病毒誘導(dǎo)基因沉默在蔬菜作物上應(yīng)用的研究進(jìn)展

李杰，羅江宏，楊萍

紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南蒙自 661100

我國(guó)蔬菜產(chǎn)業(yè)經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，在產(chǎn)值、出口量等方面均位居農(nóng)作物首位，已成為中國(guó)農(nóng)民增收、加快農(nóng)村發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)，但仍然存在蔬菜品質(zhì)弱、產(chǎn)量低等問(wèn)題。目前急需挖掘與蔬菜作物重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的基因以培育優(yōu)異、抗病和具有特色的品種[1-2]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的蔬菜作物全基因組測(cè)序已完成，但對(duì)于單個(gè)基因的功能研究，還需要更有效和可靠的技術(shù)體系?；谥参锊《九c其宿主在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的共生關(guān)系，將外源基因通過(guò)病毒載體導(dǎo)入植物體內(nèi)，可為基因挖掘和基因功能研究提供技術(shù)支持[3]。病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）是利用RNA介導(dǎo)的植物天然抗病毒機(jī)制的一種技術(shù)，主要利用遺傳免疫方式系統(tǒng)性沉默某一特定基因，再經(jīng)過(guò)表型鑒定和基因表達(dá)來(lái)確定靶基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用及對(duì)環(huán)境變化產(chǎn)生的應(yīng)激響應(yīng)。用攜帶靶基因片段的病毒來(lái)侵染植物，植物的遺傳免疫系統(tǒng)被激活后，植物體內(nèi)與靶基因同源的RNA被特異性降解，從而發(fā)生基因沉默[4]。與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因、基因敲除、反義抑制等基因功能研究方法相比，VIGS技術(shù)試驗(yàn)周期短，不依賴轉(zhuǎn)基因操作，具有低成本、高通量等優(yōu)點(diǎn)[5]。近年來(lái)，VIGS技術(shù)的建立為蔬菜作物功能基因組學(xué)的研究提供了優(yōu)越的條件，在基因功能的研究中得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，從而促進(jìn)了我國(guó)蔬菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

本文根據(jù)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究的最新報(bào)道，重點(diǎn)對(duì)VIGS技術(shù)在蔬菜作物生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝、生物與非生物脅迫等幾個(gè)方面進(jìn)行綜述，分析VIGS技術(shù)存在的問(wèn)題及解決方法，以期為VIGS技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù)。

1 VIGS技術(shù)介紹

1.1 VIGS技術(shù)機(jī)制

VIGS是一種利用植物防御病毒入侵的自然機(jī)制來(lái)研究植物基因功能的基因轉(zhuǎn)錄抑制技術(shù)，屬于RNA干擾的一種。利用攜帶植物目的基因片段的病毒載體，通過(guò)有效的病毒侵染方式侵染植物，病毒載體在寄主體內(nèi)復(fù)制和表達(dá)時(shí)，在RNA聚合酶的作用下，產(chǎn)生雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA），dsRNA在細(xì)胞中被特異性核酸內(nèi)切酶切割產(chǎn)生21—25 nt的小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），siRNA能誘導(dǎo)與其具有同源性的植物內(nèi)源基因mRNA降解，可結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。一方面，RISC可以特異性地與細(xì)胞質(zhì)中的同源RNA相互作用，使同源RNA降解，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）[6]；另一方面，RISC特異性地與細(xì)胞核內(nèi)的同源DNA相互作用，使其被甲基化等修飾，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS）[7]。

1.2 VIGS的病毒載體及應(yīng)用

VIGS是目前應(yīng)用最廣泛的研究植物功能基因的工具之一[8]。根據(jù)已有的研究報(bào)道，有多種病毒載體（RNA病毒、DNA病毒、衛(wèi)星病毒）在VIGS上成功應(yīng)用，其中 RNA病毒包括煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）、馬鈴薯X病毒（potato virus X，PVX）、煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）、番茄金色花葉病毒（tomato golden mosaic virus，TGMV）、甘藍(lán)縮葉病毒（cabbage leaf curl virus，CbLCV）等[9]。但每種病毒載體誘導(dǎo)的沉默效率與宿主的選擇有關(guān)。如 PVX病毒載體在番茄上的研究發(fā)現(xiàn)，需要先進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄才能進(jìn)行RNA注射侵染[10]。TRV病毒載體的沉默效率高，沉默持續(xù)性長(zhǎng)且病毒癥狀輕，因而被廣泛用于VIGS載體的構(gòu)建[11]。蘋果潛隱球形病毒（apple latent spherical virus，ALSV）因病癥溫和，且在番茄上不產(chǎn)生病毒癥狀，而經(jīng)常用于番茄基因的沉默研究[12]。DNA病毒載體構(gòu)建簡(jiǎn)單，試驗(yàn)操作難度低且無(wú)需體外轉(zhuǎn)錄。其中的甜菜曲頂頭病毒（beet curly top virus，BCTV）和番茄卷曲葉病毒（tomato leaf curl virus，ToLCV）已成功用于番茄基因功能的研究[13-14]。衛(wèi)星病毒基因組小，在宿主中復(fù)制速度快且易于遺傳。其中的中國(guó)番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl China virus，TYLCV）和煙草曲莖病毒（tobacco curly shoot virus，TbCSV）可高效用于番茄基因的沉默[15-16]。研究者通過(guò)傳統(tǒng)的“酶切-連接”方法成功構(gòu)建了甜菜 WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員BvWRKY23的RNA干擾（RNA interference，RNAi）表達(dá)載體[17]。

