森林草莓FveD27的表達特性和功能

孫洪影，王巖，李偉佳，2，朱天姝，姜穎，許妍，吳清悅，張志宏?

1沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/遼寧省草莓育種與優(yōu)質(zhì)栽培重點實驗室，沈陽 110866；2山西大同大學(xué)炭材料研究所，山西大同 037009

0 引言

【研究意義】植物株型對植物的生長發(fā)育起著十分重要的作用，其主要受遺傳、植物內(nèi)源激素以及溫度、光周期、營養(yǎng)條件等內(nèi)外因素共同調(diào)控，其中植物激素在株型的調(diào)節(jié)機制中具有決定性地位[1]。分枝發(fā)育不僅是決定植物株型的關(guān)鍵因素，還能影響其產(chǎn)量[2]。獨腳金內(nèi)酯（strigolactone，SL）是近年來在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的調(diào)控植株生長發(fā)育和形態(tài)建成的一類新型激素，具有抑制植物分枝的顯著功能[3-5]?？寺¤b定草莓SL生物合成途徑中的關(guān)鍵基因DWARF27（D27）并闡明其生物學(xué)功能，探究FveD27在草莓分枝等生長發(fā)育過程中的作用，為提高草莓產(chǎn)量提供理論基礎(chǔ)。【前人研究進展】SL是一種以類胡蘿卜素為前體合成的特異性小分子萜類化合物，D27編碼全反式-β-類胡蘿卜素異構(gòu)酶，該酶處于SL生物合成的上游[6-8]。D27的功能最早在水稻中被發(fā)現(xiàn)，通過對d27突變體的深入研究，發(fā)現(xiàn)D27具有抑制水稻分蘗的作用[9-10]。之后研究人員在擬南芥中利用反向遺傳學(xué)、外源 GR24（一種以 SL為框架的人工合成物質(zhì)）以及嫁接試驗證實AtD27是抑制次生芽生長所必需的[11]。此外，菊花中克隆出D27的同源基因DgD27，該基因在擬南芥的異位表達降低分枝數(shù)并使突變體d27恢復(fù)至野生型表型，表明菊花DgD27對枝條分枝的調(diào)控效果[12]。小麥中也分離出TaD27，并且TaD27-7B在擬南芥的異位表達可以恢復(fù)擬南芥d27突變體的表型，說明在小麥中TaD27的功能與AtD27相近[13]。國內(nèi)外學(xué)者還分別對苜蓿、森林草莓、甘蔗以及青天葵中D27的同源基因進行克隆分析，但并未揭示其生物學(xué)功能[14-17]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關(guān)于 SL合成及信號傳導(dǎo)基因的研究主要集中在擬南芥、水稻等模式植物，在草莓上的研究鮮有報道[2,15,18]。筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，無匍匐莖的森林草莓資源‘Yellow Wonder’的匍匐莖發(fā)生突變體（srp）的新莖數(shù)量減少，F(xiàn)veD27表達水平顯著上調(diào)[19]。此外，外源施用 5 μmol·L-1的GR24可顯著抑制森林草莓新莖分枝數(shù)量（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）。因此，推測FveD27具有調(diào)控草莓新莖發(fā)生的功能?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從森林草莓中克隆FveD27，通過在森林草莓中過表達FveD27來明確其生物學(xué)功能。

1 材料與方法

試驗于2016年10月至2020年9月在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/遼寧省草莓育種與優(yōu)質(zhì)栽培重點實驗室，以及沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研試驗基地日光溫室完成。

1.1 植物材料

森林草莓（Fragariavesca）資源‘Yellow Wonder’（YW）用于基因克隆、基因表達分析和穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化，‘Ruegen’（RG）用于 GUS組織活性試驗分析。

本氏煙草（Nicotianabenthamiana）用于基因亞細胞定位。

1.2 植物核酸的提取

草莓基因組DNA以及草莓不同器官中的總RNA提取方法參照改良版的CTAB法[20]。

1.3 引物設(shè)計與合成

參考NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中FveD27序列設(shè)計基因全長克隆、實時熒光定量PCR與亞細胞定位所需引物；利用薔薇科基因組數(shù)據(jù)庫（https://www.rosaceae.org/）獲得FveD27啟動子的參考序列設(shè)計啟動子克隆引物，引物設(shè)計采用Primer 5.0軟件，并交由金唯智生物科技有限公司（蘇州）合成。引物信息見表1。

