細(xì)胞凋亡對宰后肌肉嫩化作用機(jī)理的研究進(jìn)展

黃峰，魏起超，李俠，劉春梅，張春暉

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

0 引言

嫩度是決定肉食用品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，消費(fèi)調(diào)查顯示，大多數(shù)消費(fèi)者對嫩度較好的肉具有更強(qiáng)的購買意愿[1]，且愿意購買價(jià)格高但嫩度有保證的肉[2]。與風(fēng)味和多汁性不同，宰后肉的嫩度會發(fā)生不連續(xù)變化，剛屠宰的肉嫩度最好，由于尸僵的發(fā)生，嫩度會降低，隨后的解僵成熟又使嫩度逐步改善。這種不連續(xù)變化極易造成肉的最終嫩度較差且不穩(wěn)定，嚴(yán)重降低肉的商品價(jià)值和消費(fèi)者滿意度。為充分改善宰后肉的嫩度、縮短嫩化時(shí)間，亟需闡明宰后肉的嫩化機(jī)理。

宰后肌肉嫩化機(jī)理研究可分為以下階段：第一階段，明確肌原纖維蛋白有限降解是宰后嫩度改善的主要原因，而肌節(jié)長度主要在僵直過程影響嫩度，結(jié)締組織含量決定肉的“本底硬度”[3-4]。第二階段，集中在“鈣學(xué)說”和“鈣激活酶學(xué)說”之爭，最終明確鈣激活酶是宰后肌肉嫩度改善的主要原因[4-5]。第三階段，揭示了宰后肌細(xì)胞以凋亡的形式死亡，除鈣激活酶外，細(xì)胞凋亡酶在宰后早期肌肉嫩化中也發(fā)揮重要作用，宰后嫩化是多種內(nèi)源酶協(xié)同作用的結(jié)果[6]。本文重點(diǎn)討論基于細(xì)胞凋亡的宰后嫩化機(jī)制最新研究進(jìn)展，并分析嫩化過程中可能存在的生化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 宰后肌細(xì)胞的死亡形式

1.1 細(xì)胞凋亡是宰后肌細(xì)胞死亡的主要形式

動(dòng)物被屠宰放血后，肌細(xì)胞的營養(yǎng)基質(zhì)及氧氣供應(yīng)被中斷，造成活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量累積、ATP（adenosine triphosphate）逐漸耗盡等劇烈應(yīng)激變化，必然導(dǎo)致細(xì)胞死亡[7]。目前已發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式包括凋亡、壞死、自噬等，其中凋亡和壞死是兩種主要死亡模式[8]。每種死亡方式都有其典型特征，凋亡與壞死的區(qū)別在前期研究中有詳細(xì)綜述[9]。早期有關(guān)宰后肌肉生化的研究并沒有關(guān)注細(xì)胞的死亡方式，但隨著凋亡概念引入至宰后肌肉嫩化領(lǐng)域[6]，宰后肌細(xì)胞死亡逐漸受到學(xué)者關(guān)注，并被認(rèn)為與宰后肌肉嫩化過程高度相關(guān)[10]。OUALI等[6]發(fā)現(xiàn)宰后肌細(xì)胞間隙的增大并不是由傳統(tǒng)認(rèn)為的 pH下降所引起，而可能是由細(xì)胞發(fā)生死亡、產(chǎn)生皺縮而導(dǎo)致，并最早提出宰后肌細(xì)胞是以凋亡的形式死亡[11]。隨后的相關(guān)研究也表明宰后肌細(xì)胞發(fā)生收縮、細(xì)胞核收縮并邊緣化、磷脂酰絲氨酸外翻、細(xì)胞核原位末端（terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP-biotin nick end labeling assay，TUNEL）和laminin雙重染色呈陽性、出現(xiàn)凋亡小體，這些形態(tài)學(xué)變化均支持宰后肌細(xì)胞是以凋亡的形式死亡[12-14]。細(xì)胞凋亡出現(xiàn)的典型形態(tài)特征主要是細(xì)胞內(nèi)一類稱為半胱氨酸天冬氨酸水解酶（細(xì)胞凋亡酶）的蛋白酶家族激活后，切割特定的底物引起。因此，細(xì)胞凋亡酶的激活及對相關(guān)特征底物的裂解是細(xì)胞凋亡的重要生化特征。目前，大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)宰后肌肉中細(xì)胞凋亡酶能夠被激活，如KEMP等[15]利用免疫印記技術(shù)在屠宰1 h后的豬肉背肌中檢測到細(xì)胞凋亡酶-3的酶原及激活片段，且其活性約在宰后 2 h達(dá)到最大值。CHEN等[16]在宰后雞胸肉中也檢測到細(xì)胞凋亡酶-3的激活片段，同時(shí)也檢測到血影蛋白被細(xì)胞凋亡酶-3特異性降解的120 kD片段。雖然UNDERWOOD等[17]報(bào)道宰后牛肉中細(xì)胞凋亡酶-3不能夠被激活，但大多數(shù)研究從宰后肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生化特征變化方面均揭示宰后肌細(xì)胞是以凋亡的形式死亡。