1.3 VIGS技術(shù)進(jìn)展

KUMAGAI等[18]首次以八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase，PDS）cDNA片段完成 TMVVIGS載體構(gòu)建。經(jīng)過(guò) 3年的發(fā)展，RUIZ等[19]利用PDS構(gòu)建了 PVX-VIGS載體。VALENTINE等[20]以TRV病毒為載體完成了 TRV-VIGS體系的構(gòu)建，TRV-VIGS體系后來(lái)常用于蔬菜作物基因沉默載體的構(gòu)建。近幾年，WANG等[21]首次利用大麥條紋花葉病毒（barley stripe mosaic virus，BSMV）建立了BSMVVIGS體系用于大麥基因功能的研究。張怡等[22]成功構(gòu)建了大豆線蟲肌鈣蛋白（troponin C，tnc）和酰胺樣多肽（FMRFamide-like peptides，flp）基因的 TRV-VIGS體系。隨著不同病毒載體 VIGS體系研究的深入，PANDEY等[23]研究出復(fù)合病毒體系，將其他植物病毒的miRNA導(dǎo)入到另外一種病毒中，形成外源mirRNAs來(lái)侵染植株，開發(fā)了MIR-VIGS方法，標(biāo)志著雙病毒載體應(yīng)用VIGS體系的產(chǎn)生。趙禎等[24]運(yùn)用Gateway技術(shù)成功構(gòu)建了茄子（Solanumaculeatissimum）TRV-VIGS表達(dá)載體，沉默了葉片和果實(shí)的SmMsrA，表明基因克隆技術(shù)與VIGS技術(shù)的結(jié)合使用，減少了酶切環(huán)節(jié)，提高了載體構(gòu)建的效率。最近，宋恬等[25]首次在扁桃花器官上建立了以TRV為載體的VIGS沉默體系，成功用攜帶pTRV2-AcCBF1的農(nóng)桿菌侵染扁桃花器官且出現(xiàn)沉默效果。邱潤(rùn)霜等[26]以番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt orthotospovirus，TSWV）N構(gòu)建到pTRV-PTV00載體上，完成了TSWV介導(dǎo)的NVIGS載體的構(gòu)建，開闊了構(gòu)建病毒內(nèi)源基因沉默體系的新思路。

2 VIGS技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

VIGS研究基因功能的優(yōu)點(diǎn)在于它構(gòu)建簡(jiǎn)易、周期性短、成本較低。一般構(gòu)建重組載體到侵染植物進(jìn)行功能鑒定只需幾周時(shí)間，因此可以大規(guī)模進(jìn)行基因組序列和 EST序列的功能鑒定[27]。VIGS對(duì)于難獲突變體作物的研究?jī)?yōu)勢(shì)突出。當(dāng)植物基因組較大時(shí)，利用靶基因家族的保守DNA區(qū)域，VIGS通過(guò)沉默一個(gè)基因家族的多個(gè)成員來(lái)避免功能冗余的問(wèn)題，當(dāng)涉及到大的蛋白質(zhì)家族或基因重復(fù)時(shí)，各種點(diǎn)突變和插入不能產(chǎn)生適當(dāng)?shù)谋硇蚚28]，而 VIGS可使序列差異為10%—20%的同源基因沉默[29]。利用VIGS沉默目標(biāo)基因無(wú)需靶基因的完整編碼序列，只需其中的一段 cDNA片段即可實(shí)現(xiàn)靶基因沉默[30]。而RNAi技術(shù)在應(yīng)用時(shí)，dsRNA的合成成本過(guò)高，不利于產(chǎn)品的推廣[31]。CRISPR/Cas9技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因編輯有賴于PAM序列，在附近無(wú)PAM序列的區(qū)域時(shí)無(wú)法進(jìn)行編輯[32]。VIGS具備將 cDNA文庫(kù)整合到病毒載體上進(jìn)行高通量基因篩選分析的優(yōu)勢(shì)[33]。VIGS技術(shù)可用于不同蔬菜物種間比較基因組學(xué)的研究[34]。

