線性泛素化修飾對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用研究進(jìn)展①

張 勇 張令強(qiáng) 劉翠華 （中國(guó)科學(xué)院微生物研究所病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100101）

作為一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后調(diào)控機(jī)制，泛素化修飾在炎癥、免疫、感染、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［1］。泛素化修飾是由76個(gè)氨基酸殘基組成的泛素分子經(jīng)E1泛素激活酶、E2泛素耦合酶以及E3泛素連接酶三步催化反應(yīng)連接到底物蛋白上的過(guò)程，可調(diào)節(jié)底物蛋白的穩(wěn)定性、活性以及生物學(xué)功能。E1激活并將泛素分子轉(zhuǎn)移到E2，而E3通過(guò)選擇性招募底物蛋白并將E2上的泛素分子轉(zhuǎn)移到底物蛋白上形成泛素鏈，E1、E2和E3共同作為泛素書寫器（writ‐er）催化泛素化修飾的產(chǎn)生［2］。泛素化修飾是動(dòng)態(tài)、可逆的過(guò)程，去泛素化酶（DUBs）可作為擦除器（eraser）水解底物蛋白上的泛素鏈，反向調(diào)節(jié)底物蛋白的生物學(xué)功能［3］。此外，多種含泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ubiquitin-binding domains，UBDs）的蛋白可作為閱讀器（Reader）識(shí)別泛素化修飾產(chǎn)生的泛素信號(hào)［4］。泛素書寫器、擦除器以及閱讀器作為泛素系統(tǒng)的重要組分共同維持泛素系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)平衡并進(jìn)而調(diào)節(jié)一系列重要生物學(xué)功能。

人類泛素系統(tǒng)包含2種E1、約40種E2、超過(guò)600種E3、約100種DUBs以及20多種UBDs。根據(jù)E3特定結(jié)構(gòu)域以及催化泛素分子轉(zhuǎn)移到底物蛋白上的方式，可以將其分為三種類型：RING（really in‐teresting new gene），HECT（homologous to the E6AP carboxyl terminus）以 及RBR（RING-in-between-RING）［5］。人類基因組中包含約600種RING型E3、28種HECT型E3以及14種RBR型E3。RING型E3含有典型的能結(jié)合鋅的RING或者U-box結(jié)構(gòu)域，能通過(guò)單體或二聚體結(jié)合Ub-E2并將E2上的泛素分子直接轉(zhuǎn)移到底物蛋白上。HECT型E3含有保守的HECT結(jié)構(gòu)域，通過(guò)其HECT結(jié)構(gòu)域的氨基端與Ub-E2結(jié)合并催化泛素分子轉(zhuǎn)移到其羧基端的半胱氨酸殘基上，再將泛素分子轉(zhuǎn)移到底物上。RBR型E3含有RING1、RING2以及IBR（in-between-RING）結(jié)構(gòu)域，RING1能結(jié)合E2-Ub并催化泛素分子轉(zhuǎn)移到RING2上的半胱氨酸殘基上，再將泛素分子轉(zhuǎn)移到底物蛋白上完成泛素化修飾過(guò)程［6］。泛素系統(tǒng)以其編碼信號(hào)的復(fù)雜性和多樣性廣泛參與對(duì)生命活動(dòng)不同階段的調(diào)節(jié)，并通過(guò)不同的調(diào)節(jié)機(jī)制嚴(yán)格調(diào)控多種生物學(xué)過(guò)程。泛素分子在E3的催化作用下能發(fā)生單泛素化和多聚泛素化修飾。多聚泛素化修飾根據(jù)其形成泛素鏈的氨基酸殘基可以分為8種不同的 類型（M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）［7-8］。不同類型的泛素鏈之間能以多種組合類型形成混合泛素鏈。而泛素分子本身的活性也可以被其他類型的翻譯后修飾所調(diào)節(jié)，如磷酸化、乙酰化和蘇木化等。不同類型的泛素化修飾決定了底物蛋白的不同命運(yùn)［9-10］。例如，K48泛素化修飾通常作為降解信號(hào)促進(jìn)底物蛋白通過(guò)蛋白酶體降解，而K63泛素化修飾則主要調(diào)控底物蛋白的活性。不同于賴氨酸（lysine，K）介導(dǎo)的泛素鏈形成，線性泛素化修飾是泛素分子通過(guò)第1位的甲硫氨酸與另一個(gè)泛素分子第76位的甘氨酸相連形成多聚泛素鏈的一種新型多聚泛素化修飾類型［11］。細(xì)胞中的線性泛素鏈約占所有泛素鏈的0.5%。果蠅中鑒定出的LUBEL（linear ubiquitin E3 ligase）也具有線性泛素酶活性［12］，提示線性泛素化修飾在進(jìn)化上高度保守。越來(lái)越多的研究表明線性泛素化修飾在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本綜述總結(jié)了線性泛素化修飾的產(chǎn)生、去除、識(shí)別和調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，及其在機(jī)體免疫應(yīng)答（包括天然免疫和適應(yīng)性免疫）和病原免疫逃逸過(guò)程中的調(diào)控作用，旨在促進(jìn)對(duì)線性泛素化修飾在生理病理過(guò)程中的重要生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí)和深入研究，并為靶向該修飾過(guò)程的感染和免疫性疾病防治提供新思路。