1.2 宰后早期肌細(xì)胞死亡可能是從自噬到凋亡的轉(zhuǎn)化

目前的研究雖揭示了凋亡是宰后肌細(xì)胞的主要死亡方式。但肌細(xì)胞是一種典型的多核細(xì)胞，其死亡方式相比單細(xì)胞更為復(fù)雜[18]，且宰后肌肉內(nèi)環(huán)境變化劇烈，宰后所有骨骼肌細(xì)胞是否都是以凋亡的形式死亡，有沒有可能存在自噬、壞死等其他死亡方式，這些都值得進(jìn)一步探討。有學(xué)者認(rèn)為，自噬、凋亡、壞死等可能是細(xì)胞在形態(tài)學(xué)和生化學(xué)上死亡的終點(diǎn)，在死亡過程中各種死亡方式間可出現(xiàn)并存，甚至相互轉(zhuǎn)化[19]。宰后肌肉嫩化一般分為3個(gè)階段：（1）僵直前階段，氧氣供應(yīng)終止，但肌肉仍保持生理狀態(tài)。（2）僵直階段，能量被逐漸耗盡，逐漸達(dá)到最大僵直狀態(tài)，嫩度最差。（3）成熟階段，肌肉內(nèi)源酶水解蛋白質(zhì)，嫩度逐步改善。每個(gè)階段可能存在不同的細(xì)胞死亡變化（圖1）。動(dòng)物剛被屠宰放血后，一方面ROS大量產(chǎn)生，促使肌細(xì)胞走向死亡；另一方面機(jī)體本能的啟動(dòng)防御系統(tǒng)，熱休克蛋白等保護(hù)因子被激活，抵抗ROS損傷細(xì)胞，細(xì)胞發(fā)生自噬行為以保護(hù)損傷肌細(xì)胞。LANA等[20]也認(rèn)為宰后肌肉中 ROS可能誘導(dǎo)肌細(xì)胞發(fā)生凋亡或自噬，尤其在ROS不過量時(shí)細(xì)胞會通過自噬啟動(dòng)自身的防御系統(tǒng)。已有研究也表明，宰后肌細(xì)胞缺氧環(huán)境下出現(xiàn)了Becline-1和LC3蛋白表達(dá)量提高等典型自噬特征，并可通過細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素及其抑制劑3-甲基腺嘌呤孵育處理調(diào)控細(xì)胞自噬，并進(jìn)一步調(diào)控凋亡過程[21]。宰后肌細(xì)胞自噬應(yīng)該是機(jī)體發(fā)生的一種短暫保護(hù)行為，隨著宰后時(shí)間的延長，持續(xù)的缺氧使ROS大量累積，機(jī)體的抗氧化功能消失，最終肌細(xì)胞必然凋亡。自噬和凋亡是宰后肌細(xì)胞生死走向的兩個(gè)方向，兩者發(fā)生程度的大小主要受線粒體調(diào)控。因?yàn)榫€粒體是產(chǎn)生ROS的主要場所，同時(shí)也最易受到ROS攻擊，造成線粒體損傷，其釋放出“死亡因子”或“保護(hù)因子”的多少和程度，直接調(diào)控缺氧環(huán)境下細(xì)胞是否死亡以及如何死亡。

1.3 宰后后期肌細(xì)胞可能從凋亡轉(zhuǎn)變?yōu)閴乃?/h3>

隨著對宰后肌細(xì)胞死亡方式研究的逐漸深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)并不是所有的宰后肌細(xì)胞以凋亡形式死亡，隨著宰后時(shí)間延長，肌細(xì)胞中出現(xiàn)壞死的典型特征。如 CAO等[12]觀察宰后牛肉骨骼肌細(xì)胞形態(tài)時(shí)發(fā)現(xiàn)了肌纖維的玻璃化，部分細(xì)胞核的核質(zhì)完全潰散，核質(zhì)消失等典型壞死特征，并認(rèn)為宰后肌細(xì)胞凋亡和壞死共存。DEGTEREV等[22]認(rèn)為凋亡和壞死是細(xì)胞死亡的兩種極端類型，兩種死亡方式可相互轉(zhuǎn)化，并會出現(xiàn)凋亡和壞死特征并存的現(xiàn)象。因此，宰后肌細(xì)胞死亡可能存在凋亡、凋亡性壞死等多種模式共存，宰后早期出現(xiàn)凋亡特征，而后期轉(zhuǎn)化為壞死，且凋亡和壞死機(jī)制并不是截然分開，而是共存或者重疊（圖1）。