1.4 基因編碼區(qū)擴增

使用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒將森林草莓 YW 幼葉提取的總 RNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，以cDNA為模板通過PCR擴增FveD27編碼區(qū)，反應(yīng)體系為 20 μL：cDNA 0.5 μL、上下游引物（FveD27-F/R）各 0.5 μL、10×LA Buffer 2 μL、dNTP 1.6 μL、LA Taq Buffer（Mg2+）0.2 μL、ddH2O 14.7 μL。反應(yīng)程序為：95℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，32個循環(huán)；72℃ 7 min。將電泳檢測正確的產(chǎn)物回收純化，并連接pMD18-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans 5α，篩選陽性克隆并測序，將序列比對正確的載體命名pMD-T-FveD27。

1.5 生物信息學(xué)分析

用蛋白質(zhì)系統(tǒng)分析工具（http://web.expasy.org/protparam/）分析FveD27的理化參數(shù)；TMHMM跨膜分析在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測 FveD27蛋白跨膜情況，參考 NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），查找不同物種中FveD27的同源基因，用DNAMAN 6.0軟件對其氨基酸序列進行對比分析；并用MEGA 6.0軟件完成系統(tǒng)進化樹的繪制。

1.6 亞細胞定位

通過Plant-mPLoc軟件（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）在線預(yù)測森林草莓FveD27的亞細胞定位。以重組質(zhì)粒 pMD-T-FveD27為模板，用FveD27(eGFP)-F/R引物（表1）克隆獲得去除終止子的FveD27目的片段，與雙元表達載體pRI101-AN-eGFP連接獲得融合表達載體pRI101-FveD27-eGFP。參照凍融法[21]將質(zhì)粒 pRI101-AN-eGFP（對照）和 pRI101-FveD27-eGFP分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。利用注射法[22]進行煙草葉片瞬時表達，之后應(yīng)用TCS SP8激光共聚焦顯微鏡（Leica，德國）檢測煙草葉片中綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況。

1.7 基因表達分析

以轉(zhuǎn)錄水平穩(wěn)定性較好的森林草莓26S為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR分析FveD27在森林草莓‘YW’不同組織（成熟葉、幼葉、葉柄、莖尖和根）中以及野生型與過表達轉(zhuǎn)基因植株中的表達水平。本試驗采用SYBR Green熒光染料法，反應(yīng)體系為10 μL：5 μL SYBR Green mix、引物（FveD27-DL-F/R 與Fve-26S-F/R）各 0.5 μL、cDNA 0.5 μL、RNase-free H2O 3.5 μL。使用QuantStudioTM6Flex熒光定量儀（Applied Biosystems，美國），qRT-PCR反應(yīng)設(shè)置程序為二步法：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，40 個循環(huán)；60℃ 1 min，95℃ 15 s。參考 2-ΔΔCT法[23]對PCR結(jié)果進行分析，每個樣品進行3次生物學(xué)重復(fù)與3次技術(shù)重復(fù)。

1.8 啟動子克隆與分析

以森林草莓‘YW’幼葉DNA為模板，proFveD27-F/R為引物（表1），進行FveD27啟動子序列的克隆。將PCR產(chǎn)物純化與pMD18-T構(gòu)成重組質(zhì)粒并測序。將測序成功的陽性克隆重組質(zhì)粒命名pMD-T-proFveD27。利用 PlantCARE軟件對克隆得到的FveD27啟動子順式作用元件進行在線預(yù)測分析。

表1 本試驗所用引物Table 1 Primers used in this study

1.9 FveD27啟動子與GUS融合載體及FveD27過表達載體的構(gòu)建

利用限制性內(nèi)切酶PstⅠ與XbaⅠ對 pMD-T-proFveD27以及雙元表達載體 pRI201-AN-GUS同時進行雙酶切，之后再利用T4 DNA連接酶連接載體與目的片段，使FveD27啟動子替換雙元 pRI201-ANGUS中 CaMV35S啟動子序列，得到植物融合載體pFveD27::GUS。

使用限制性內(nèi)切酶SmaⅠ與KpnⅠ，對 pMD-TFveD27以及空載pRI101-AN同時進行雙酶切，之后利用T4 DNA連接酶將兩者進行連接得到過表達載體pRI101-FveD27。