3 VIGS在茄果類蔬菜作物中的應(yīng)用

蔬菜作物分子學(xué)研究領(lǐng)域已進(jìn)入后基因組時(shí)代[35]。應(yīng)用 VIGS技術(shù)鑒定茄果類蔬菜的基因功能涉及物質(zhì)合成調(diào)控、生物和非生物應(yīng)激反應(yīng)等方面。根據(jù)國(guó)內(nèi)外近3年的最新文獻(xiàn)，重點(diǎn)介紹在茄果類蔬菜果實(shí)發(fā)育、激素調(diào)節(jié)和植物與病原微生物相互作用及非生物脅迫應(yīng)答等方面利用 VIGS技術(shù)的研究進(jìn)展（表1）。

表1 利用VIGS研究的茄果類蔬菜基因及其表型Table 1 List of genes silenced by VIGS and the phenotype observed in solanaceous vegetable

3.1 VIGS在茄果類蔬菜物質(zhì)合成調(diào)控中的研究應(yīng)用

糖類的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)在植物新陳代謝與物質(zhì)循環(huán)中起著關(guān)鍵作用，同時(shí)也受到多方面的調(diào)控。利用VIGS技術(shù)，目前已經(jīng)系統(tǒng)研究了茄果類蔬菜中糖類合成途徑中的一些關(guān)鍵調(diào)控因子的功能。通過(guò)基因編輯技術(shù)，研究基因表達(dá)的激活（activation）和抑制（repressor）[57]。例如在番茄酰基糖代謝中間產(chǎn)物直鏈脂肪酸（straight-chain fatty acid，SCFA）合成途徑KASII和KASIII功能的研究中，沉默該基因后，SCFA含量減少了 40%，同時(shí)沉默植株中KASII和KASIII表達(dá)量顯著降低[36]。那么糖類是如何由新葉向老葉轉(zhuǎn)運(yùn)呢？最新的一項(xiàng)研究通過(guò) VIGS技術(shù)沉默SWEET家族基因SISWEET1a發(fā)現(xiàn)，沉默番茄植株的幼葉中己糖積累量減少了50%，在成熟葉片中增加了2倍多，證明SISWEET1a在番茄葉片合成的糖分向幼葉轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，挖掘出了SISWEET1a一個(gè)新的功能[37]，說(shuō)明基因編輯技術(shù)能對(duì)家族基因中單個(gè)基因準(zhǔn)確定位，并進(jìn)行穩(wěn)定改造，挖掘其基因功能[58]。

辣椒素是辣椒果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)的重要指標(biāo)，并且在其生長(zhǎng)中起著防蟲防病的自我防御作用。茉莉酸（jasmonic acids，JAs）在調(diào)控辣椒素的代謝信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著非常重要的作用，其調(diào)控因子R2R3-MYB的轉(zhuǎn)錄因子CaMYB108主要在辣椒的果實(shí)和花中表達(dá)，但是CaMYB108的下游信號(hào)尚未確定。利用VIGS技術(shù)沉默CaMYB108后發(fā)現(xiàn)辣椒素生物合成基因CBGs表達(dá)量降低，辣椒素含量減少，花藥開裂延遲，同時(shí)花粉活力降低。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CaMYB108靶向啟動(dòng)CBG。另外，茉莉酸甲酯誘導(dǎo)了CaMYB108和CBGs的表達(dá)，從而證實(shí)了CaMYB108參與辣椒植株雄蕊的發(fā)育以及辣椒素的合成[38]。以上研究都是基于TRV載體誘導(dǎo)的VIGS方法，而另外一種ALSV載體侵染植株后雖然沒有明顯的外觀特征，但其部分基因序列經(jīng)過(guò)改造后也常用于VIGS體系的構(gòu)建。有研究者發(fā)現(xiàn)，利用ALSV病毒侵染的藜麥葉片摩擦接種到辣椒上的方式并不能實(shí)現(xiàn)侵染，但使用ALSV病毒濃縮液則侵染成功，且沉默效率達(dá)到90%。在ALSV介導(dǎo)的VIGS體系中，將氨基酸轉(zhuǎn)移酶基因（pAMT）導(dǎo)入 ALSV病毒載體的方式成功侵染了辣椒植株，且侵染率在 80%—90%，pAMT沉默植株的辣椒素含量和辣椒素酯的積累減少。以上研究結(jié)果表明，ALSV病毒能夠用于構(gòu)建VIGS體系來(lái)研究辣椒素積累的調(diào)控機(jī)制，從而可以在辣椒育種上通過(guò)基因改造來(lái)提高辣椒素的含量[39]。

