SH2B1通過活化PI3K/Akt通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖

劉 巖 韓風(fēng)偉 閆麗娜 張琳娜 王淮興

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，承德067000）

膠質(zhì)瘤源自腦神經(jīng)上皮細(xì)胞惡性病變，是最為常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，占顱腦腫瘤的40%～50%［1-2］。3-磷酸肌醇激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（protein-ser‐ine-threonine kinase，Akt）作為經(jīng)典的信號(hào)通路，在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用［3］。SH2B1是SH2B家族成員，是一類含有SH2和PH結(jié)構(gòu)域的信號(hào)接頭蛋白，在機(jī)體生長發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、增強(qiáng)神經(jīng)因子誘導(dǎo)方面發(fā)揮調(diào)控作用［4-5］。近年來研究顯示，SH2B1基因在食管癌、非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤組織中高表達(dá)，提示其可能與癌癥發(fā)生有關(guān)［6-7］。但有關(guān)SH2B1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)尚未有研究，因此本研究以膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞為研究對(duì)象，利用siRNA干擾技術(shù)沉默SH2B1基因表達(dá)，觀察U87細(xì)胞增殖、凋亡及PI3K/Akt通路的改變，旨在為SH2B1在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的效應(yīng)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞（CCY1528）購自上海酶研生物科技有限公司。10%胎牛血清、青霉素-鏈霉素、胰酶、RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Trizol抽提試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA試劑盒購自BioRad公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；SH2B1-siRNA、NC-siR‐NA購自南京銳真生物技術(shù)有限公司；CCK8相關(guān)試劑購自美國Sigma公司；鼠源一抗SH2B1、Ki67、PC‐NA、Bax、Bcl-2、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、GAPDH、羊抗鼠二抗購自上海圣克魯斯生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U87細(xì)胞培養(yǎng)基為含100 U/ml青霉素-鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以2.0×105個(gè)/孔接種于24孔細(xì)胞板，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)分為3組：SH2B1-siRNA轉(zhuǎn)染組（正義 鏈5′-GCCGGUCAUGUCCAAAGUATT-3′，反義鏈5′-UACUUUGGACAUGACCGGCTT-3′）；NC-siRNA組（正義鏈5′-GATCCGGACCACCGCATCTCT-3′，反義鏈5′-GCCTGGTGGCGTAGAGATGTA-3′）和未經(jīng)處理的膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞為空白組。轉(zhuǎn)染48 h后收集各組轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，提取總RNA及總蛋白供后續(xù)研究使用。

1.2.3 qRT-PCR檢測SH2B1 mRNA表達(dá) 收集1.2.2中各組U87細(xì)胞，提取總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，通過逆轉(zhuǎn)錄buffer 2μl，上游引物0.2μl，下游引物0.2μl，dNTP 0.1μl，逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，DEPCS水2μl，總體積為10μl的反應(yīng)體系得到cRNA。后利用qRT-PCR試劑盒檢測各組細(xì)胞中SH2B1 mRNA表達(dá)情況。以GAPDH為內(nèi)參基因，反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)處理30 s，59.5℃30 s，72℃1 min，72℃5 min，以上3步驟循環(huán)40次。引物序列見表1。

1.2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 收集1.2.2中各組U87細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種于96孔板，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入10μl濃度為1.5 mg/ml的CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，讀取吸光度值（A），測定時(shí)以未接種細(xì)胞只加培養(yǎng)基孔的A值為空白對(duì)照調(diào)零。