1.10 草莓遺傳轉(zhuǎn)化

將pFveD27::GUS與pRI101-FveD27植物表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 GV3101中用于森林草莓的遺傳轉(zhuǎn)化。森林草莓葉片遺傳轉(zhuǎn)化方法采用葉盤法[24]。經(jīng)農(nóng)桿菌浸染后，外植體經(jīng)共培養(yǎng)、推遲培養(yǎng)、卡那霉素（Kan）抗性選擇培養(yǎng)3個階段獲得再生抗性芽。待抗性芽長成單株，進行轉(zhuǎn)化植株葉片的Kan抗性試驗以及DNA目的片段擴增的陽性植株篩選[25]。

1.11 GUS組織化學(xué)染色

將野生型與 pRI201-FveD27-GUS轉(zhuǎn)基因陽性植株不同組織浸入 GUS染液（磷酸鈉緩沖溶液、K3[Fe(CN)6]溶液、K4[Fe(CN)6]溶液、Na2EDTA、Triton-100溶液、蒸餾水以及現(xiàn)用現(xiàn)加X-Gluc），用錫箔紙做好避光處理，37℃黑暗條件下染色12—16 h，然后加入無水乙醇進行脫色反應(yīng)，利用體視顯微鏡（OLYMPUS，日本）觀察試材的染色情況[26]。

1.12 轉(zhuǎn)基因植株的表型觀察與分析

轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓暌圃缘缴蜿栟r(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研試驗基地日光溫室，培養(yǎng)條件為白天20—25℃，夜間12—15℃，相對濕度60%—70%，基質(zhì)栽培配比是珍珠巖、蛭石、蚯蚓糞與草炭為 1∶2∶2∶4。選長勢健壯的轉(zhuǎn)基因和對照植株各10株，統(tǒng)一編號后用直尺、電子游標(biāo)卡尺等工具進行植物學(xué)性狀調(diào)查。調(diào)查指標(biāo)：株高、冠徑、新莖分枝數(shù)、葉片數(shù)、葉柄直徑、花序數(shù)等[27]。

1.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

運用DPS 9.5軟件中的Duncan算法對植物學(xué)性狀調(diào)查部分數(shù)據(jù)進行差異性分析。

2 結(jié)果

2.1 FveD27的克隆及生物信息學(xué)分析

以FveD27-F/R為引物通過RT-PCR擴增出長度為789 bp的FveD27編碼區(qū)序列（圖1-A），編碼262個氨基酸。擴增序列與突變體srp轉(zhuǎn)錄組測序拼接的FveD27序列[19]長度一致（圖2），但是比NCBI中森林草莓‘Hawaii 4’的FveD27（XM_011460303.1）編碼區(qū)少3個堿基。預(yù)測的FveD27編碼蛋白的分子量和理論等電點分別為29.45 kD和8.35 kD；包含20種氨基酸，正電氨基酸32個，負電氨基酸29個；不穩(wěn)定性指數(shù)為49.90，屬不穩(wěn)定蛋白，且親水性平均系數(shù)（GRAVY）為-0.257，屬親水蛋白。TMHMM在線網(wǎng)站分析結(jié)果表明FveD27不屬于跨膜蛋白。FveD27與其他植物D27相似，具有保守的‘DUF4033’結(jié)構(gòu)域（圖 3-A，3-B黑框內(nèi)），該結(jié)構(gòu)域家族存在于細菌和真核生物中，但其功能尚未明確。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析結(jié)果（圖4）表明，F(xiàn)veD27與薔薇科蘋果中MdD27蛋白的親緣關(guān)系最近，而與擬南芥中AtD27蛋白的親緣關(guān)系較遠。

2.2 FveD27亞細胞定位

Plant-mPLoc軟件在線預(yù)測結(jié)果表明FveD27定位在葉綠體。為驗證該結(jié)果，本研究在本氏煙草葉表皮細胞中進行 FveD27的瞬時表達分析。結(jié)果如圖 5，pRI101-AN-eGFP空載侵染的煙草細胞中，綠色熒光蛋白均勻分布在細胞核、細胞膜以及細胞質(zhì)（圖 5-A—D），pRI101-FveD27-eGFP侵染的煙草細胞中，融合蛋白主要在葉綠體中表達（圖5-E—H），該結(jié)果與Plant-mPLoc軟件預(yù)測一致，表明FveD27定位于葉綠體。