番茄果實(shí)中類胡蘿卜素的積累受環(huán)境和激素的影響較大，在調(diào)控番茄果實(shí)類胡蘿卜素代謝中，螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子（Helix-Loop-Helix，SLAR）影響類胡蘿卜素的合成。為了挖掘SLAR的功能，研究者利用VIGS技術(shù)沉默普通番茄‘M82’和櫻桃番茄‘Micro Tom’的SLAR，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)品種具有相同的表型，而且沉默后番茄紅素、總類胡蘿卜素和葉綠素含量明顯減少，驗(yàn)證了SLAR直接參與番茄類胡蘿卜素的生物合成過(guò)程[40]。有研究者利用CRISPR/Cas9技術(shù)分別以八氫番茄紅素合成酶1（phytoene synthase 1，PSY1）、MYB12和花色苷2（Anthocyanin 2，ANT2）為靶位點(diǎn)，成功培育出黃色、粉紅色和紫色番茄[59]，但構(gòu)建載體時(shí)需要準(zhǔn)確的靶基因序列，且容易脫靶。糖苷生物堿屬于有毒物質(zhì)，存在于許多茄科植物中，其合成受遺傳和環(huán)境的影響，尤其是光環(huán)境。葉綠素和類胡蘿卜素的生物合成也依賴光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，同時(shí)在糖苷生物堿合成過(guò)程中具有相同的中間物質(zhì)。研究者通過(guò)VIGS沉默PDS和鎂螯合酶基因CHLI與CHLH，發(fā)現(xiàn)沉默茄子葉片中葉綠素和類胡蘿卜素含量明顯降低，通過(guò)高效液相色譜和代謝物全譜分析，發(fā)現(xiàn)沉默植株糖苷生物堿含量顯著降低，參與糖苷生物堿合成和其他代謝物合成的基因下調(diào)表達(dá)，而且發(fā)現(xiàn)光合色素的積累會(huì)影響甾族類糖苷生物堿在茄子葉片中的合成[41]。在茄子果實(shí)成熟過(guò)程中，查爾酮、花青素等類黃酮物質(zhì)在其角質(zhì)層和表皮細(xì)胞中有所積累，類黃酮在茄子果實(shí)成熟過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制和影響因素也利用 VIGS技術(shù)得到了解答。研究者利用VIGS技術(shù)沉默茄子查爾酮合成酶基因（SmCHS），發(fā)現(xiàn)沉默植株茄子果實(shí)顏色變淺，花青素含量降低，表皮細(xì)胞的大小和形狀都發(fā)生了變化，且沉默植株茄子果實(shí)的向重力性反應(yīng)減輕，茄子果實(shí)彎曲，這一表型不僅說(shuō)明CHS調(diào)控茄子果實(shí)中類黃酮的積累，還證明了表皮細(xì)胞的延展性依賴CHS進(jìn)行表達(dá)，從而揭示了CHS的新功能[42]。許志茹等[60]利用GATEWAY技術(shù)構(gòu)建了蕪菁（Brassicarapa）二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）基因過(guò)表達(dá)的RNAi載體，為鑒定DFR在依光型和非依光型花青素合成過(guò)程中的功能研究奠定了基礎(chǔ)。同樣是色素相關(guān)基因功能的研究，VIGS體系不需要構(gòu)建植物遺傳轉(zhuǎn)化體系，大大縮短了研究進(jìn)程。生長(zhǎng)素作為植物適應(yīng)環(huán)境變化和植物組織代謝的關(guān)鍵激素，其在植物離層區(qū)域如何調(diào)控植物組織離層尚不清楚。相關(guān)研究者對(duì)此展開了研究，在對(duì)番茄生長(zhǎng)素共軛水解酶相關(guān)的5個(gè)基因功能的研究中發(fā)現(xiàn)，IAA-Ile參與生長(zhǎng)素共軛水解過(guò)程，并作為候選基因存在于離層區(qū)。利用環(huán)己酰亞胺（cycloheximide，CHX）處理發(fā)現(xiàn)從頭合成生長(zhǎng)素共軛水解酶抑制組織離層。利用 VIGS技術(shù)沉默番茄SlILL1、SlILL3、SlILL5、SlILL6和SlILL7，發(fā)現(xiàn)沉默目標(biāo)基因不會(huì)影響其他SlILL的表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)離層區(qū)生長(zhǎng)素能夠在花藥離層中發(fā)揮作用，是因?yàn)槭艿狡錆舛鹊挠绊?，且SlILR1、SlILL5和SlILL6存在協(xié)同作用，而外源使用生長(zhǎng)素后植株沉默表型明顯減弱[43]。

