水稻 CSC11介導(dǎo)干熱風(fēng)/干旱誘導(dǎo)的鈣信號調(diào)控雄蕊發(fā)育

任志杰，李倩，孫鈺佳，孔冬冬，劉良玉，侯聰聰，李樂攻

首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/植物基因資源與低碳環(huán)境生物技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100048

0 引言

【研究意義】干熱風(fēng)或水分脅迫是阻礙作物生長和產(chǎn)量形成的重要逆境因子之一，作物在干熱風(fēng)或水分等非生物脅迫下，進化出一套完整而復(fù)雜的應(yīng)對機制，Ca2+被認為是啟動這類復(fù)雜反應(yīng)的通用第二信使或干旱逆境因子，例如：滲透勢的改變、水分的變化、溫度的變化、機械刺激都會引起細胞鈣離子濃度的特征性反應(yīng)，這種變化啟動了細胞內(nèi)生理生化過程，傳遞和放大干旱逆境信號的作用[1-3]，因此，篩選鑒定水稻中感受干熱風(fēng)的鈣離子通道及相關(guān)基因不僅對研究水稻傳導(dǎo)干熱風(fēng)信號具有重要的生物學(xué)意義，同時也為培育耐干熱風(fēng)水稻的分子育種提供重要的基因資源和遺傳材料?！厩叭搜芯窟M展】盡管早期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流的基因家族，如：谷氨酸受體類通道（glutamate receptor-like，GLRs）、環(huán)核苷酸門控離子通道（cyclic nucleotide-gated channels，CNGCs）和膜聯(lián)蛋白類通道（Annexins）等[4-5]，也發(fā)現(xiàn)了介導(dǎo)水分進出細胞的水通道家族（plasma membrane intrinsic proteins，PIPs）[6]等。但是，上述通道本身沒有受體功能，也不能對細胞的水分變化做出直接的應(yīng)對反應(yīng)[4-5]。2014年HOU等[7]首次發(fā)現(xiàn)，模式植物擬南芥中存在一類受體類型的鈣離子通道，它們屬于 DUF221家族且廣泛存在于真核生物中，可以被滲透勢或機械門控激活，能夠感應(yīng)滲透/機械力的變化，這一結(jié)論后續(xù)被多個結(jié)構(gòu)和神經(jīng)生物學(xué)研究者證實[8-10]，另外還發(fā)現(xiàn)果蠅的鈣離子透過性脅迫反應(yīng)陽離子通道家族（CSCs）感應(yīng)粗粒食物介導(dǎo)適口性的功能[11]，也發(fā)現(xiàn)小鼠的CSCs感應(yīng)聲波變化，缺失導(dǎo)致嚴重耳聾[12]，該家族基因的功能成為神經(jīng)生物學(xué)研究者追逐的熱點。擬南芥兼具水分受體感應(yīng)和通道轉(zhuǎn)運功能的CSCs家族的發(fā)現(xiàn)，為分析水稻的水分變化感應(yīng)分子提供了線索和良好的研究基礎(chǔ)[7]。干熱風(fēng)是一種高溫、低濕并伴有一定風(fēng)力的農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害，不定時發(fā)生，難以預(yù)測，嚴重影響農(nóng)作物產(chǎn)量[13-16]，在水稻的揚花期偶遇干旱或高溫也會導(dǎo)致產(chǎn)量的急劇下降，這類干熱風(fēng)逆境的共同之處就是嚴重影響作物細胞，尤其是防護性能不強的生殖細胞，造成細胞快速失水而導(dǎo)致花粉發(fā)育異常、結(jié)實率降低[17-25]。【本研究切入點】作物的CSCs家族研究剛剛起步，水稻中CSCs的同源基因有11個，其中只有OsCSC4被證明異源表達在擬南芥中具有類似AtCSC1的功能[26]。但是，到目前為止，水稻響應(yīng)干熱風(fēng)脅迫的受體或通道均未見報導(dǎo)，也未發(fā)現(xiàn)水稻生殖細胞感應(yīng)干熱風(fēng)的分子基礎(chǔ)和調(diào)控機理?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究分析水稻CSC11的鈣離子轉(zhuǎn)運活性及調(diào)控活性的分子結(jié)構(gòu)域，獲得oscsc11突變體并分析干熱風(fēng)條件下的表型變化，這一分子功能的發(fā)現(xiàn)為理解作物響應(yīng)干熱風(fēng)傷害的分子機理研究提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：水稻（OryzasativaL.）品種為日本晴（Nipponbare），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所路鐵剛研究員課題組提供，擬南芥生態(tài)型Col-0；菌株：大腸桿菌（Escherichiacoli）感受態(tài)細胞Trans10購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株GV3101由首都師范大學(xué)李樂攻教授實驗室保存；動物材料：雌性成熟非洲爪蟾（Xenopuslaevis）購自美國Nasco公司?；蚯贸蛔凅w和GUS表達株系的遺傳轉(zhuǎn)化工作在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院路鐵鋼研究員課題組水稻轉(zhuǎn)化平臺完成，遺傳材料的擴繁和表型分析工作在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊實驗基地和北京首都師范大學(xué)實驗樓完成。

