斑馬魚PKR剪接異構(gòu)體克隆、鑒定及轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析①

歐湘瀅 邵 敏 高宗澤 代衛(wèi)凱 熊嘉鴻 胡有生

（井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部，吉安343009）

非特異免疫是脊椎動物抵抗病毒侵入的第一道防線，干擾素系統(tǒng)則是機(jī)體非特異免疫抵抗感染和清除病毒的主要功能分子體系，而斑馬魚PKR（zebrafish double-stranded RNA-dependent protein ki‐nase，ZPKR）是干擾素系統(tǒng)抗病毒作用的主要效應(yīng)分子［1-6］。PKR可識別和結(jié)合病毒的雙鏈RNA，然后通過二聚化和自磷酸化激活其自身的蛋白激酶活性［4-5，7-9］。活化的PKR能夠磷酸化真核細(xì)胞翻譯起始因子2α（eIF2α），從而使其失去蛋白翻譯起始活性，導(dǎo)致蛋白翻譯起始的失敗，引起蛋白翻譯的抑制［5，7-11］。PKR一方面能抑制病毒RNA的復(fù)制，另一方面能抑制病毒和宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成。最終導(dǎo)致病毒繁殖的抑制和感染病毒細(xì)胞的凋亡，并引起機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)，限制病毒在體內(nèi)的擴(kuò)散［8-11］。近年來，有研究認(rèn)為PKR還能在某些病理條件下激活炎性體，并且認(rèn)為，PKR可能與過度營養(yǎng)導(dǎo)致的肥胖、高血壓和糖尿病等密切相關(guān)，但其分子機(jī)制并不清楚［12-17］。

PKR分子由N端的雙鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（dou‐ble-stranded RNA binding domain，dsRBD）和C端的激酶結(jié)構(gòu)域（kinase domain，KD）串聯(lián)而成［5，7，9，18］。PKR的dsRBD和KD通過一個鏈接區(qū)（Linker）連接起來。人類PKR的dsRBD和KD之間的鏈接區(qū)是一個非結(jié)構(gòu)化的長度大約為80個氨基酸的序列［5，9，19］。不同物種的PKR的鏈接區(qū)長度具有一定差異［20］。定點(diǎn)刪除這個鏈接區(qū)后，人的PKR活性發(fā)生一定的改變，它與RNA的協(xié)同結(jié)合更為有效，整體結(jié)構(gòu)更為伸展，但結(jié)構(gòu)域之間的相互作用卻變得微弱［21］。完全刪去鏈接區(qū)，PKR仍具有活性。有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，完全刪除PKR的N端，包括dsRBD和鏈接區(qū)，單獨(dú)的KD仍然具有磷酸化eIF2α的作用，但是不能對雙鏈RNA發(fā)生反應(yīng)［22-23］。說明dsRBD和鏈接區(qū)主要是對KD活化起調(diào)節(jié)作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，PKR的dsRBD能夠與5′端三磷酸的單鏈RNA結(jié)合并引起PKR的活化，但其研究并沒有排除這種結(jié)合是否有鏈接區(qū)的參與［24］。MAYO等［25］最新研究認(rèn)為，PKR與單鏈RNA的結(jié)合是由于鏈接區(qū)有一段富含堿性氨基酸的Basic Region的作用。富含堿性氨基酸的區(qū)域帶較多正電荷，能夠與單鏈RNA帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)結(jié)合，并由此促進(jìn)KD的二聚化和活化。

本研究小組在斑馬魚胚胎組織中，不僅克隆了ROTHENBURG等［26］克隆到的含有3個dsRBM的ZPKR（AM421527.1），還克隆到了含有N端dsRBD和C端KD之間的鏈接區(qū)異常的ZPKR剪接異構(gòu)體（zebrafish PKR transcript variant，ZPKRV）的mRNA（MH425504.1）。通過分析發(fā)現(xiàn)，其鏈接區(qū)缺失了28個氨基酸序列。而其缺失的28個氨基酸剛好包括了鏈接區(qū)的堿性氨基酸區(qū)域。在斑馬魚細(xì)胞內(nèi)含有兩種不同的PKR，它們僅僅在鏈接區(qū)的長度上具有差異，這是在所有動物中首次發(fā)現(xiàn)的。至于它們是否在斑馬魚抗病毒免疫反應(yīng)中具有不同的功能，仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 本研究使用的斑馬魚購買于中國科學(xué)院水生生物研究所斑馬魚資源中心，由本校江西省發(fā)改委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江西省人類疾病斑馬魚模型與藥物篩選工程實(shí)驗(yàn)室繁育。