2.3 FveD27表達特性

以森林草莓‘YW’的成熟葉、幼葉、葉柄、莖尖、根為試材，經(jīng)qRT-PCR定量分析不同組織器官中FveD27的表達水平。結(jié)果表明，F(xiàn)veD27在草莓不同組織器官中表達量有明顯差異，主要在幼葉與莖尖中表達，而在葉柄與成熟葉中表達量次之，在根中表達量最低（圖6）。

以森林草莓‘YW’的幼葉 DNA為模板，利用PCR擴增出長度為1 670 bp的FveD27啟動子序列（圖1-B），該序列不包括轉(zhuǎn)錄本中的5′UTR。為進一步探索FveD27啟動子在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機制，本研究采用PlantCARE在線數(shù)據(jù)庫對FveD27啟動子區(qū)域進行分析。結(jié)果顯示（表2）：FveD27啟動子序列中，除了含有大量的 TATA-box核心啟動元件、CAAT-box啟動子和增強子共同順式作用元件外，還包含了3大類順式作用元件：（1）光響應(yīng)元件；（2）環(huán)境脅迫響應(yīng)元件，涉及MYB、干旱以及缺氧、厭氧；（3）激素響應(yīng)元件，包括水楊酸、赤霉素與茉莉酸甲酯。因此，F(xiàn)veD27可能受到光信號、激素信號和逆境脅迫的調(diào)控，并參與草莓植株的生長發(fā)育。

表2 FveD27啟動子相關(guān)順式作用元件的預(yù)測Table 2 Prediction of cis-acting elements related to FveD27 promoter

為了進一步明確FveD27在草莓植株中的表達特性，將pRI201-FveD27-GUS載體進行森林草莓遺傳轉(zhuǎn)化，然后對野生型與轉(zhuǎn)基因試管苗植株進行GUS組織化學(xué)染色分析。與對照植株相比（圖7-A—D），轉(zhuǎn)基因植株的幼葉、芽等幼嫩部位（圖 7-F）藍色明顯，成熟葉（圖7-E）與葉柄（圖7-G）只有部分被染成藍色，而根部幾乎無顯色（圖7-H）。GUS染色結(jié)果與qRT-PCR（圖6）結(jié)果一致，表明FveD27在幼葉與莖尖中表達水平較高。

2.4 FveD27的功能分析

為了確定FveD27在森林草莓中的功能，本研究構(gòu)建了FveD27過表達載體并利用農(nóng)桿菌進行森林草莓的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得2個FveD27過表達轉(zhuǎn)基因株系。qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示，轉(zhuǎn)基因株系中FveD27表達量是非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑?6.6—52.2倍（圖8）。

為了揭示FveD27的生物學(xué)功能，將轉(zhuǎn)基因株系（T0代）和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓晖瑫r移栽并在溫室中培養(yǎng)。對移栽40 d（處于營養(yǎng)生長期）的野生型與轉(zhuǎn)基因植株進行植物學(xué)性狀調(diào)查（圖 9），結(jié)果顯示該時期的轉(zhuǎn)基因植株與對照植株相比，株高并無顯著差異，冠徑增加，第三葉面積增大，葉柄直徑加粗，葉片數(shù)減少，新莖分枝數(shù)減少。

為了進一步探究FveD27在草莓生殖生長階段的影響，對生殖初期的野生型與轉(zhuǎn)基因植株進行調(diào)查。如圖10所示，在株高上，野生型與轉(zhuǎn)基因植株兩者間依舊未表現(xiàn)出明顯不同，相比于對照，該階段的FveD27過表達株系冠徑減小，葉片數(shù)減少，新莖分枝數(shù)減少，并且轉(zhuǎn)基因株系的花序數(shù)量明顯增多。此外，對T1代轉(zhuǎn)基因植株的表型也進行了初步觀察，結(jié)果顯示T1代轉(zhuǎn)基因植株也表現(xiàn)出新莖分枝減少的表型（圖11）。