1.2 水稻總RNA提取和熒光定量PCR分析

分別取野生型日本晴水稻不同組織，用Trizol法（賽默飛）提取總 RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript ?II（賽默飛）體外反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（具體步驟參見說明書）。實時熒光定量PCR引物見表1，以水稻LOC_Os03g50885為內(nèi)參基因，每個樣品3個重復(fù)，根據(jù)公式2-ΔΔCT方法計算相對表達量[27]。

1.3 載體的構(gòu)建和水稻轉(zhuǎn)基因植株的獲得

依據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫 Rice Genome annotation project（http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）提供的序列信息，設(shè)計擴增OsCSC11啟動子序列上下游引物，提取野生型日本晴水稻基因組DNA作為PCR模板，設(shè)計ProCSC11-F和ProCSC11-R引物（表1），將OsCSC11（LOC_Os03g04450）的啟動子1 435 bp（1.435 kb upstream of the start codon）與β-glucuronidase（GUS） reporter融合構(gòu)建到p1300-GN表達載體中。水稻cDNA作為模板擴增OsCSC11全長CDS序列，將其構(gòu)建到pE3242-GFP載體中，OsCSC11-GFP融合表達重組載體用于蛋白亞細胞定位。利用 CRISPR/Cas9基因編輯方法，設(shè)計靶位點引物 Target-F/Target-R引物（表1），構(gòu)建pCAMBIA1300-Cas9基因敲除載體。采用農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織的方法[28]，獲得GUS表達轉(zhuǎn)基因株系以及OsCSC11敲除突變體株系。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 GUS報告基因活性分析

在不同發(fā)育時期，取穩(wěn)定表達ProCSC11-GUS轉(zhuǎn)基因植物的不同組織進行GUS染色觀察，方法參考文獻[29]，使用萊卡倒置顯微鏡和蔡司體式顯微鏡SV11對染色組織進行拍照記錄。

1.5 亞細胞定位分析

利用聚乙二醇（PEG4000）介導(dǎo)的擬南芥原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化方法將表達重組蛋白 35S::OsCSC11-GFP和對照組 35S::GFP的質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體細胞，具體方法參考文獻[30]。通過基因槍法[31]將上述質(zhì)粒載體瞬時轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞，在激發(fā)光為488 nm的蔡司780激光共聚焦顯微鏡下，對表達GFP熒光蛋白的細胞進行拍照記錄。