1.1.2 主要試劑與儀器 Taq DNA聚合酶、Prime‐star DNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶（Xho I和EcoR I）、DL2000 Marker購于TaKaRa公司；瓊脂糖（Agarose）、無水乙醇、異丙醇、DEPC（焦碳酸二乙酯）均購于上海生工生物工程有限責(zé)任公司。RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于TaKaRa公司。美國ABI公司PCR儀、美國Thermo公司微型高速離心機(jī)、上海博迅立式壓力蒸汽滅菌器（XQ-LS-100G）、蘇州凈化超凈工作臺（SW-CJ-ED）、杭州奧盛三聯(lián)多用途金屬浴、上海天能EPS300電泳儀等。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索ZPKR基因（GenBank序列號：AM421527.1）序列，通過NCBI的在線保守結(jié)構(gòu)域搜索系統(tǒng)CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi），確定ZPKR的N端3個dsRBM和激酶結(jié)構(gòu)域位置，根據(jù)ZPKR和ZPKRV（MH425504.1）序列及其差異設(shè)計ORF克隆引物和qPCR的引物，見表1。

1.2.2 提取P oly I：C刺激不同時間的斑馬魚組織總RNA 為了進(jìn)一步研究ZPKR在抗病毒免疫反應(yīng)中RNA表達(dá)水平的變化，本實(shí)驗(yàn)購買人工合成的dsRNA類似物Poly I：C模擬病毒RNA對斑馬魚進(jìn)行刺激實(shí)驗(yàn)。斑馬魚被置于本實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（所選個體均為健康斑馬魚）。按500μg/100 g劑量腹部注射Poly I：C，每條斑馬魚稱重約為0.5 g。使用濃度為1 mg/ml的Poly I：C，則斑馬魚注射的劑量為2.5μ/l條。選取注射后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h這5個時間段，隨機(jī)選取2條為一組提取斑馬魚組織總RNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。同時利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

表1 本研究使用的引物序列表Tab.1 List of primer sequences used in this study

1.2.3 半定量檢測Poly I：C刺激不同時間的ZPKR和ZPKRV轉(zhuǎn)錄表達(dá) 為了檢測斑馬魚總RNA和cD‐NA質(zhì)量，以及初步了解ZPKR和ZPKRV表達(dá)差異，cDNA被用作對β-actin、ZPKR與ZPKRV之和及ZPKR進(jìn)行PCR檢測。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1.00μl、ddH2O18.25μl、buffer 2.50μl、dNTP2.00μl、上下游引物分別0.50μl、Taq DNA聚合酶0.25μl。qPCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃10 min，95℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，72℃7 min，反應(yīng)28個循環(huán)。其中ZPKR+ZPKRV用的引物對是ZPQF和ZPQR；ZPKR用的引物對是ZPQ2F和QZP2R；β-actin用的引物對是ZACTINF和ZACTINR。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后對瓊脂糖凝膠成像。

1.2.4 qPCR檢測Poly I：C刺激不同時間的ZPKR和ZPKRV轉(zhuǎn)錄表達(dá) 為了進(jìn)一步區(qū)分ZPKR和ZPKRV的表達(dá)差異，用qPCR對β-actin、ZPKR與ZPKRV之和及ZPKR進(jìn)行檢測。目的基因和β-actin基因的qPCR反應(yīng)體系，總體積20μl：SYBR 10μl；定量引物（F+R）0.8μl；ddH2O7.2μl；cDNA模板2μl。每個cDNA樣品做3個重復(fù)，同時每個cDNA樣品做3個β-actin對照。制備兩種預(yù)混液，一是目的基因的預(yù)混液，包括SYBR、ddH2O、目的基因定量的上游引物和下游引物；另一個是β-actin的預(yù)混液，包括SYBR、ddH2O、β-actin基因定量的上游引物和下游引物。

qPCR反應(yīng)參數(shù)：95℃5 min，95℃20 s，55℃30 s，72℃30 s，72℃7 min，40個循環(huán)。用2-ΔΔCt方法計算檢測基因相對β-actin的表達(dá)倍數(shù)，數(shù)據(jù)都以±s表示。分別計算出ZPKR+ZPKRV和ZPKR各時間的相對定量數(shù)據(jù)，再用ZPKR+ZPKRV的數(shù)據(jù)減去ZPKR的數(shù)據(jù)，可以得到ZPKRV的定量數(shù)據(jù)。定量引物對同1.2.3。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)通過SPSS16.0統(tǒng)計分析，Poly I：C刺激后在0 h、6 h、12 h、24 h、48 h的ZPKR和ZPKRV的表達(dá)是否存在差異，該定量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZPKR和ZPKRV克隆和結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)ROTHENBURG克隆的ZPKR序列設(shè)計克隆其ORF的引物，用斑馬魚cDNA為模板，將擴(kuò)增的片段構(gòu)建到pET32a上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進(jìn)行測序。測序分析得到了2個不同的ZPKR。其中ROTHEN‐BURG等［26］克隆的ZPKR的ORF全長2 049 bp，編碼682個氨基酸殘基，ZPKRV的ORF全長1 965 bp，編碼654個氨基酸殘基。ZPKRV比ZPKR的ORF短84 bp，相應(yīng)的氨基酸序列則短28個氨基酸序列。通過將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，并用SMART預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖1所示。這兩種斑馬魚PKR的N端的dsRBD都含有3個dsRBM，C端都有1個KD。兩者的差異僅僅是N端和C端之間的鏈接區(qū)長度的差異。ZPKRV在其dsRBD和KD的鏈接區(qū)中，缺少了28個氨基酸序列（圖1B）。圖的橫線位置為qPCR引物設(shè)計所對應(yīng)位置。因此，用引物對ZPQF、ZPQR既可對ZPKR的片段進(jìn)行擴(kuò)增，又可對ZPKRV的片段進(jìn)行擴(kuò)增；而引物對ZPQ2F、QZP2R只能對ZPKR的片段進(jìn)行擴(kuò)增。