1.2.5 平板克隆法檢測細(xì)胞增殖 收集1.2.2中各組U87細(xì)胞，胰蛋白酶消化、重懸，梯度稀釋后接種至含RPMI1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中（1 000個(gè)/皿），移液器吹打分散均勻，置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，待出現(xiàn)肉眼可見克隆后，棄去上清，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色，20 min后，清洗染色液，空氣干燥。計(jì)數(shù)3組細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.2.6 細(xì)胞凋亡情況檢測 收集1.2.2中各組U87細(xì)胞，胰蛋白酶消化，預(yù)冷PBS洗滌2次，離心棄上清，配制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，100μl細(xì)胞懸液加入5μl AnnexinV‐FITC和5μl PI混勻，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達(dá)情況 收集1.2.2中各組U87細(xì)胞，提取總蛋白，通過BCA蛋白試劑盒檢測細(xì)胞中總蛋白含量，蛋白總上樣量為60μg，10%SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。封閉完成后加入適宜 濃 度SH2B1、Ki67、PCNA、Bax、Bcl-2、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt一抗，4℃封閉過夜，24 h后吸取一抗，清洗PVDF膜后，加入相應(yīng)二抗（山羊抗鼠）37℃封閉1 h，滴加ECL顯色液，用凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白條帶圖片，用Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍照，對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行定量分析，以GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較行方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 si-SH2B1抑制SH2B1表達(dá) 與空白組相比，NC-siRNA組SH2B1 mRNA及SH2B1蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），SH2B1-siRNA組SH2B1 mRNA及SH2B1蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05，圖1）。

2.2 s i-SH2B1抑制U87細(xì)胞增殖 CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，與空白組相比，SH2B1 siRNA組48 h、72 h后OD值顯著降低（P＜0.05）；與NC-siRNA組相比，SH2B1siRNA組轉(zhuǎn)染后48 h、72 h后OD值顯著降低（P＜0.05）。而空白組與NC-siRNA組各時(shí)間點(diǎn)OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2）。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers

2.3 si-SH2B1抑制U87細(xì)胞平板克隆形成數(shù) 與空白組相比，SH2B1-siRNA組克隆形成個(gè)數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與NC-siRNA組相比，SH2B1-siRNA組克隆形成個(gè)數(shù)顯著降低（P＜0.05）（圖3、4）。而空白組與NC-siRNA組克隆形成個(gè)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 si-SH2B1促進(jìn)U87細(xì)胞凋亡 與空白組相比，SH2B1-siRNA組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與NC-siRNA組相比，SH2B1-siRNA組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05，圖5、6）。空白組與NC-siRNA組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組U87細(xì)胞中SH2B1 mRNA及蛋白表達(dá)情況Fig.1 Expression of SH2B1 mRNA and protein in U87 cells of each group

圖2 各組不同時(shí)間增殖情況比較Fig.2 Comparison of proliferation in each group at differ?ent time

圖3 平板克隆法檢測各組U87細(xì)胞增殖情況Fig.3 Proliferation of U87 cells in each group was detect?ed by plate cloning method

2.5 si-SH2B1抑制Ki67、PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bax蛋白表達(dá) 與空白組相比，SH2B1-siRNA組Ki67、PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），Bax蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與NC-siRNA組相比，SH2B1-siRNA組Ki67、PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），Bax蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，圖7）?？瞻捉M與NC-siRNA組Ki67、PCNA、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.6 si-SH2B1抑制p-PI3K/PI3K、p-Ak/tAkt表達(dá)與空白組相比，SH2B1-siRNA組p-PI3K/PI3K、p-Ak/tAkt表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與NC-siRNA組相比，SH2B1-siRNA組p-PI3K/PI3K、p-Ak/tAkt表達(dá)顯著降低（P＜0.05，圖8）。空白組和NC-siRNA組p-PI3K/PI3K、p-Ak/tAkt表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 各組U87細(xì)胞克隆形成數(shù)比較Fig.4 Comparison of number of U87 cell clone formation in each group

圖5 各組U87細(xì)胞凋亡率比較Fig.5 Comparison of apoptosis rate of U87 cells in each group

圖6 各組U87細(xì)胞凋亡率比較Fig.6 Comparison of apoptosis rate of U87 cells in each group

圖7 各組U87細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.7 Expression of proliferation and apoptosis related proteins in U87 cells of each group