1.6 雙電極電壓鉗技術(shù)方法

將全長OsCSC11和刪除 N端 156氨基酸后（OsCSC11ΔTM1-3）的基因序列分別構(gòu)建到蛙卵表達載體pGEMHE和pGEMHE-GFP中，以線性化的質(zhì)粒為模板，利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒 Ambion mMESSAGE mMACHINE T7（購自賽默飛）進行體外轉(zhuǎn)錄，合成成熟的 cRNA（Capped-RNA），并稀釋到 500 ng·μL-1的濃度備用。通過顯微注射向每個蛙卵中注射32 nL的cRNA，對照組注射等體積的RNase-free ddH2O，在 ND96（96 mmol·L-1NaCl、2 mmol·L-1KCl、1 mmol·L-1MgCl2、1.8 mmol·L-1CaCl2和 10 mmol·L-1HEPES/NaOH, pH7.4）溶液中，18℃孵育至少 48 h待蛋白表達。采用TEV200A放大器、Digidata 1440 A/D數(shù)模轉(zhuǎn)換器（Dagan公司）和pCLAMP10.4軟件（Axon Instruments）對數(shù)據(jù)進行記錄[32-34]，記錄時電極液為3 mol·L-1KCl。刺激激活的通道活性分析所用的基礎(chǔ)溶液為 ND96，高滲溶液為 ND96+500 mmol·L-1Mannitol，電壓鉗制在-100 mV；組成型離子通道活性分析時在基礎(chǔ)灌流液（2 mmol·L-1KCl、1 mmol·L-1MgCl2和 10 mmol·L-1MES-Tris，pH5.6）中分別加入 20 mmol·L-1的 K+、Na+、Mg2+、Ca2+進行離子選擇性分析，用 D-甘露醇調(diào)節(jié)滲透勢至 220 mosmol·kg-1，電壓從-140 mV遞增至+40 mV，每次遞增10 mV，鉗制電位設(shè)置為0，電壓刺激持續(xù)時間設(shè)置為2 s。

1.7 花粉粒的活力測定

在授粉前，將成熟期穎花的雄蕊取下，且每種材料取3株獨立的株系進行I2-KI染色，在蔡司體式顯微鏡SV11下進行觀察記錄。

2 結(jié)果

2.1 OsCSC11蛋白序列是具有特異結(jié)構(gòu)域（Motifs）的獨立亞家族

鈣離子透過性脅迫反應(yīng)陽離子通道家族（CSCs）是近年發(fā)現(xiàn)的一種類似動物瞬時受體電位通道（transient receptor potential channels，TRPs）的兼具受體和通道雙重功能的離子通道[7]，它們廣泛存在于真核生物中。模式植物擬南芥有 15個成員，水稻有11個成員，經(jīng)序列比對（圖1），擬南芥和水稻的CSCs成員分別歸屬4個亞家族，其中，水稻OsCSC11和擬南芥AtCSC15同屬較為獨立的第四亞家族，與其他成員的同源性較低。

蛋白質(zhì)序列分析顯示 CSCs家族蛋白具有 8—10個跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrance domain，TM），并且都具有DUF221功能結(jié)構(gòu)域，是一類典型的膜蛋白。將OsCSC11與已報道的5個擬南芥CSCs成員進行蛋白序列比對分析發(fā)現(xiàn)，它們同源性較高，在N端3個TMs（包含 Loop的區(qū)域）、第六至第九 TMs（不包含 Loop區(qū)）和 DUF221功能區(qū)都很保守，推測OsCSC11很可能與擬南芥CSCs具有類似的功能。而OsCSC11在第三個TM和第九個TM之間有較特異的7個結(jié)構(gòu)域（圖2），這些較獨特的結(jié)構(gòu)，在進化過程中可能賦予了 OsCSC11不同于其他同源蛋白的特有功能，縱觀全長蛋白序列，這一家族特有的前 3個TMs，可能是這種受體類通道的受體結(jié)構(gòu)域，而其余的部分則非常類似典型的 6個跨膜離子通道，如：Shaker-type鉀離子通道或CNGCs等。

2.2 OsCSC11在葉片和花藥中表達量相對較高

基因的組織或時空表達模式與其功能直接相關(guān)。取野生型水稻不同組織的 cDNA作為模板，利用qRT-PCR方法檢測OsCSC11的表達，發(fā)現(xiàn)該基因在葉片、葉鞘和雄蕊中表達量相對較高，在根、莖以及不同發(fā)育時期的穗組織中相對較低（圖 3-A）。對穩(wěn)定表達ProCSC11-GUS轉(zhuǎn)基因植物的不同組織進行GUS染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsCSC11的啟動子在幼苗地上部分、葉片，以及雄蕊的花粉粒中活性較高（圖 3-B—圖3-E），表明OsCSC11很可能主要在葉片和雄蕊發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