2.2 ZPKR和ZPKRV氨基酸序列比對圖 通過對ZPKR和ZPKRV的氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)兩者除linker缺少28個氨基酸外，ZPKR與ZPKRV的序列完全一致。而這缺少的28個氨基酸序列，恰好正是堿性氨基酸的聚集區(qū)（圖2）。

2.3 半定量檢測Poly I：C刺激下ZPKR+ZPKRV和ZPKR在不同時期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異 圖3結(jié)果顯示，斑馬魚在Poly I：C刺激后，ZPKR+ZPKRV和ZPKR的轉(zhuǎn)錄表達(dá)在12 h都會明顯上調(diào)，其中ZPKR在刺激24 h又會下調(diào)，然后48 h又升高。說明在Poly I：C刺激過程中，ZPKR和ZPKRV的表達(dá)都發(fā)生了變化，但并不清楚ZPKRV的變化規(guī)律。

圖1 ZPKR和ZPKRV結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of ZPKR and ZPKRV struc?tures

圖2 ZPKR和ZPKRV的鏈接區(qū)氨基酸序列比對圖Fig.2 Amino acid sequence alignment of linker of ZPKR and ZPKRV

圖3 斑馬魚Poly I：C刺激后不同時段的ZPKR+ZPKRV、β-actin和ZPKR的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR products of ZP?KR+ZPKRV，β-actin，and ZPKR at different time after Poly I：C stimulation to Zebrafish

圖4 ZPKR和ZPKRV的qPCR分析Fig.4 Fluorescence qPCR analysisof ZPKR and ZPKRV

2.4 qPCR檢測ZPKR與ZPKRV相對β-actin的表達(dá) 所有數(shù)據(jù)在Mastercycler ep realplex上分析（圖4）。ZPKR在Poly I：C刺激的各時間段的表達(dá)趨勢與半定量的瓊脂糖電泳的一致，有2個上調(diào)過程：12 h時有第1個上調(diào)峰，然后24 h下調(diào)，再在48 h上調(diào)。ZPKRV表達(dá)總體遠(yuǎn)低于ZPKR，并且只有1個上調(diào)峰，在Poly I：C刺激后24 h到達(dá)峰值，然后48 h又下調(diào)。而且，ZPKRV上調(diào)的最高點(diǎn)正好是ZPKR第1次上調(diào)后往下調(diào)點(diǎn)，即刺激后的24 h。ZPKR和ZP‐KRV相對β-actin表達(dá)量的比值在0 h、6 h、12 h、24 h、48 h分別是11.49、12.95、11.50、3.08、17.78，刺激后24 h比值最小，刺激后48 h比值最大。

2.5 ZPKR和ZPKRV的mRNA表達(dá) 經(jīng)統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZPKRV在0 h和24 h的mRNA表達(dá)水平存在顯著差異（P＜0.05），0 h的ZPKR分別與12 h、24 h和48 h的mRNA表達(dá)水平存在顯著差異（P＜0.05），而24 h的ZPKRV和ZPKR的mRNA表達(dá)水平存在顯著差異（P＜0.05）。

3 討論

在斑馬魚基因組內(nèi)，雖然同時存在等位基因ZPKRa（基因登錄號：AM421526.1）和ZPKRb（基因登錄號：AM421527.1），但兩者的核苷酸序列相差很小，氨基酸序列則只有5個氨基酸的差異，且都不在關(guān)鍵的位點(diǎn)［26］。除此之外，本研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚細(xì)胞內(nèi)還同時存在ZPKR和ZPKRV（基因登錄號：MH425504.1）兩種不同結(jié)構(gòu)的PKR的表達(dá)，ZPKRV僅僅在鏈接區(qū)缺失28個氨基酸殘基，其中包含缺失鏈接區(qū)內(nèi)的功能模體堿性區(qū)。