宰后肌細(xì)胞多種死亡模式間的交叉、轉(zhuǎn)換可能與外界刺激的強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間及動(dòng)物品種等因素相關(guān)。目前關(guān)于這方面的研究還未見相關(guān)報(bào)道，從理論本質(zhì)上分析，細(xì)胞內(nèi)能量變化和線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）開放狀態(tài)可能是調(diào)控宰后肌細(xì)胞死亡的關(guān)鍵。首先，細(xì)胞凋亡是一個(gè)需要消耗能量的過程，而壞死的發(fā)生不需要能量。動(dòng)物被屠宰放血后，機(jī)體能量再生功能喪失，殘存的ATP在無氧條件下也急劇下降，如豬肉宰后24 h的ATP幾乎被耗盡[23]，當(dāng)需要大量能量的凋亡過程不能進(jìn)行時(shí)，凋亡過程可能轉(zhuǎn)化為壞死。相反，如果能阻止明顯的ATP耗竭，細(xì)胞壞死可能就很難發(fā)生[19]。其次，線粒體不僅是細(xì)胞內(nèi)能量代謝的場所，同時(shí)也是細(xì)胞死亡的決策者和執(zhí)行者[24]。MPTP調(diào)控的線粒體死亡因子釋放是細(xì)胞內(nèi)死亡級聯(lián)反應(yīng)的總開關(guān)，其開放狀態(tài)直接決定著細(xì)胞以何種途徑進(jìn)行死亡[25]。大多數(shù)凋亡過程需要細(xì)胞凋亡酶來完成最后的執(zhí)行過程，鈣激活酶雖然也參與部分細(xì)胞凋亡過程，但其主要是執(zhí)行細(xì)胞的壞死程序。如果宰后細(xì)胞是以多種死亡形式共存，凋亡過程可以轉(zhuǎn)化為壞死，那么細(xì)胞凋亡酶和鈣激活酶之間應(yīng)該存在交互作用。HUANG等[26]研究發(fā)現(xiàn)，宰后肌肉成熟過程中細(xì)胞凋亡酶-3可以降解Calpastatin，從而影響鈣激活酶的活性，Calpastatin可能是細(xì)胞凋亡酶和鈣激活酶之間相互作用的中間鏈接，相似的試驗(yàn)結(jié)果在病理性凋亡模型中也有報(bào)道[27-28]。同時(shí)也有研究表明，鈣激活酶可以直接裂解細(xì)胞凋亡酶而使其失活[29]。因此，宰后肌肉中細(xì)胞凋亡酶和鈣激活酶之間是存在相互作用的，并且細(xì)胞凋亡酶早于鈣激活酶激活，激活的細(xì)胞凋亡酶可通過降解Calpastatin參與鈣激活酶的激活過程，而激活后的鈣激活酶可使細(xì)胞凋亡酶失活。這也與宰后肌細(xì)胞從凋亡向壞死轉(zhuǎn)變的推想一致。

2 細(xì)胞凋亡酶的主要激活通路

細(xì)胞凋亡酶激活是大多數(shù)凋亡程序所必需的程序，雖然少數(shù)凋亡不需要凋亡酶參與。細(xì)胞凋亡酶激活涉及到一系列激活/抑制因子的調(diào)控，在細(xì)胞受到不同的凋亡刺激時(shí)，細(xì)胞凋亡酶按不同通路被激活。目前已發(fā)現(xiàn)的激活通路主要包括死亡受體通路（外通路）、線粒體通路（內(nèi)通路）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路[30]（圖2）。

2.1 死亡受體通路

死亡受體通路主要涉及腫瘤壞死因子受體和接頭蛋白。腫瘤壞死因子受體以三聚體形式存在于細(xì)胞表面，具有一個(gè)胞外的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，一個(gè)單次跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)膜內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域（death domain，DD）。接頭蛋白一端為DD，另一端為死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（death effector domain，DED）。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激后，腫瘤壞死因子受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與配體結(jié)合，并發(fā)生構(gòu)象變化，引起其死亡結(jié)構(gòu)域與接頭蛋白的死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合。接頭蛋白另一端 DED募集凋亡啟動(dòng)酶-8和-10的前體，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體，凋亡啟動(dòng)酶-8和-10的酶原前體互相靠近，發(fā)生自我切割而得以活化?；罨蟮牡蛲鰡?dòng)酶-8和-10進(jìn)一步激活下游的凋亡效應(yīng)酶-3、-6和-7，并由凋亡效應(yīng)酶切割特定底物而完成細(xì)胞凋亡過程。