2.3 OsCSC11定位于細胞質(zhì)膜

蛋白的亞細胞定位有助于理解和分析 OsCSC11的功能。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒35S-OsCSC11-GFP和對照質(zhì)粒35S-GFP通過瞬時轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體及洋蔥表皮細胞。在488 nm激發(fā)光下檢測，發(fā)現(xiàn)表達OsCSC11-GFP融合蛋白的原生質(zhì)體在細胞質(zhì)膜上有較強的GFP熒光信號，表達對照組質(zhì)粒的原生質(zhì)體中，熒光信號在胞質(zhì)內(nèi)和細胞質(zhì)膜上均可檢測到（圖 4-A）；同時，洋蔥表皮細胞瞬時轉(zhuǎn)化的結(jié)果也顯示OsCSC11-GFP定位于細胞質(zhì)膜，而表達對照質(zhì)粒的洋蔥表皮細胞在胞質(zhì)和質(zhì)膜上也可檢測到熒光信號（圖4-B），表明OsCSC11是一個細胞質(zhì)膜蛋白。

2.4 OsCSC11介導(dǎo)干旱誘導(dǎo)的鈣信號

2.4.1 OsCSC11全長處于靜息狀態(tài)被高滲透溶液激活 已有報道發(fā)現(xiàn)CSCs家族一些成員是被高滲脅迫/機械刺激激活的離子通道，那么OsCSC11是否也有類似的通道活性呢？通過顯微注射，將 OsCSC11-GFP融合蛋白表達在非洲爪蟾卵母細胞中，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)卵母細胞質(zhì)膜上有特異的GFP熒光信號（圖5-D），與其在植物細胞中的質(zhì)膜定位結(jié)果一致。利用雙電極電壓鉗方法，在蛙卵表達系統(tǒng)中驗證OsCSC11的電生理功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達OsCSC11的蛙卵在外加高滲溶液時（模擬機械刺激/膜擾動）產(chǎn)生了（4.27±1.50）μA的內(nèi)向電流，而對照組注射水的蛙卵在相同條件下只能檢測到（0.19±0.02）μA的背景電流（圖5-A和圖5-B），這表明OsCSC11全長蛋白的轉(zhuǎn)運活性可以被高滲溶液激活。

2.4.2 刪除 N端跨膜域/受體結(jié)構(gòu)域的 OsCSC11ΔTM1-3具有組成性的鈣通道活性 結(jié)合研究較多的典型離子通道（CNGC、GLR家族）的蛋白結(jié)構(gòu)特征，進一步對 OsCSC11蛋白序列分析，發(fā)現(xiàn) OsCSC11蛋白在TM3和TM9之間有7個未知功能的結(jié)構(gòu)域（圖2），為了進一步探索OsCSC11蛋白作為離子通道的特性，將OsCSC11的N端3個跨膜域（第1—156個氨基酸）刪除并命名為 OsCSC11ΔTM1-3，將OsCSC11ΔTM1-3和OsCSC11ΔTM1-3-GFP的cRNA注射表達在卵母細胞中，發(fā)現(xiàn)刪除N端3個跨膜域的OsCSC11ΔTM1-3仍然在質(zhì)膜上表達（圖 5-D），電生理試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在未施加高滲溶液刺激的情況下，表達了 OsCSC11ΔTM1-3的蛙卵就可以記錄到非常明顯的組成型鈣離子內(nèi)流信號（3 μA），而對照組和OsCSC11全長蛋白在同樣條件下未檢測到明顯的電流（0.2 μA背景電流）（圖5-C—圖5-E）。對OsCSC11ΔTM1-3的離子選擇性進行分析，發(fā)現(xiàn) OsCSC11ΔTM1-3可以同時轉(zhuǎn)運二價鈣離子和鎂離子，對一價金屬離子鈉離子和鉀離子沒有明顯的轉(zhuǎn)運活性（圖5-F）。上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsCSC11ΔTM1-3具有鈣離子的轉(zhuǎn)運特性，而全長OsCSC11蛋白在無高滲脅迫刺激時檢測不到活性，由此推測 OsCSC11的 TM1-3結(jié)構(gòu)域有可能具有受體功能，感應(yīng)高滲或機械脅迫，而 OsCSC11ΔTM1-3形成具有鈣離子轉(zhuǎn)運活性的通道，當(dāng)TM1-3結(jié)構(gòu)域感受到外界高滲或機械刺激時，引起通道結(jié)構(gòu)域的激活，介導(dǎo)鈣離子的內(nèi)向轉(zhuǎn)運。

