響腫瘤細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種機制，協(xié)同產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)。