2.2 線粒體通路

線粒體通路通常在細(xì)胞內(nèi)部損傷或應(yīng)激條件下激活。細(xì)胞收到凋亡信號后，在Bcl家族蛋白的調(diào)控下，線粒體中細(xì)胞色素c（cytochrome c，Cyt-c）、第二線粒體來源細(xì)胞凋亡酶激活因子（second mitochondriaderived activator of caspase，SMAC）、凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF）和核酸內(nèi)切酶 G（endonuclease G，Endo G）等凋亡因子被釋放，釋放至細(xì)胞質(zhì)中的 Cyt-c與凋亡蛋白酶激活因子-1（apoptotic protease activating factors 1，Apaf-1）結(jié)合。Apaf-l有一個(gè)CARD（caspase recruitment domain）結(jié)構(gòu)域，一個(gè)核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和多個(gè)WD40結(jié)構(gòu)域。生理?xiàng)l件下，1個(gè)CARD結(jié)構(gòu)域和2個(gè)WD40結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而釋放至細(xì)胞質(zhì)中的Cyt-c由于CARD與WD40結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而釋放出Apaf-1的CARD結(jié)構(gòu)域。在ATP/dATP存在下，Apaf-1進(jìn)一步寡聚化，形成七聚體復(fù)合物，即凋亡小體，進(jìn)而CARD結(jié)構(gòu)域被暴露在外，與凋亡啟動(dòng)酶-9酶原前體的CARD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使凋亡啟動(dòng)酶-9前體相互靠近，發(fā)生自我切割而活化。活化后的凋亡啟動(dòng)酶-9激活下游的凋亡效應(yīng)酶-3、-6和-7，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。除 Cyt-c外，線粒體釋放出的SMAC可競爭性結(jié)合細(xì)胞中存在的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP），從而起到對細(xì)胞凋亡酶的抑制作用；而AIF和Endo G可不依賴細(xì)胞凋亡酶，直接作用于細(xì)胞核，導(dǎo)致染色體皺縮和DNA碎片化，這也說明存在獨(dú)立于細(xì)胞凋亡酶活化的另一條凋亡通路。

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路是指內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到長時(shí)間刺激或刺激強(qiáng)度過大時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)大量錯(cuò)誤蛋白或未折疊蛋白急劇增加，超過細(xì)胞生存途徑所能處理的范圍，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的穩(wěn)態(tài)遭到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡酶-12在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中具有核心作用，目前關(guān)于細(xì)胞凋亡酶-12的激活還不確定，主要存在兩種方式：一是Ⅰ型跨膜糖蛋白激酶通過受體分子TRAF2與細(xì)胞凋亡酶-12酶原反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡酶-12酶原從TRAF2上被釋放，然后經(jīng)同源二聚化和自動(dòng)加工過程而激活[31]；二是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程釋放的鈣離子，激活鈣激活酶，裂解細(xì)胞凋亡酶-12的CARD前肽區(qū)域，細(xì)胞凋亡酶-12合成的p30亞基被自動(dòng)加工成活躍的p20和p10亞基。激活后的細(xì)胞凋亡酶-12進(jìn)一步激活凋亡效應(yīng)酶3，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。

3 線粒體通路是宰后細(xì)胞凋亡酶激活的重要路徑

動(dòng)物被屠宰后，由于氧供應(yīng)的終止，肌細(xì)胞很快處于無氧環(huán)境。在這種條件下，肌細(xì)胞可能以線粒體通路來進(jìn)行凋亡[32]。相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果也表明，宰后肌肉中細(xì)胞凋亡酶-9早于細(xì)胞凋亡酶-3激活，且兩者之間具有相關(guān)性[33]。HUANG等[34]在宰后牛肉中發(fā)現(xiàn)線粒體中的Cyt-c可被釋放至胞漿中，并認(rèn)為Bax可能是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子。WANG等[35]在宰后牦牛肉中檢測到線粒體活性氧大量累積、膜電位下降、MPTP開放、Cyt-c釋放、細(xì)胞凋亡酶激活等線粒體通路的典型特征。R?NNING等[36]利用原代牛骨骼肌細(xì)胞缺氧模型也檢測到了線粒體膜電位的下降和Cyt-c的釋放。這些結(jié)果均說明線粒體通路是宰后肌肉細(xì)胞凋亡酶的一條重要激活路徑。