2.5 利用 CRISPR/Cas9基因編輯方法獲得 oscsc11突變體

體外功能研究表明 OsCSC11蛋白可以直接響應(yīng)高滲刺激介導(dǎo)鈣離子的內(nèi)流，為了進一步探究該蛋白在植物體內(nèi)的生理功能，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建OsCSC11功能缺失的突變體。在OsCSC11序列的N端選取一段靶序列作為編輯位點（圖6-A），構(gòu)建CRISPR/Cas9敲除載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)化法獲得了不同編輯類型的水稻突變體，利用靶點檢測引物CSC11-CRI-F/ CSC11-CRI-R（表1）對Target上下游區(qū)域進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物測序比對發(fā)現(xiàn)，在84株轉(zhuǎn)基因陽性苗中有53株Target靶點位置發(fā)生了編輯。經(jīng)過T2代分離鑒定獲得了2種類型突變體株系，分別命名為oscsc11-1和oscsc11-2，其中oscsc11-1在ORF第178—179 bp之間插入一個堿基T，也就是在野生型的第 179 bp處插入了堿基 T；oscsc11-2在ORF第178 bp（G）和第179 bp（T）處缺失了2個堿基。2種突變體的等位基因均造成移碼突變、提前終止。

2.6 oscsc11突變體雄蕊的耐干旱性顯著下降

2.6.1oscsc11突變體花藥彎曲與干熱風(fēng)誘導(dǎo)的表型類似 體外電生理學(xué)分析證明了 OsCSC11是高滲脅迫（模擬干旱或機械刺激）激活的離子通道，那么OsCSC11在水稻中生理功能如何？進一步對已獲得的oscsc11突變體進行表型分析，發(fā)現(xiàn)oscsc11突變體在苗期和營養(yǎng)生長期與野生型水稻沒有明顯差異，而在生殖生長期時oscsc11突變體雄蕊不能正常頂出穎殼（圖7-A和圖7-B），剝開穎殼后發(fā)現(xiàn)oscsc11突變體的雄蕊發(fā)育異常，花藥較野生型短，且部分出現(xiàn)一定程度的卷曲，花藥顏色與野生型相比較淺（圖 7-C和圖 7-D）。通常在水稻抽穗開花期較多為高溫多風(fēng)天氣，野生型水稻的花藥偶遇長時間的干熱風(fēng)刺激時，雄蕊的花藥組織會因脫水導(dǎo)致卷曲現(xiàn)象，oscsc11突變體雄蕊的表型與野生型雄蕊長時間受到干熱風(fēng)刺激脫水之后的表型類似。為了更進一步確定OsCSC11的功能與干熱風(fēng)造成的雄蕊脫水相關(guān)，對野生型和突變體的花粉含水量進行了測量，結(jié)果顯示，oscsc11突變體花粉的含水量（花粉細胞中水組分的質(zhì)量占比）只有（12.87±2.2）%，而野生型含水量為（39.97±2.4）%，相比野生型，突變體的含水量下降了60%以上，表明oscsc11可能會對干熱風(fēng)表現(xiàn)出更敏感的表型。結(jié)合前面體外功能研究證實OsCSC11在高滲刺激（模擬干旱脫水環(huán)境）下通道活性可以被激活，傳導(dǎo)高滲刺激或模擬干旱信號的結(jié)果，可以推測：在水稻抽穗期，oscsc11突變體很可能是由于失去感受外界干熱風(fēng)的脅迫信號和離子通道功能，使得突變體不能將此信號有效地傳遞，導(dǎo)致生理應(yīng)對反應(yīng)缺失，因而出現(xiàn)干旱脫水的表型，由于生殖細胞更為敏感，花藥的表型變化更加劇烈。