3.2 VIGS在茄果類蔬菜生物脅迫應(yīng)答機(jī)制中的研究應(yīng)用

番茄卷葉病毒（tomato leaf curl virus，TolCV）侵染番茄后誘導(dǎo)了乙烯反向調(diào)控途徑信號(hào)基因LeCTR1的表達(dá)。利用VIGS技術(shù)構(gòu)建番茄LeCTR1沉默植株，發(fā)現(xiàn)沉默植株對(duì)TolCV病毒的抗性增加，卷葉癥狀減輕，活性氧（reactive oxygen species，ROS）積累顯著減少，主要抗病相關(guān)基因（NPR1、PR1、PR5、AOS2、EIN2、EIN3和ERF5）表達(dá)增加，說(shuō)明沉默LeCTR1可以增強(qiáng)番茄對(duì)卷葉病的抗性[44]。DEKs參與植物細(xì)胞的增殖、分化、衰老和死亡。利用VIGS技術(shù)沉默番茄DEK后，番茄對(duì)葡萄孢菌（Botrytiscinerea）和丁香假單胞菌（Pseudomonassyringaepv.TomatoDC3000，Pst DC3000）的抗病性降低，沉默番茄植株中ROS積累增加，而且下調(diào)了抗病基因的表達(dá)，從而證明了DEKs參與番茄抗病的基因功能[45]。細(xì)菌性枯萎病是由青枯病菌（Ralstoniasolanacearum）引起的，而其在茄子上的致病機(jī)理一直不清楚。研究者利用VIGS技術(shù)來(lái)探究亞精胺合成酶（spermidine synthase，SPDS）在茄子青枯病中的作用機(jī)理，發(fā)現(xiàn)接種青枯病菌后茄子SPDS被誘導(dǎo)表達(dá)，亞精胺（Spd）含量增加，尤其是在耐性系植株中更加明顯，推斷 Spd在茄子抗青枯病中有著重要的作用。之后又通過(guò)酵母單雜和熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證這一推論，發(fā)現(xiàn)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子SmMYB44確實(shí)可以和SPDS啟動(dòng)子直接結(jié)合而誘導(dǎo)基因表達(dá)，進(jìn)一步通過(guò)超表達(dá)SmMYB44茄子植株證明了抗青枯病的SmMYB44-SmSPDS-Spd機(jī)制[46]。在辣椒上也利用 VIGS技術(shù)證明了青枯病的防御機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn) MYB轉(zhuǎn)錄因子CaPHL8參與辣椒青枯病的防御，通過(guò)氨基酸序列分析表明PHL8為 MYB轉(zhuǎn)錄因子，接種病菌植株的CaPHL8上調(diào)表達(dá)，而且GUS活性檢測(cè)也證明了這一結(jié)論。通過(guò)VIGS技術(shù)證明了CaPHL8在辣椒抗青枯病中的作用，而且這個(gè)基因在高溫高濕條件下也不會(huì)誘導(dǎo)表達(dá)[47]。在番茄青枯病的研究中，利用VIGS技術(shù)沉默MTC關(guān)聯(lián)基因SAMS2、SAHH1和MS1以及GABA生物合成相關(guān)基因GAD2和SSADH1，發(fā)現(xiàn)高濃度和中濃度侵染的SAHH1、MS1和GAD2沉默番茄對(duì)青枯病的抗性減弱，從而驗(yàn)證了MTC和GABA生物合成在番茄青枯病中的致病作用[48]。在探索粉孢菌（Oidiumneolycopersici）引起番茄白粉病的研究中，利用VIGS技術(shù)構(gòu)建了ShORR-1（solanum habrochaites oidium resistance required-1）沉默株系，證明ShORR-1在番茄抗白粉病中的基因功能[49]。辣椒CaWRKY45參與抗病的功能也利用VIGS技術(shù)得以驗(yàn)證[50]。

植物根系分泌物和根結(jié)線蟲均會(huì)引起土壤性狀的改變，根結(jié)線蟲也會(huì)侵染植物根系。在最新的一項(xiàng)關(guān)于植物、土壤和根結(jié)線蟲的報(bào)道中，研究者利用VIGS技術(shù)沉默番茄根系 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ABC-C6和ABC-G33，其中ABC-C6沉默植株抑制結(jié)瘤線蟲（Meloidogynespp.）和黃金線蟲（Globoderaspp.）產(chǎn)卵，ABC-G33沉默株系只抑制黃金線蟲產(chǎn)卵。ABC-C6沉默植株對(duì)土壤農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）和枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）沒有抑制作用，但ABC-G33沉默植株對(duì)枯草芽孢桿菌具有抑制作用，發(fā)現(xiàn)ABC-C6在生物防治根結(jié)線蟲上的重要作用，從而證明了 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在土壤根系分泌物和線蟲之間的關(guān)系，為保護(hù)植物免受線蟲侵染提供了依據(jù)[51]。在茄子上的研究發(fā)現(xiàn)，核苷酸結(jié)合位點(diǎn)富含亮氨酸的重復(fù)序列nucleotide-binding site leucine-rich repeat（NBS-LRR）抗逆基因SacMi，在接種線蟲的植株中該基因表達(dá)量上調(diào)，沉默SacMi植株表現(xiàn)出對(duì)線蟲的敏感性[52]。