3.1 宰后肌肉線粒體凋亡因子的釋放

線粒體是細(xì)胞凋亡的決策者和執(zhí)行者，線粒體內(nèi)Cyt-c、SMAC等凋亡因子的釋放是線粒體通路凋亡的核心程序，其釋放機(jī)理一直是凋亡研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[37]。線粒體具有典型的脂質(zhì)雙分子膜結(jié)構(gòu)（圖3），包括外膜（OM）和內(nèi)膜（IM），線粒體內(nèi)膜中平行于外膜的部分稱為內(nèi)邊界膜（IBM）；向線粒體基質(zhì)折疊形成大小和形狀各異的凹陷結(jié)構(gòu)稱為嵴（Cristae），內(nèi)邊界膜與嵴的連接處是一種狹窄的頸狀結(jié)構(gòu)，稱為嵴連接點(diǎn)（Crista junctions）[38]。早期研究主要認(rèn)為線粒體膜通透化是引起線粒體凋亡因子釋放的主要原因，主要受Bcl家族蛋白調(diào)控。在線粒體膜結(jié)構(gòu)中存在由腺苷轉(zhuǎn)移酶（ANT）、電壓依賴性陰離子通道（voltage dependent anion channel，VDAC）和親環(huán)素D共同組成的線粒體通透性膜通透轉(zhuǎn)運(yùn)孔，生理情況下MPTP僅允許相對分子質(zhì)量小于1.5×103的分子通過，維持線粒體膜內(nèi)外的電位差。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激后，Bcl蛋白家族中的促凋亡成員引發(fā)死亡效應(yīng)物Bax/Bak的寡聚化，形成寡聚復(fù)合物并轉(zhuǎn)移至線粒體外膜，從而引起MPTP開放和線粒體膜電位下降并釋放凋亡因子[39]。WANG 等[35]利用環(huán)孢菌素 A（形成MPTP的抑制劑）原位處理宰后牦牛肉后發(fā)現(xiàn)，MPTP的開放是造成線粒體膜電位下降和Cyt-c釋放的原因，并可通過激活細(xì)胞凋亡酶而改善宰后嫩度。

近期的研究表明，線粒體凋亡因子釋放時(shí)，其內(nèi)膜中的嵴結(jié)構(gòu)會發(fā)生明顯變化，主要包括嵴的數(shù)量和形狀的改變[40]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)85%的Cyt-c存在于線粒體嵴結(jié)構(gòu)上，如果外膜通透化直接釋放 Cyt-c，Cyt-c應(yīng)該可自由通過嵴結(jié)構(gòu)，大量 Cyt-c不可能穩(wěn)定存在嵴結(jié)構(gòu)上[38]。因此，線粒體凋亡因子釋放除外膜通透化外，還需要線粒體嵴的重構(gòu)（嵴形態(tài)變化、嵴連接點(diǎn)擴(kuò)大等），打開嵴內(nèi)部和膜間隙的通道。視神經(jīng)萎縮蛋白1（optic atrophy1，OPA1）、MICOS復(fù)合體等是調(diào)控細(xì)胞線粒體嵴重構(gòu)的關(guān)鍵因子[41]。另外，線粒體作為高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，其外部形態(tài)也會發(fā)生改變，可從管狀向顆粒狀轉(zhuǎn)變，這種顆粒狀結(jié)構(gòu)主要是由線粒體的分裂大于融合所造成[42]。

3.2 宰后肌肉線粒體損傷及對嫩度的調(diào)控

動(dòng)物剛被屠宰放血后，由于氧和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)的終止，細(xì)胞內(nèi)的氧化/抗氧化平衡體系被打破，ROS大量累積，必然造成肌細(xì)胞的損傷[20]。線粒體作為細(xì)胞“能量工廠”是ROS產(chǎn)生的主要場所，同時(shí)也是最易受ROS攻擊的細(xì)胞器。宰后肌肉線粒體會逐漸發(fā)生氧化損傷，隨著宰后時(shí)間延長，線粒體損傷水平逐漸提升，而嫩度逐步改善，兩者之間具有顯著相關(guān)性[35]。同時(shí)不同嫩度牛肉的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)也發(fā)現(xiàn)，嫩度較好的肉具有更高的損傷水平[43]。宰后肌肉中線粒體酶（異檸檬酸脫氫酶）活性也與嫩度之間具有極顯著相關(guān)性[44]。因此，宰后肌肉線粒體會發(fā)生損傷，并可參與宰后肌肉嫩化的調(diào)控過程。