2.6.2oscsc11突變體的花粉出現(xiàn)較多敗育現(xiàn)象 表達模式分析的結(jié)果表明OsCSC11在花粉中的表達量極高，且oscsc11突變體花粉含水量低，進一步對野生型和oscsc11突變體的花粉進行了花粉活力的測定。野生型、oscsc11-1和oscsc11-2各取3株不同的植株，每株至少取3個穎花的花粉，通過I2-KI染色試驗發(fā)現(xiàn)，野生型的花粉有 95%以上能被I2-KI很好著色，而oscsc11-1和oscsc11-2突變體只有30%—40%的花粉能被I2-KI著色（圖8-A和圖8-B），通過對花粉形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)，突變體的花粉呈現(xiàn)不規(guī)則的形態(tài)（圖8-A）。同時，oscsc11的花粉含水量比野生型減少了60%以上（圖7-E），表明oscsc11-1和oscsc11-2突變體的花粉活力降低以及形態(tài)異?？赡苁怯捎趪乐孛撍斐傻摹ｋ娚斫Y(jié)果表明OsCSC11是一類高滲刺激（模擬干旱脫水環(huán)境）激活的鈣離子通道，鈣離子在花粉的發(fā)育以及延伸過程中具有非常重要的作用，由此推斷鈣離子在花粉發(fā)育的每一個生理過程中都有著不可替代的特殊作用，而oscsc11-1和oscsc11-2敏感表型則大多出現(xiàn)在中午水稻開花時期，推測OsCSC11缺失導(dǎo)致植株難以感受環(huán)境干熱等不利刺激，沒有啟動相應(yīng)的鈣離子信號和生理應(yīng)對過程，因此影響了水稻花粉正常發(fā)育。

3 討論

鈣離子作為通用的第二信使，參與了干旱、高溫、冷害和鹽害等多種非生物脅迫的逆境信號傳導(dǎo)[3-4]，鈣通道分子可以將胞外不同的逆境刺激轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)特定的鈣信號[35-36]，進而通過鈣信號解碼分子，如：鈣調(diào)素、CBLs、CDK、CIPKs調(diào)控相應(yīng)的生理過程[3,37]。植物的鈣信號編碼器分子與哺乳動物產(chǎn)生鈣信號的分子類似，大致分為兩類，一類是單純的通道，如：CNGCs[38]、GLRs[37,39]等，2019年以來，人們已經(jīng)報道了3種鈣信號編碼復(fù)合體，如CNGC8/7-CNGC18-CaM2/3互作組成的分子開關(guān)，能維持花粉管頂端的鈣波動[33]；而CNGC2-CNGC4-CaMs互作編碼病理原初反應(yīng)的鈣信號[34]；另外CNGC15-NRT1.1組成硝酸根門控的鈣編碼器感應(yīng)硝態(tài)氮濃度的變化[40]，這些都是以 CNGCs為骨架裝配而成的鈣信號編碼器。另一類是2014年發(fā)現(xiàn)的受體類型的鈣離子通道CSCs/OSCAs，它是植物中第一個感受高滲反應(yīng)的受體類蛋白 CSCs家族[7]。同年，另外一個研究組也確認了這一結(jié)果并將其命名為OSCAs[41]，隨后引起了結(jié)構(gòu)生物學(xué)家和動物神經(jīng)生物學(xué)家的追逐與關(guān)注。近幾年，發(fā)現(xiàn)了擬南芥CSCs家族中的AtCSC1、AtCSC2、AtCSC8、AtCSC9和AtCSC14 5個成員，都屬于機械或牽張刺激敏感的陽離子通道[9-10]。目前，有關(guān)水稻CSCs家族蛋白功能的研究很少，只有 OsCSC4被報道與擬南芥 CSC1具有類似的轉(zhuǎn)運功能[26]。本研究鑒定了OsCSC11的功能，明確了OsCSC11作為受體功能結(jié)構(gòu)域和通道功能結(jié)構(gòu)域的差別，發(fā)現(xiàn)了受體結(jié)構(gòu)域抑制通道本身活性的特點，細胞膜的牽張可以消除這種抑制作用，使處于靜息狀態(tài)的OsCSC11通道被激活，這一現(xiàn)象類似動物TRPs蛋白[42-46]，溫度或壓力變化產(chǎn)生瞬時鈣電流或信號，將受體功能與通道功能整合到同一個分子中。這一發(fā)現(xiàn)揭示了作物受體類鈣通道產(chǎn)生或編碼鈣信號的完美分子基礎(chǔ)[47-48]，也為鈣信號編碼的研究提供了更為簡潔的分子開關(guān)模式。