圖8 各組PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.8 Expression of PI3K/Akt pathway related proteins in each group

3 討論

SH2B1作為SH2B家族新成員，含有SH2與PH結(jié)構(gòu)域的信號(hào)接頭蛋白，在生長發(fā)育、代謝平衡等方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［8］。SH2B1是酪氨酸激酶受體A與細(xì)胞膜相連的結(jié)合蛋白，主要介導(dǎo)含酪氨酸磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，存在于下丘腦、肝臟、脂肪等多種組織及細(xì)胞中［9］。關(guān)于SH2B1的研究多集中在糖尿病及肥胖癥中，SH2B1參與胰島素敏感性及血糖平衡的調(diào)節(jié)，且可調(diào)節(jié)能量代謝及體重［10］。研究顯示，SH2B1參與神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)的神經(jīng)分化，猜測SH2B1在顱腦疾病中發(fā)揮作用［11］。SH2B1在非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，且發(fā)揮促癌基 因 的 作 用［6，12］。 本 研 究 采 用siRNA靶 向 沉 默SH2B1基因表達(dá)策略，探討SH2B1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的效應(yīng)及可能機(jī)制。

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡失衡有關(guān)［13］。細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡均是由一系列基因級(jí)聯(lián)控制的過程［14］。本研究中，與空白組及NC-siRNA比較，SH2B1-siRNA組U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h、72 h U87細(xì)胞增殖率、克隆形成數(shù)顯著降低，凋亡率顯著升高，提示沉默SH2B1基因表達(dá)可抑制U87細(xì)胞增殖，促進(jìn)U87細(xì)胞凋亡，表明SH2B1通過影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡參與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展。Ki67及PCNA與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，Ki67是增殖相關(guān)的核抗原，與細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān)，在細(xì)胞增殖過程中必不可少［15］；PCNA只存在于正常增殖細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞DNA合成密切相關(guān)，是細(xì)胞異常增殖的關(guān)鍵蛋白［16］。Bax、Bcl-2具有同源性，均屬于Bcl-2基因家族，Bax主要發(fā)揮促凋亡作用，Bcl-2發(fā)揮抑制凋亡作用［17］。本研究中，與空白組及NC-siR‐NA組相比，SH2B1-siRNA組U87細(xì)胞Ki67、PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，Bax蛋白表達(dá)顯著升高，進(jìn)一步提示沉默SH2B1表達(dá)可抑制U87細(xì)胞增殖，促進(jìn)U87細(xì)胞凋亡。

研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路在肝癌、乳腺癌等多種腫瘤中失調(diào)，主要表現(xiàn)為PI3K及Akt過度活化［18-19］。PI3K含有p85和p110兩部分，其中p85羧基端有SH2結(jié)構(gòu)域，p85與p110在SH2區(qū)結(jié)合，Akt是PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的中樞，其活化與腫瘤惡性進(jìn)展有關(guān)［15］。Akt共含有3個(gè)亞基：N端的PH結(jié)構(gòu)域、中間的激酶/催化結(jié)構(gòu)域、C端的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，其中PH結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)Akt進(jìn)行膜轉(zhuǎn)位，進(jìn)而激活A(yù)kt。PI3K可通過激活下游靶點(diǎn)Akt，通過磷酸化作用使其轉(zhuǎn)化為p-Akt，進(jìn)而激活或抑制下游基因表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡。LU等［20］研究顯示，SH2B1過表達(dá)可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路活化降低海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。另有研究顯示，Akt磷酸化可調(diào)控Bax、Bcl-2表達(dá)發(fā)揮抗凋亡作用［21］。在本研究中，與空白組及NC-siRNA組相比，SH2B1-siRNA組p-PI3K/PI3K、p-Ak/tAkt表達(dá)顯著下降，提示沉默SH2B1基因可能通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路活化，從而抑制U87細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

該研究為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供了新思路，但本研究也存在一定不足，膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡由多基因、多通路共同調(diào)控，是十分復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。