線粒體對宰后嫩化過程的調(diào)控機(jī)理可能涉及兩個(gè)方面：（1）宰后早期肌肉中的線粒體仍具有一定的活性，可通過能量代謝影響肌肉 pH的變化，從而調(diào)控宰后嫩化過程。MATARNEH等[45]研究發(fā)現(xiàn)，離體條件下線粒體可通過增強(qiáng)糖酵解通量、加速ATP水解，而加快pH的下降。該團(tuán)隊(duì)的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)F1-ATP合成酶（F1-ATPase）是線粒體發(fā)揮這一功能的主要作用者[46]。SCHEFFLER等[47]研究發(fā)現(xiàn)，線粒體復(fù)合物I、IV、V的抑制劑對宰后牛肉線粒體處理可加速能量代謝和pH下降。這些結(jié)果均支持線粒體通過能量代謝影響宰后嫩化過程。（2）除能量代謝外，線粒體在凋亡過程中也發(fā)揮重要作用，也可以通過釋放系列凋亡因子，調(diào)控細(xì)胞凋亡酶活性，從而影響宰后嫩化過程。許多研究已表明宰后線粒體途徑的凋亡可調(diào)控細(xì)胞凋亡酶活性和其對肌原纖維蛋白的水解，從而影響宰后嫩度變化。

3.3 宰后肌肉線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間可能的相互作用

線粒體在細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和信號擴(kuò)大過程中發(fā)揮重要作用。凋亡過程中線粒體中的鈣離子濃度會升高，過量鈣離子攝入（鈣超載）會導(dǎo)致線粒體發(fā)生腫脹、膜電勢降低，繼而觸發(fā)凋亡。近年來，凋亡過程中線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的互作也廣受關(guān)注，這種互作可能調(diào)控線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間 Ca2+信號傳導(dǎo)以及細(xì)胞凋亡過程。LIU等[48]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在兔肉骨骼肌中檢測到線粒體和肌漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的交聯(lián)，并發(fā)現(xiàn)VDAC1、VDAC2和VDAC3可能參與了線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)交聯(lián)體的形成。WANG等[35]發(fā)現(xiàn)宰后肌細(xì)胞的鈣超載影響MPTP的開放及細(xì)胞凋亡過程。HUANG等[49]研究也表明，除鈣激活酶外，鈣離子也可調(diào)控細(xì)胞凋亡酶活性而影響宰后嫩化過程。鑒于鈣離子在宰后肌細(xì)胞凋亡和嫩化過程中的重要作用，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞內(nèi)儲存鈣離子的主要場所，也可能通過調(diào)控鈣離子釋放，從而與線粒體發(fā)生交互作用。電鏡結(jié)構(gòu)下可觀察到線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間存在偶聯(lián)結(jié)構(gòu)，并可分離純化出偶聯(lián)結(jié)構(gòu)的蛋白復(fù)合體 MAMs（mitohcondria associated membrane）[50]。宰后凋亡過程中，MAMs上的 IP3R等鈣離子調(diào)控蛋白可能介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上鈣離子的釋放，鈣離子被線粒體攝入超載后，加速線粒體途徑凋亡過程的發(fā)生，而凋亡發(fā)生后 Cyt-c釋放入胞漿，通過與 IP3R結(jié)合并促進(jìn)其功能，導(dǎo)致更多的鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體傳遞，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間通過鈣離子相互促進(jìn)，逐步放大凋亡信號。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體間除通過鈣離子發(fā)生交互作用外，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與了線粒體分離，從而導(dǎo)致凋亡發(fā)生。當(dāng)線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)偶聯(lián)形成后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)“纏繞”線粒體促使局部收縮，并逐步“募集”線粒體分裂相關(guān)蛋白Drp1/Dnm1等，最后將線粒體分裂為二[51]。目前，宰后肌細(xì)胞中線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是否發(fā)生交互及其相關(guān)機(jī)理的研究還未見相關(guān)報(bào)道。

3.4 宰后肌肉線粒體與溶酶體間可能的相互作用

線粒體損傷后其“產(chǎn)能”功能也逐漸喪失，從有氧呼吸到無氧酵解，不光造成ATP下降，同時(shí)還調(diào)控pH的變化。而pH的下降被認(rèn)為可以破壞溶酶體膜，使組織蛋白酶得以釋放，從而參與嫩化過程[52]。因此，線粒體與溶酶體之間也可能存在交互作用。ZHANG等[53]調(diào)查了宰后牛肉溶酶體和線粒體間相互作用，發(fā)現(xiàn)線粒體ROS可以通過累積氧化還原活性的鐵離子來破壞溶酶體膜的穩(wěn)定性，同時(shí)溶酶體釋放出的組織蛋白酶可以通過激活線粒體Bax和Bid而加速線粒體膜通透性。

4 細(xì)胞凋亡酶對宰后肌肉嫩化的作用

宰后肌肉嫩化是一個(gè)復(fù)雜的生化過程，涉及到內(nèi)源酶作用下的細(xì)胞骨架及相關(guān)蛋白的有限降解。宰后肌細(xì)胞以凋亡的形式死亡，細(xì)胞凋亡酶被激活，這為其參與宰后嫩化過程提供了前提基礎(chǔ)。但細(xì)胞凋亡酶是否貢獻(xiàn)于宰后肌肉嫩化過程還要從其是否參與嫩度相關(guān)蛋白的降解來分析。目前有關(guān)細(xì)胞凋亡酶對宰后肌肉嫩化的相關(guān)研究，可歸納為以下幾個(gè)方面：