3.3 VIGS在茄果類蔬菜非生物脅迫應(yīng)答機(jī)制中的研究應(yīng)用

CaWRKY27能夠正調(diào)控辣椒植株對(duì)細(xì)菌性青枯病的抗性，同時(shí)負(fù)調(diào)控植株的耐熱性。研究者利用VIGS技術(shù)沉默CaWRKY27，發(fā)現(xiàn)沉默的辣椒植株對(duì)鹽脅迫和滲透脅迫抗性顯著增強(qiáng)，還發(fā)現(xiàn)CaWRKY27不僅在辣椒逆境脅迫中是轉(zhuǎn)錄激活因子，而且還能編碼抗逆境阻遏蛋白[53]。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因（GSTU43）參與了5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）誘導(dǎo)的抗氧化脅迫，并調(diào)節(jié)低溫脅迫下葉綠素的合成。利用VIGS技術(shù)沉默GSTU43后，發(fā)現(xiàn)沉默植株中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、抗壞血酸氧化酶和谷胱甘肽還原酶活性降低，膜脂過(guò)氧化物含量增加，而外源ALA處理后這些指標(biāo)均恢復(fù)，說(shuō)明ALA可引起由GSTU43編碼的GST增加，從而增強(qiáng)番茄對(duì)低溫引起的氧化脅迫抗性[54]。研究人員在番茄中利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建 CRISPR-BZR1突變體，證實(shí)BZR1還通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜受體蛋白激酶FERONIA基因（FER）參與番茄的耐熱性[61]，但整個(gè)番茄植株材料均在bzr1突變體的基礎(chǔ)上才能完成。

F-box蛋白、CaDIF1（辣椒干旱誘導(dǎo)F-box protein1基因）可以由ABA、干旱脅迫、H2O2和NaCl脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，CaDIF1沉默株系展現(xiàn)出干旱敏感性，而超表達(dá)株系展現(xiàn)出 ABA敏感性和干旱耐性。利用酵母雙雜交試驗(yàn)確定了CaDIS1（辣椒 DIF1-Interacting SKP1）在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中與CaDIF1存在互作現(xiàn)象。CaDIF1和CaDIS1沉默株系表現(xiàn)出對(duì)ABA不敏感以及干旱耐性降低，且兩種植株葉片氣孔變大和蒸騰速率增加，進(jìn)一步說(shuō)明CaDIF1和CaDIS1可互作，并且參與依賴 ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的干旱脅迫抗性過(guò)程[55]。研究者也利用VIGS技術(shù)揭示了MYB80參與調(diào)控辣椒低溫脅迫的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)低溫處理下MYB80沉默植株抗冷性減弱[56]。

4 VIGS在瓜類、葉菜類和豆類蔬菜作物中的應(yīng)用

表2列舉了利用VIGS技術(shù)沉默瓜類、葉菜類和豆類蔬菜相關(guān)功能基因及沉默后的表型。瓜類蔬菜有黃瓜、西葫蘆、絲瓜、香瓜和西瓜等，VIGS試驗(yàn)一般使用ALSV病毒作為載體侵染葫蘆科作物[69]?？寺↑S瓜葉片PDS和SU（300 bp），分別構(gòu)建ALSV-PDS和 ALSV-SU兩個(gè)載體侵染葫蘆科植物的子葉，沉默植株分別表現(xiàn)出光漂白和黃葉表型，說(shuō)明導(dǎo)入ALSV-PDS和ALSV-SU載體的植物內(nèi)源PDS和SU被沉默，表明ALSV介導(dǎo)的VIGS體系成功構(gòu)建[28]。研究者還利用 TRV介導(dǎo)的 VIGS技術(shù)構(gòu)建黃瓜glycerol-3-phosphate 2-O-acyltransferase 6（GPAT6）基因沉默體系，探究GPAT6在黃瓜自毒脅迫中的功能，沉默植株表現(xiàn)出對(duì)自毒物質(zhì)肉桂酸的抗性增強(qiáng)[62]。在甜瓜（Cucumismelovar.makuwaMakino）CmLOX10功能驗(yàn)證中，沉默植株CmLOX10表達(dá)量下調(diào)，pTRV-CmPDS沉默植株葉片出現(xiàn)白化現(xiàn)象，綠色熒光蛋白（GFP）檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了沉默現(xiàn)象，證明 TRV病毒誘導(dǎo)的基因沉默體系在甜瓜上構(gòu)建成功[63]。

表2 利用VIGS研究的瓜類、葉菜類和豆類蔬菜基因及其表型Table 2 List of genes silenced by VIGS and the phenotype observed in melon, leaf and legume vegetable

蕪菁黃化花葉病毒（turnip yellow mosaic virus，TYMV）具有正義 RNA鏈，可以侵染許多十字花科植物。例如以白菜（B.rapassp.pekinensiscv.Bre）BcPDS和BcNRT1為靶基因，從BcPDS和BcNRT1中選取合適的40 bp序列，反向互補(bǔ)處理后用T4連接酶進(jìn)行連接，分別構(gòu)建pTY-BcPDS和pTY-BcNRT1載體。白菜植株被 pTY-BcPDS侵染可導(dǎo)致白菜中該基因的表達(dá)顯著降低，沉默效果比較明顯；pTY-BcNRT1侵染白菜植株，顯著抑制了BcNRT1在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)[29]。最近的一項(xiàng)關(guān)于白菜包心緊實(shí)度受轉(zhuǎn)錄輔激活因子 ANGUSTIFOLIA3（AN3）的研究中，也利用TYMV-VIGS技術(shù)，發(fā)現(xiàn)基因沉默的白菜在蓮座期和團(tuán)棵期AN3都下調(diào)表達(dá)，證明基因沉默刺激了白菜葉片包心的形成[66]。

