赤芍的抑菌作用及其防治慢性牙周炎的機制研究

龔 怡，吳澤鈺,2，王 琛，趙 今,2

慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)主要由牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.g)、具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum，F(xiàn).n)和伴放線聚集桿菌(ActinobacillusActinomycetes，A.a)等多種牙周致病菌侵犯牙周組織引起，是一種進行性破壞性疾病，也是導致成年人喪失咀嚼功能的主要原因[1]。牙周致病菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素、蛋白酶可以感染牙周組織并刺激機體產(chǎn)生炎癥細胞因子，介導全身性慢性炎癥[2]。在牙周炎治療領域，中醫(yī)藥因其不良反應小、標本兼治等優(yōu)點引起廣泛關(guān)注[3]。

赤芍是毛茛科植物芍或川赤芍的干燥根，赤芍提取物具有良好的抑菌、抗炎作用[4]。本研究擬探討赤芍提取物對牙周致病菌的體外抑菌活性，并通過網(wǎng)絡藥理學方法研究赤芍治療CP的潛在活性成分和藥理機制。

1 材料與方法

1.1 體外抑菌實驗

1.1.1 主要材料和儀器 酶標儀(賽默飛世爾，美國)；7.0 L密封培養(yǎng)罐、厭氧產(chǎn)氣袋、厭氧指示劑(三菱，日本)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(愛朗，中國上海)；冷凍干燥機(博醫(yī)康，中國北京)；腦心浸液(BD，美國)；瓊脂(Biofroxx，德國)；無菌脫纖維羊血(源葉，中國上海)。

1.1.2 藥材提取 將干燥赤芍藥材(天誠，河北)粉碎后過60目篩制備赤芍粉。稱取500 g赤芍粉，40 ℃環(huán)境下70%乙醇(體積比1∶8)浸提2 h，重復3次，合并浸取液。抽濾后，40 ℃旋蒸，低溫冷凍干燥后將赤芍提取物置4 ℃?zhèn)溆肹5]。

1.1.3 菌株及細菌培養(yǎng) 采用P.gBAA 308、F.nATCC 25586和A.aATCC 700685進行實驗，以上菌株均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)。將菌株復蘇后接種于BHI血瓊脂平板，37 ℃厭氧(80%N2，20%CO2)培養(yǎng)48 h，菌落鑒定后挑取菌落于BHI液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取處于生長對數(shù)期的細菌用于實驗，調(diào)整菌液濃度備用(P.g為1×107CFU/mL，F(xiàn).n為1×107CFU/mL，A.a為1×108CFU/ml)。

1.1.4 最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)及最低殺菌濃度(minimal bactericidal concentration，MBC)測定 赤芍提取物用BHI液體培養(yǎng)基進行倍比稀釋，最終濃度為64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5 g/L。將含不同濃度實驗藥液的無菌BHI液體培養(yǎng)基作為溶劑組；將P.g、F.n菌懸液與實驗藥液按照體積比1∶1，A.a菌懸液與實驗藥液按照體積比1∶9混合作為實驗組，37 ℃厭氧(80%N2，20%CO2)培養(yǎng)48 h后，酶標儀測定OD600 nm，實驗組與溶劑組OD值差值≤0.05的最低濃度為MIC。選擇大于MIC濃度的各孔，接種于BHI固體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，觀察菌落數(shù)少于5個對應的藥物最低濃度為MBC。每組實驗均設置陽性對照組(含0.05%氯己定的菌懸液)、陰性對照組(不含藥物的菌懸液)和空白對照組(不含細菌和藥物的BHI培養(yǎng)基)，重復3次實驗取平均值。

1.2 赤芍中活性成分篩選及靶點預測

使用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫及分析平臺(TCMSP)篩選并整理赤芍化學成分及靶點[6]。篩選條件為口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，化合物類藥性(drug likeness，DL)≥0.18。

1.3 CP靶點的篩選

在Genecards、DrugBank、OMIM數(shù)據(jù)庫以詞“periodontitis，chronic periodontitis”為關(guān)鍵詞檢索，獲得CP靶點，與上述赤芍作用靶點進行韋恩分析，得到赤芍治療CP的潛在作用靶點[7]。

1.4 構(gòu)建“赤芍-成分-靶點-CP”網(wǎng)絡

利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“赤芍-成分-靶點-CP”網(wǎng)絡圖，Network Analyzer計算網(wǎng)絡拓撲參數(shù)，包括度值(degree)、中心度(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)和拓撲系數(shù)(topological coefficient，TC)的相關(guān)信息[8]。