4.1 宰后細(xì)胞凋亡酶及相關(guān)調(diào)控因子與嫩度間的相關(guān)性

相關(guān)性分析是統(tǒng)計(jì)學(xué)中的一種重要分析方法。如果一種酶或其相關(guān)因子與宰后嫩度的變化存在顯著相關(guān)性，則可以從側(cè)面反映出這種酶類參與肌肉的宰后成熟過程。宰后細(xì)胞凋亡酶活性及相關(guān)調(diào)控因子與嫩度間的相關(guān)性被廣泛研究。KEMP等[54]發(fā)現(xiàn)宰后豬肉的細(xì)胞凋亡酶-3和-7的活性在宰后2 h達(dá)到最高，32 h后其活性快速下降，且其宰后0 h和32 h的活性比與嫩度間存在顯著相關(guān)性。CAO等[33]在宰后牛肉中也檢測到細(xì)胞凋亡酶活性和剪切力之間存在顯著負(fù)相關(guān)。ZHANG等[55]在宰后鴨肉中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡酶活性變化與肌原纖維小片化指數(shù)（myofibrillar fragmentation index，MFI）顯著正相關(guān)，而與剪切力值顯著負(fù)相關(guān)。BERNARD等[56]的研究結(jié)果也表明抑凋亡因子熱收縮蛋白（heat shock protein，HSP）的基因表達(dá)與嫩度之間相關(guān)性極為顯著。這些結(jié)果表明細(xì)胞凋亡酶與宰后肌肉嫩度之間顯著相關(guān)，可參與宰后肌肉嫩化過程。然而，也有學(xué)者研究認(rèn)為牛肉中細(xì)胞凋亡酶-3的活性逐漸下降，但與剪切力之間無顯著相關(guān)性。這些結(jié)果之間的不一致性可能與測定方法或不同物種之間的差異有關(guān)，畢竟不同動(dòng)物對宰后應(yīng)激條件具有不同的應(yīng)答能力。

4.2 不同嫩度模型下細(xì)胞凋亡酶及相關(guān)因子變化

比較不同嫩度肌肉模型（不同部位、嫩化加速或抑制）下內(nèi)源酶及相關(guān)因子的變化差異也是肉品領(lǐng)域研究的常用手段。宰后不同嫩度的背最長肌、腰大肌和半腱肌三部位豬肉，雖然mRNA豐度無區(qū)別，但具有不同的細(xì)胞凋亡酶3/7表達(dá)量和活性變化[15]。不同嫩度的相同部位肉也具有不同的細(xì)胞凋亡酶及相關(guān)調(diào)控因子表達(dá)，如 LAVILLE等[57]發(fā)現(xiàn)宰后嫩度較好的牛肉具有更高的線粒體內(nèi)外膜蛋白表達(dá)量。采用不同的方法加速或抑制宰后嫩化過程后，其細(xì)胞凋亡酶及相關(guān)調(diào)控因子也發(fā)生對應(yīng)的變化。如采用鈣離子注射肌肉加速嫩化過程后，除鈣激活酶加速激活外，細(xì)胞凋亡酶的活性及表達(dá)量、細(xì)胞色素c等凋亡激活因子的表達(dá)量也顯著提高，而采用鋅離子注射得到相反的結(jié)果[49]。CHEN等[58]利用低頻和高頻超聲處理改善雞肉嫩度時(shí)，發(fā)現(xiàn)包括細(xì)胞凋亡酶加速激活、α-spectrin被凋亡酶降解生成 120 kD特征片段等凋亡級聯(lián)反應(yīng)事件。這些結(jié)果說明細(xì)胞凋亡酶參與了宰后肌肉嫩化過程，改善嫩度。