在菠菜雌花發(fā)育機(jī)制的研究中，通過(guò)甜菜曲頂病毒（beet curly top virus，BCTV）誘導(dǎo)的VIGS體系，對(duì)DELLA家族轉(zhuǎn)錄因子SpGAI在GA參與雌花形成中的基因功能得到了驗(yàn)證。沉默SpGAI后雌花表現(xiàn)出雄花器官的表型特征，中度表型是發(fā)育一個(gè)雄蕊代替雌蕊，但仍產(chǎn)生兩個(gè)萼片；重度表型是發(fā)育4個(gè)萼片、1個(gè)雌蕊和1個(gè)雄蕊，同時(shí)花有4個(gè)萼片，類似于藜科植物中的完全花。沉默SpGAI后雄花發(fā)育成野生型雄花，但對(duì)外觀表型沒有影響[64]。MA 等[70]以甘藍(lán)BoPDS為靶基因，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)甘藍(lán)基因組的精準(zhǔn)編輯，主要是依賴單鏈向?qū)?RNA表達(dá)基因來(lái)完成突變體的構(gòu)建，與VIGS技術(shù)相比，構(gòu)建程序復(fù)雜，且目標(biāo)基因在核苷酸預(yù)期位置容易缺失。在研究葉用萵苣熱脅迫下Hsp70表達(dá)量和形態(tài)變化時(shí)，研究者構(gòu)建pTRV-LsHsp702711沉默體系，發(fā)現(xiàn)未進(jìn)行脅迫處理的沉默植株LsHsp70-2711表達(dá)量下降，莖明顯伸長(zhǎng)，熱脅迫和干旱處理后的沉默植株LsHsp70-2711表達(dá)量顯著低于對(duì)照植株，且高溫脅迫對(duì)sHsp70-2711的影響大于干旱脅迫[65]。

CONSTANTIN等[71]利用豌豆早枯病毒（pea early browning virus，PEBV）研發(fā)了一套有效的VIGS體系，使得在豌豆中利用反向遺傳學(xué)方法研究基因功能成為可能。在研究ROS、Ca2+參與豌豆葉綠素合成的研究中，利用VIGS技術(shù)構(gòu)建了葉綠素合成關(guān)鍵基因CHLI沉默體系，采用組織化學(xué)和熒光染色試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默豌豆植株中ROS和胞間游離Ca2+增多，且豌豆發(fā)黃葉片中產(chǎn)生超氧陰離子和過(guò)氧化氫[67]。研究者還利用VIGS技術(shù)沉默了豌豆質(zhì)膜水通道蛋白基因PsPIP2;1，發(fā)現(xiàn)沉默植株的葉片和根系中PsPIP2;1下調(diào)表達(dá)，從而證明豌豆葉片和根系水分運(yùn)輸中PsPIP2;1對(duì)水通道蛋白具有調(diào)節(jié)作用[68]。ZHANG等[72]利用菜豆莢斑駁病毒（bean pod mottle virus，BPMV）在大豆上成功建立了VIGS體系，且該病毒載體能夠應(yīng)用于大豆、菜豆等豆類蔬菜上，改造后拓展了BPMV病毒的宿主范圍。

5 VIGS技術(shù)的不足之處和研究展望

盡管VIGS技術(shù)自被開發(fā)以來(lái)，已在許多蔬菜作物的基因功能鑒定研究中發(fā)揮了重要作用，同時(shí)建立了多種有效的VIGS載體，但是還存在一定的局限性。首先，沉默茄果類蔬菜后植株的沉默表型不均一、表型難以辨識(shí)，如在沉默番茄、辣椒等果實(shí)顏色相關(guān)基因時(shí)，表現(xiàn)出沉默植株表型不均一；再比如，利用ALSV病毒侵染的藜麥葉片摩擦接種到辣椒上并不能成功侵染，沉默植株表型不均一，但使用ALSV病毒濃縮液則侵染成功，且沉默效率達(dá)到90%。其次，VIGS技術(shù)存在靶基因沉默不完全、功能敲除不徹底、脫靶沉默和干擾癥狀等現(xiàn)象，如同時(shí)沉默番茄的兩個(gè)基因SlEBF和SlEBF2后發(fā)現(xiàn)植株表現(xiàn)出敗育和生長(zhǎng)緩慢等一系列表型，影響了2個(gè)基因功能的研究；再者，這種瞬時(shí)沉默技術(shù)的穩(wěn)定性和持續(xù)時(shí)間較差，且無(wú)法穩(wěn)定遺傳。另外，基因家族功能冗余情況也會(huì)因缺乏某一特定家族成員基因完整序列而導(dǎo)致干擾；此外，環(huán)境因素如溫度、濕度和光照等可影響病毒在宿主植物中的擴(kuò)散速度，其中溫度對(duì)病毒粒子的擴(kuò)散起主要作用。如 TRV病毒侵染番茄時(shí)，較好的沉默表型在22℃或者更低的溫度下才能發(fā)生。應(yīng)用VIGS技術(shù)的困擾因素還有農(nóng)桿菌的保存期短、農(nóng)桿菌活性以及擴(kuò)繁效率低，因此，建立并優(yōu)化農(nóng)桿菌擴(kuò)繁發(fā)酵技術(shù)與工藝也是今后努力的方向[73]。VIGS載體種類仍然有限，因此限制了VIGS技術(shù)的廣泛應(yīng)用[74]。