1.5 構(gòu)建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡

STRING 11.0數(shù)據(jù)庫上傳所得的交集靶點，設置“homo sapiens”屬性，置信度得分>0.4，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡圖，連接前10的靶基因作為赤芍治療CP過程的中心基因[9]。

1.6 基因本體(gene ontology，GO)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析

利用Cluster Profiler軟件包對獲得的靶點進行GO富集分析及KEGG富集分析繪圖，閾值P<0.01，篩選有顯著性差異的生物過程和信號通路[10-12]。

2 結(jié) 果

2.1 體外抑菌實驗結(jié)果

赤芍提取物對P.g、F.n、A.a這3種牙周致病菌株均有不同程度的抑菌作用，其中藥物對P.g的抑制作用更強。通過比較OD值差值≤0.05的孔，肉眼可見赤芍提取物濃度2 g/L以上的P.g，濃度4 g/L以上的F.n、A.a孔內(nèi)菌液均呈清亮。測得的MIC、MBC值見表1。

2.2 赤芍化學成分篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出鞣花酸、芍藥苷元、催乳素等赤芍化學成分29個，見表2。

表2 赤芍主要化學成分及參數(shù)

2.3 赤芍與CP的共同靶點

在Genecards、OMIM、DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索得到CP相關(guān)的疾病靶點4 543個，去除重復后得2 132個。赤芍在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到赤芍作用靶點240個，去除重復后得175個。韋恩分析二者交集，獲得赤芍與CP共有靶點89個(表3)，包括環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase 2，COX2/PTGS2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)、MMP8等。

表3 赤芍治療CP的成分作用靶點信息

2.4 “赤芍-成分-靶點-CP”網(wǎng)絡

根據(jù)獲得的交集靶點，對應到赤芍中13個主要化學成分。使用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建的“赤芍-成分-靶點-CP”網(wǎng)絡圖(圖1)中共含節(jié)點105個，邊緣468條。網(wǎng)絡拓撲學結(jié)構(gòu)分析顯示，化合物的平均度數(shù)為4.5，其中度數(shù)較大(度數(shù)>10)的化合物為黃芩素、黃芩苷、β-谷甾醇、豆甾醇、鞣花酸、二甲氧基-2R，將赤芍中的主要化學成分根據(jù)網(wǎng)絡拓撲學結(jié)構(gòu)中的度值從大到小依次進行排列(表4)。

圖1 赤芍-成分-靶點-CP網(wǎng)絡關(guān)系

表4 赤芍化學成分的拓撲學參數(shù)分析

2.5 PPI網(wǎng)絡分析

將89個交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，利用Cytoscape 3.7.2軟件進行網(wǎng)絡拓撲學分析，得到PPI網(wǎng)絡(圖2A)。根據(jù)Count值大小篩選出前30位的靶點(圖2B)，其中前10位分別為是IL6、AKT1、ALB、TNF、VEGFA、TP53、EGFR、CXCL8、PTGS2、FOS(表5)。

A：PPI網(wǎng)絡；B：PPI網(wǎng)絡中的基因邊緣數(shù)排序

表5 赤芍治療CP核心蛋白互作的拓撲學參數(shù)

2.6 GO富集分析

對上述89個交集靶點進行GO富集分析，設置閾值P<0.01，得到126個條目。分析發(fā)現(xiàn)，赤芍可能通過蛋白質(zhì)異構(gòu)化活性、內(nèi)肽酶活性及染色質(zhì)結(jié)合等生物學過程在治療CP中發(fā)揮作用。根據(jù)基因比例繪制富集程度較高的GO條目氣泡圖(圖3)，排列后得出前10條GO條目信息(表6)。

圖3 赤芍治療CP的潛在靶點的GO富集分析

表6 赤芍治療CP的潛在靶點GO富集分析結(jié)果

2.7 KEGG通路富集分析

利用Cluster Profiler軟件包進行KEGG通路富集分析，篩選閾值P<0.01，F(xiàn)DR校正后Q<0.01的條目，共獲得110條結(jié)果。在前20條通路中，包括6條信號通路(MAPK、AGE-RAGE、IL17、TNF、Toll樣受體和松弛素信號通路)、1條生物系統(tǒng)相關(guān)通路(內(nèi)分泌抵抗)和13條疾病通路(乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、美國錐蟲病、弓形蟲病等)(圖4)，其中，前10條通路信息如表7所示。