PKR可被多種內(nèi)源性和外源性RNA激活［27-28］。PKR還可以和含有5′端不同修飾的RNA結(jié)合并被激活［29］。NALLAGATLA等［29］研究證實(shí)，含有5′三磷酸的有限結(jié)構(gòu)化RNA能與PKR的dsRBD結(jié)合并激活PKR。MAYO等［25］研究證實(shí)，人PKR能結(jié)合單鏈RNA并被單鏈RNA激活，含有5′三磷酸的單鏈RNA能與人PKR的dsRBD及堿性區(qū)結(jié)合并活化PKR。并提出，含有有限結(jié)構(gòu)化的RNA通過與PKR的dsRBD和堿性區(qū)發(fā)生二價結(jié)合，進(jìn)而提高其結(jié)合親和力，增強(qiáng)PKR的二聚化活化。因此，失去了鏈接區(qū)的堿性區(qū)的ZPKRV，可能失去單鏈RNA結(jié)合作用，從而失去與某些情況下產(chǎn)生的具有5′三磷酸帽結(jié)構(gòu)的mRNA結(jié)合，避免了PKR的活化和eIF2α的磷酸化作用，從而促進(jìn)mRNA的翻譯，起到對蛋白翻譯的促進(jìn)作用［24-25，29］。

當(dāng)斑馬魚細(xì)胞內(nèi)同時表達(dá)ZPKR和ZPKRV時，ZPKR和ZPKRV可結(jié)合在同一RNA分子上，并發(fā)生異二聚化，導(dǎo)致顯性的負(fù)效應(yīng)［30］。由于ZPKR和ZP‐KRV的dsRBD是完全一樣的，都可以結(jié)合RNA，但是它們的鏈接區(qū)長度不一樣，不能使KD發(fā)生二聚化，從而不能使激酶活性激活，不能磷酸化eIF2α，不能抑制蛋白翻譯。因此，當(dāng)ZPKR和ZPKRV同時表達(dá)時，雖然總的PKR量表達(dá)上升，但導(dǎo)致總體PKR抑制蛋白翻譯的作用降低，可以有效促進(jìn)蛋白翻譯過程。

用人工合成的Poly I：C刺激斑馬魚，ZPKR的轉(zhuǎn)錄表達(dá)在12 h內(nèi)完成1次上調(diào)然后降低，然后在48 h又上調(diào)；而ZPKRV則只在Poly I：C刺激后24 h表達(dá)上調(diào)然后降低。因此推測，斑馬魚體內(nèi)這2種PKR的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，其翻譯表達(dá)的產(chǎn)物將在刺激后24 h共存于細(xì)胞內(nèi)，通過顯性的負(fù)效應(yīng)，可能減弱其PKR上調(diào)后對蛋白翻譯的抑制作用［30-32］。事實(shí)上，qPCR結(jié)果顯示，在Poly I：C刺激后的24 h，ZPKRV表達(dá)達(dá)到峰值，并且ZPKR和ZPKRV的比值最小，為3.08。這時兩者的相互作用產(chǎn)生的顯性負(fù)效應(yīng)最大，對蛋白翻譯抑制作用最小。斑馬魚體內(nèi)與抗病毒免疫相關(guān)的細(xì)胞因子，包括PKR、白介素、趨化因子、腫瘤壞死因子以及多種類型的干擾素等，隨后的翻譯表達(dá)就會有效的提高，從而增強(qiáng)細(xì)胞的抗病毒免疫能力［33-34］。

ZPKR和ZPKRV蛋白的相互作用，可用免疫共沉淀方法來進(jìn)行研究，但由于ZPKR和ZPKRV兩者差異太小，并且差異區(qū)域?yàn)榉墙Y(jié)構(gòu)化區(qū)域，要制備具有區(qū)分效果的單克隆抗體有難度。另外，在斑馬魚細(xì)胞系中以不同比例過表達(dá)ZPKR和ZPKRV，并且可檢測到被ZPKR抑制的特定蛋白翻譯水平，可以間接證實(shí)ZPKR和ZPKRV相互作用調(diào)控蛋白翻譯的功能。以上實(shí)驗(yàn)都需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究首次發(fā)現(xiàn)了ZPKRV，并且與ZPKR同時存在于斑馬魚體內(nèi)。與ZPKR相比，ZPKRV僅在鏈接區(qū)缺失了與單鏈RNA結(jié)合作用相關(guān)的堿性區(qū)。進(jìn)一步定量分析顯示，ZPKRV可能通過失去與單鏈RNA的結(jié)合作用，與ZPKR異二聚化導(dǎo)致顯性的負(fù)效應(yīng)，從而增強(qiáng)抗病毒免疫相關(guān)蛋白的翻譯。