另外，本研究所取得的進展和結(jié)論為理解干熱風(fēng)造成的作物不育和減產(chǎn)提供了新的研究思路，由于干熱風(fēng)的不可預(yù)測性，它是造成小麥等農(nóng)作物減產(chǎn)的重要原因之一，對開花到乳熟期間的小麥危害極大，水稻在揚花期偶遇干熱風(fēng)也會造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害。干熱風(fēng)造成的危害主要是3種物理性的逆境刺激引起，可以分解為干（即干旱）、熱（高溫）和風(fēng)（機械刺激），都影響細胞膜的穩(wěn)定性。因此，干熱風(fēng)造成的傷害實際上是一種擾動細胞膜的機械傷害，從現(xiàn)有的報道已經(jīng)發(fā)現(xiàn)動物 CSCs介導(dǎo)粗粒食物的適口性[11]，哺乳動物的聽覺信號[12]，酵母、人與擬南芥和水稻的 CSCs功能類似[7,9,26]，可以被高滲溶液激活，這些特征背后的本質(zhì)功能就是傳遞機械力造成細胞膜形變效應(yīng)，也就是說物理性刺激導(dǎo)致的任何膜的壓力或動態(tài)變化都有可能激發(fā)CSCs蛋白的通道活性。雖然我們在離體的條件下，只研究了模擬干旱/高滲溶液激活的OsCSC11，結(jié)合已經(jīng)報道的同源蛋白的功能研究和結(jié)構(gòu)解析，有理由推測OsCSC11也很可能被干熱風(fēng)，這類導(dǎo)致細胞膜型變的物理因素激活。當(dāng)然，這需要進一步的研究將干熱風(fēng)這類混合的物理性刺激細分為干旱、高溫和機械刺激，再進一步分辨出這三因素中其中誰是調(diào)控 OsCSC11的主要刺激因素或者三者的綜合效應(yīng)都共同起作用。由于oscsc11突變體植株表現(xiàn)的雄蕊弱小、花藥表面蹙皺、彎曲以及花粉敗育等特征與已經(jīng)多次報導(dǎo)的水稻或小麥等作物遭遇干熱風(fēng)的傷害表型非常相似，因此，有理由相信OsCSC11的缺失阻斷了干熱風(fēng)逆境的感應(yīng)和信號傳遞，不能啟動相應(yīng)的快速應(yīng)對機制，使水稻對抗干熱風(fēng)的能力減弱，因此，造成配子體發(fā)育異常的表型，這種干熱風(fēng)造成的快速失水現(xiàn)象與花粉成熟過程中的脫水是2個不同的生理反應(yīng)，前者是逆境刺激后的被動過程，而后者緩慢的脫水過程屬于自發(fā)的主動反應(yīng)，OsCSC11是否參與主動過程的脫水反應(yīng)尚需進一步研究。這一機制的揭示不僅解釋了水稻雄蕊受干熱風(fēng)傷害，導(dǎo)致減產(chǎn)的原因，也為其它更易被干熱風(fēng)危害的作物，如小麥等作物應(yīng)對不可預(yù)測的干熱風(fēng)造成的危害，提供了基因操作候選分子和研究思路。

4 結(jié)論

OsCSC11通常處于靜息狀態(tài)，可被高滲溶液激活介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流，具有受體和通道雙重功能的作用方式，調(diào)控花藥水分含量和花粉發(fā)育，可能參與了水稻雄蕊應(yīng)對干熱風(fēng)的原初感應(yīng)過程。

致謝：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所路鐵剛研究員課題組在水稻遺傳轉(zhuǎn)化方面給予的幫助，在此感謝。