4.3 細(xì)胞凋亡酶抑制/誘導(dǎo)劑對宰后肌肉肌原纖維蛋白原位降解的影響

肌原纖維蛋白的有限降解是肌肉宰后嫩度改善的主要原因，利用內(nèi)源酶的專一性抑制劑或誘導(dǎo)劑對宰后肌肉注射/浸泡處理，并分析其對肌原纖維降解的影響是探討肌肉凋亡酶是否參與宰后嫩化過程的有力證據(jù)。HUANG等[59]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡酶-3專一性抑制劑DEVD-CHO可明顯抑制雞肉伴肌球蛋白、伴肌動(dòng)蛋白、肌間線蛋白的降解和肌鈣蛋白-T 28—30 kD特征降解產(chǎn)物的生成，同時(shí)該抑制劑對鈣激活酶的活性無顯著影響。隨后HUANG等[60]利用細(xì)胞凋亡酶-6的專一性抑制劑 VEID-CHO處理雞胸肉也得到相似的結(jié)果，并揭示出該抑制劑在宰后早期能抑制肌纖維結(jié)構(gòu)的弱化。CHEN等[16]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑喜樹堿和依托泊苷可加速宰后肌肉中細(xì)胞凋亡酶-3和-7的激活，提高肌鈣蛋白-T嫩度特征降解產(chǎn)物28—30 kD片段的含量，并加速肌纖維結(jié)構(gòu)中A帶和I帶的弱化。這些結(jié)果說明，細(xì)胞凋亡酶的抑制劑或誘導(dǎo)劑可以影響肌原纖維蛋白的降解和肌纖維結(jié)構(gòu)的變化，原位模型下揭示了細(xì)胞凋亡酶參與宰后肌肉嫩化過程。

4.4 細(xì)胞凋亡酶對宰后肌肉肌原纖維蛋白的體外降解

判斷一種肌肉內(nèi)源酶是否參與宰后嫩化過程的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)，就是該酶在體外最佳條件下能否模擬自然成熟條件下肌原纖維蛋白的降解變化。體外降解模型可排除肌肉內(nèi)一系列內(nèi)源酶和各種激活/抑制因子的干擾作用，在宰后肌肉嫩化領(lǐng)域被廣泛使用。KEMP等[61]利用活性細(xì)胞凋亡酶-3體外孵育豬肉肌原纖維蛋白，利用MALDI-TOF（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight）質(zhì)譜檢測到肌球蛋白輕鏈、肌鈣蛋白-T和肌動(dòng)蛋白分別降解生成18、28和32 kD的產(chǎn)物，并通過Western發(fā)現(xiàn)該酶引起肌間線蛋白降解。HUANG等[62]利用活性細(xì)胞凋亡酶-3體外孵育雞肉肌原纖維蛋白，發(fā)現(xiàn)該酶能降解伴肌球蛋白和伴肌動(dòng)蛋白，且降解變化與自然成熟過程相似，但不能導(dǎo)致肌間線蛋白降解，也不能使肌鈣蛋白-T降解生成28—30 kD的降解產(chǎn)物。MOHRHAUSER等[63]用重組細(xì)胞凋亡酶-3體外降解牛肉肌原纖維蛋白，但沒檢測到伴肌球蛋白、伴肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白的任何降解產(chǎn)物。HUANG等[64]比較了離體條件下細(xì)胞凋亡酶-3、-6對牛肉肌原纖維蛋白降解，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡酶-3可模擬伴肌球蛋白和伴肌動(dòng)蛋白降解，不能降解肌間線蛋白，而凋亡效應(yīng)酶6能夠模擬肌間線蛋白部分降解產(chǎn)物。

綜上分析，細(xì)胞凋亡酶主要在宰后早期被激活，可參與宰后嫩化過程中部分肌原纖維蛋白的有限降解，但隨著宰后時(shí)間延長，可能由于ATP的耗盡或其他因子作用導(dǎo)致細(xì)胞凋亡酶失活，從而使其只參與宰后早期的嫩化過程。因此，細(xì)胞凋亡酶和肉中其他內(nèi)源酶一起參與蛋白質(zhì)降解，改善嫩度，宰后嫩化是多種內(nèi)源酶協(xié)同作用的結(jié)果。

5 結(jié)論與展望

宰后細(xì)胞死亡和肌肉嫩化是兩個(gè)高度相關(guān)的過程，在宰后肌肉嫩化的同時(shí)，伴隨著肌細(xì)胞的逐漸死亡，兩個(gè)生化過程最終都是通過內(nèi)源酶對蛋白質(zhì)的降解來完成。宰后僵直前期，肌細(xì)胞可能在生（自噬）與死（凋亡）之間選擇，早期細(xì)胞以自噬方式進(jìn)行自我保護(hù)，但隨著ROS對細(xì)胞的損傷及ATP含量降低，最終細(xì)胞選擇以凋亡的形式死亡，凋亡過程可能持續(xù)至整個(gè)僵直期和成熟早期。隨著成熟時(shí)間的延長，除細(xì)胞凋亡外，壞死也可能參與其中，宰后肌細(xì)胞可能以多種死亡方式并存的狀態(tài)完成死亡程序，死亡方式間的轉(zhuǎn)化可能受細(xì)胞內(nèi)能量變化和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放狀態(tài)所調(diào)控。未來宰后嫩化機(jī)制的研究可以在已發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源酶有限降解肌原纖維蛋白的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從內(nèi)源酶激活通路及各通路間的相互銜接方面，構(gòu)建宰后肌肉嫩化的生化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以便對宰后肌肉嫩度進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)控。