圖4 赤芍治療CP的潛在靶點的KEGG富集分析

表7 赤芍治療CP的潛在靶點KEGG富集分析(前10條)

3 討 論

赤芍是我國一味傳統(tǒng)中藥，性味苦，具有清熱涼血、活血散瘀之功效。現(xiàn)代藥理學證明，赤芍可以鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化，常作為心血管疾病、保肝和神經(jīng)保護的用藥[13]。薛琴等[14]發(fā)現(xiàn)赤芍提取物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌和耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌等耐藥菌均有一定的抑菌作用。本實驗發(fā)現(xiàn)赤芍提取物對P.g、F.n、A.a這3種牙周主要致病菌的活性均有不同程度的抑制作用，提示我們赤芍可能是治療CP的潛在藥物。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學分析發(fā)現(xiàn)赤芍治療CP作用機制具有多成分、多靶標的特點。赤芍中含有的黃芩苷、β-谷甾醇、鞣花酸等成分參與治療CP。其中黃芩苷具有清熱解毒、抑菌抗炎、螯合金屬離子和抗腫瘤等藥理作用。李會英等[15]發(fā)現(xiàn)應用黃芩苷可以減輕大鼠牙周炎的炎性反應，并且可以降低大鼠牙齦組織中TNF-α mRNA和IL-6 mRNA的水平。β-谷甾醇是一種常見的植物甾醇之一，有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇不僅可以減輕動物模型中血清的IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平，而且可下調(diào)ERK1/2通路[16]。鞣花酸是一種天然存在的多酚化合物，可以通過降低IL-2、IL-8水平以及誘導人β-防御素2等保護劑的表達來保護人牙齦上皮細胞[17]。由疾病靶點互相作用網(wǎng)絡篩選出的IL-6、AKT1、ALB等主要靶點在治療CP中起重要作用。IL-6不僅可以加速破骨細胞形成，而且還參與CP的炎癥過程，抑制牙周膜的再生[18]。蛋白激酶B α(protein kinase B α，PKB α/AKT1)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在體外實驗中證實用AKT的化學抑制劑可降低AKT表達骨保護素[19]。

本研究對赤芍治療CP的89個靶點進行了GO富集分析和KEGG信號通路分析。GO富集分析后獲得的126項條目主要涉及了蛋白質(zhì)異構(gòu)化活性、內(nèi)肽酶活性、染色質(zhì)結(jié)合等生物學過程，與核因子κB1(nuclear factor kappa-B，NF-κB1/p50)、MMP9等基因相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB1主要在蛋白質(zhì)異構(gòu)化活性和染色質(zhì)結(jié)合過程中發(fā)揮作用。NF-κB是以p65/p50亞單位蛋白異構(gòu)化形成的二聚體蛋白，是參與治療牙周炎潛在分子機制的核心轉(zhuǎn)錄因子[20]。芍藥苷是赤芍的組成成分，實驗證明芍藥苷可以使LPS刺激的細胞中NF-κB表達水平明顯降低，減少炎癥因子的產(chǎn)生[21]。MMP9是一種蛋白質(zhì)水解酶，具有螺旋和變性膠原束的能力，可破壞牙周組織[22]，使用絲氨酸水解酶抑制劑后，MMP9的表達降低[23]。此外，通過KEGG富集分析獲得了110條相關(guān)通路，赤芍在治療CP時與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、AGE-RAGE、IL-17等通路相關(guān)性較高，涉及多條重要信號通路參與，主要在炎癥機制調(diào)節(jié)、血管內(nèi)皮損傷、細胞分化方面發(fā)揮作用。不僅如此，赤芍中的主要活性成分還可能作用于KEGG富集到的因子從而調(diào)控多種疾病通路(如乙肝、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、結(jié)核病等)。有學者研究發(fā)現(xiàn)激活MAPK通路及IL-17通路可促進下游的炎癥因子IL-6、TNF-α分泌，也可促進破骨細胞前體細胞分化[24-25]。RAGE在炎癥反應區(qū)域內(nèi)可導致血管功能障礙、促炎激酶的活化，激活AGE-RAGE通路可釋放NF-κB，從而刺激多種炎癥因子生成，炎癥介質(zhì)的釋放為慢性牙周炎的形成提供了可能[26]。

綜上所述，本研究表明了赤芍提取物對牙周致病菌有很好的抑制作用，并且間接預測了赤芍治療CP的活性成分、靶點和通路，不僅為臨床開發(fā)新藥提供思路和依據(jù)，也為其有效成分篩選和作用機制的研究提供參考。