VIGS自被開發(fā)以來(lái)，已經(jīng)開始應(yīng)用于蔬菜作物病毒病的預(yù)防和控制、雜草的防控和蔬菜作物重要生長(zhǎng)階段的調(diào)控等領(lǐng)域，改變了傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥防治方法。例如，NEENA等[75]使用一種納米材料 BioClay裝載dsRNA并沉默同源RNA，以控制煙草病毒病的傳播。目前，一些農(nóng)業(yè)化工企業(yè)已經(jīng)開始研發(fā)相關(guān)技術(shù)和產(chǎn)品[76]。未來(lái)會(huì)有相關(guān)產(chǎn)品取代傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥[77]。在優(yōu)化VIGS技術(shù)方面，為避免脫靶現(xiàn)象，可利用不同種類的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)和在線軟件精確設(shè)計(jì)靶基因序列，以提高靶基因沉默的準(zhǔn)確度。此外，病毒載體可從RNA病毒、DNA病毒載體、衛(wèi)星病毒等多種載體中選擇適用于不同種類蔬菜作物的沉默載體。今后隨著VIGS技術(shù)的不斷發(fā)展，主要研究的方向可從以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究：一是開發(fā)特異性與穩(wěn)定性更高的病毒載體；二是優(yōu)化病毒侵染后植株的培養(yǎng)條件，如光照、溫度等方面進(jìn)行系統(tǒng)研究，提高基因沉默的穩(wěn)定性；三是果菜類蔬菜果實(shí)離體VIGS技術(shù)的研發(fā)，以便用于果實(shí)采后保鮮；四是提高VIGS誘導(dǎo)基因沉默的持續(xù)時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)在蔬菜長(zhǎng)季節(jié)栽培過(guò)程中生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控基因功能的研究；五是選擇高效的基因片段進(jìn)行沉默，以提高基因沉默的準(zhǔn)確性。最后是病毒載體的安全性問(wèn)題，病毒是作物的重要病原物，且大多數(shù)植物病毒都能以昆蟲為媒介進(jìn)行傳播。所以，在構(gòu)建VIGS病毒載體時(shí)應(yīng)對(duì)病毒載體進(jìn)行修飾，使其不引起嚴(yán)重癥狀或被介體傳播，試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行合理規(guī)范處理以免造成病毒傳播。

RNAi能夠特異性地降低或關(guān)閉靶基因表達(dá)，是基因功能研究的重要手段，但很難控制靶基因的沉默效率，且需要很長(zhǎng)一段時(shí)間來(lái)建立遺傳轉(zhuǎn)化體系，大大增加了科研工作者的時(shí)間成本，降低了研究效率[78]。CRISPR/Cas9技術(shù)雖然具有一次編輯多個(gè)基因的功能優(yōu)勢(shì)，但存在脫靶效應(yīng)，且對(duì)于多倍體植物而言，基因組改造的難度很大[79-80]。VIGS技術(shù)在選擇目的基因靶位序列時(shí)，對(duì)插入片段的方向并無(wú)要求，且不易脫靶[81-82]。因此，隨著高通量測(cè)序等新技術(shù)的不斷研發(fā)和VIGS技術(shù)的優(yōu)化，基于非編碼的單鏈小分子RNA構(gòu)建的VIGS技術(shù)，可以用于農(nóng)作物新品種目標(biāo)基因的高通量快速篩選，促進(jìn)了蔬菜基因工程和蔬菜作物改良以及分子育種的發(fā)展，推進(jìn)生產(chǎn)不攜帶外源基因的蔬菜品種育成的進(jìn)程[83]。相信VIGS作為高效的研究基因功能的技術(shù)在蔬菜作物上的應(yīng)用必將被逐步完善，在蔬菜功能基因組學(xué)研究的應(yīng)用前景會(huì)更加廣泛。