3 討論

3.1 FveD27抑制草莓分枝的可能機制

分枝發(fā)育是決定植物株型的一個主要因素，對于薔薇科果樹的植株結(jié)構(gòu)有著重要意義。關(guān)于D27抑制分蘗分枝的研究在水稻、擬南芥等模式植物中發(fā)現(xiàn)并驗證[9-11]。本研究中，F(xiàn)veD27過表達株系可以顯著抑制草莓新莖分枝數(shù)量，確定了該基因在高等植物中的功能保守，但其作用機制尚不清楚，為此，筆者希望在 SL抑制分枝研究結(jié)果中找到一些線索。一種為生長素極性運輸理論，當(dāng)D27過量表達后，相對減弱的生長素極性運輸導(dǎo)致根部分泌出大量SL，從而加強分蘗芽向外生長的抑制作用。然而 SL的生物合成需要受其內(nèi)、外部環(huán)境條件的協(xié)同作用，植物可能利用影響SL合成基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)SL的合成和分泌[28-29]。最新研究成果闡述了 SL影響生長素運輸通道相關(guān)過程，SL干擾生長素對PIN極性靶向，是創(chuàng)傷后維管系統(tǒng)再生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[30]。第二種為腋芽形成與生長機制，植物分枝分蘗的過程一般包括腋芽的形成以及生長兩個主要階段[31]，首先是腋芽在葉腋處形成，然后由腋芽直接或間接的生長形成分蘗或分枝，之間存在短時間的休眠期，并通過激素類物質(zhì)將其打破，推測該激素物質(zhì)主要是 SL，其協(xié)同生長素（抑制腋芽產(chǎn)生）、細胞分裂素（促進分枝）一起誘導(dǎo)休眠期腋芽成枝構(gòu)型[32-34]。近期，LUO等[35]在水培種植的水稻上使用高度空間分辨的原位雜交和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的組合在腋芽休眠過程中取得新進展，發(fā)現(xiàn) SL功能主要作用于腋芽的葉原基，并且脫落酸ABA參與SL介導(dǎo)的腋芽休眠，細胞分裂素CTK及ABA促進早期腋芽休眠，從而影響植物分枝；DUAN等[36]發(fā)現(xiàn)在水稻中SL能快速激活細胞分裂素氧化酶/脫氫酶 OsCKX9，即 SL通過OsCKX9調(diào)控CTK信號傳導(dǎo)通路，直接激活CTK分解代謝以調(diào)節(jié)水稻的分枝。上述研究進一步完善了多種激素協(xié)同調(diào)控分枝的網(wǎng)絡(luò)機制，這與FveD27啟動子作用元件分析結(jié)果相吻合（表 2），由此推測本研究中FveD27過表達株系間表型的差異性可能由相關(guān)激素間的互相作用與串?dāng)_引起，這一復(fù)雜關(guān)系網(wǎng)絡(luò)還需進行深入研究。

3.2 FveD27對開花的調(diào)控作用

目前為止，關(guān)于 SL的研究主要集中在植物的營養(yǎng)生長階段，比如：擬南芥或水稻中的下胚軸長度、根結(jié)構(gòu)、枝條分枝、莖伸長、葉形等形態(tài)發(fā)生與抗逆性中的作用[37-40]。然而，對 SL在植物生殖生長中的作用知之甚少。有研究表明，與腋芽形成相關(guān)的LBD蛋白家族，其主要表達在腋芽萌動、器官形成以及側(cè)生與頂端分生組織邊界形成等方面，擬南芥中LBD蛋白家族的ASL1調(diào)控莖和花序的發(fā)育，從而影響側(cè)生分生組織的生成[41-42]，這與FveD27過表達株系中生殖生長初期階段葉柄直徑增加、花序數(shù)增加等方面的表型相近，推測D27可能與腋芽形成有關(guān)的基因存在某種未知的聯(lián)系，在表型調(diào)查過程中還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)早花特性，轉(zhuǎn)基因#1與#2株系比對照的開花時間提前5—7 d。此外，WU等[18]確定SL相關(guān)基因在發(fā)育中的心皮和花柱中高表達，并參與森林草莓果實發(fā)育的早期階段，這些結(jié)果說明SL也作用于植物開花及果實發(fā)育等過程，為本研究提供了新的方向。

綜上所述，本研究表明了 SL生物合成基因FveD27不僅有抑制草莓新莖分枝的作用，而且還影響其花序數(shù)量。通過分析討論該基因抑制分枝的可能作用機制，以及結(jié)合當(dāng)前相關(guān)領(lǐng)域的最新研究結(jié)果，本研究找到了一條可能調(diào)控草莓株型，提高草莓產(chǎn)量的新思路，以期在接下來的試驗中展開深入研究。

4 結(jié)論

從森林草莓中克隆出編碼區(qū)為789 bp的FveD27序列，該基因在森林草莓的幼葉與莖尖等幼嫩部位表達量較高。FveD27定位在葉綠體。過表達FveD27的森林草莓轉(zhuǎn)基因株系表型揭示FveD27具有抑制新莖分枝的功能。