1 線性泛素化修飾概述

線性泛素鏈最初被認(rèn)為是多聚泛素基因UBB和UBC的翻譯產(chǎn)物。直到2006年，KIRISAKO及其同事證明了線性泛素鏈能被由HOIL-1L（haem-oxi‐dized irp2 ubiquitin ligase-1）和HOIP（HOIL-1L inter‐acting protein）組成的線性泛素鏈組裝復(fù)合體（linear ubiquitin assembly complex，LUBAC）催化產(chǎn)生［13］。LUBAC能利用多種類型的E2耦合酶如UbcH7和UbcH5s催化線性泛素鏈的產(chǎn)生。SHARPIN（SHANK-associated RBCK1 homology-domain-inter‐acting protein）隨后被證明是組成LUBAC復(fù)合體的第三個(gè)蛋白亞基［14-15］。值得注意的是，LUBAC是目前唯一已知的能催化線性泛素鏈產(chǎn)生的泛素連接酶。隨后，OTULIN（OTU deubiquitinase with linear linkage specificity）和CYLD（cylindromatosis）相繼被報(bào)道具有去線性泛素化酶活性。此外，多種蛋白結(jié)構(gòu)域被報(bào)道能特異性識(shí)別線性泛素鏈（圖1）。而線性泛素化酶活性以及線性泛素鏈穩(wěn)態(tài)平衡也受到LUBAC組分、去線性泛素化酶以及不同翻譯后修飾的多重調(diào)控。

1.1 線性泛素鏈組裝復(fù)合體 線性泛素鏈組裝復(fù)合體LUBAC由催化亞基HOIP和調(diào)節(jié)亞基SHARPIN、HOIL-1L組成。凝膠過(guò)濾層析實(shí)驗(yàn)表明HOIP、HOIL-1L和SHARPIN三個(gè)亞基相互作用可以組成分子量為600 kD的復(fù)合體。每個(gè)亞基蛋白穩(wěn)定性的改變都會(huì)影響復(fù)合體的形成和組裝，如小鼠成纖維細(xì)胞中SHARPIN的缺失會(huì)降低HOIP和HOIL-1L的蛋白穩(wěn)定性。同樣的，HOIL-1L常染色體陰性遺傳患者來(lái)源的成纖維細(xì)胞中HOIP和SHARPIN的蛋白穩(wěn)定性也會(huì)降低［15］。線性泛素鏈在生理過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。例如，SHARPIN敲除小鼠會(huì)表現(xiàn)出明顯的慢性增生性皮炎和二級(jí)淋巴器官缺陷［16］，HOIP敲除小鼠會(huì)在胚胎期10.5 d因卵黃囊血管發(fā)育缺陷而導(dǎo)致胚胎致死［17］，而HOIP亞等位基因突變和HOIL-1L的截短突變都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的自身炎癥、免疫缺陷以及肌肉支鏈淀粉?。?8］。

圖1 線性泛素鏈的產(chǎn)生、識(shí)別和去除Fig.1 Generation，recognition and removal of linear ubiquitin chains

HOIP和HOIL-1L都屬于RBR家族的泛素連接酶，而SHARPIN不具有泛素連接酶活性。HOIP的RBR結(jié)構(gòu)域在線性泛素鏈產(chǎn)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而其特有的LDD（linear ubiquitin chain-determin‐ing domain）結(jié)構(gòu)域決定了泛素分子之間可以形成線性泛素鏈［19］。HOIP首先通過(guò)RING1結(jié)構(gòu)域結(jié)合E2-Ub，并將該泛素分子轉(zhuǎn)移到RING2結(jié)構(gòu)域上與Cys885形成硫酯鍵，然后通過(guò)其C端的LDD結(jié)構(gòu)域促進(jìn)該泛素分子與另一泛素分子以首尾相連的方式形成線性泛素鏈。HOIL-1L雖然也具有RBR結(jié)構(gòu)域，但主要催化底物蛋白上絲氨酸和蘇氨酸以氧酯鍵形成的單泛素化修飾［20］。在催化亞基HOIP單獨(dú)存在的情況下，其RBR-LDD催化活性可被UBA結(jié)構(gòu)域所抑制，盡管UBA結(jié)構(gòu)域和RBR-LDD結(jié)構(gòu)域之間的直接相互作用并沒(méi)有被檢測(cè)到。此外，研究還表明，UBA結(jié)構(gòu)域的缺失能釋放HOIP的催化活性。當(dāng)調(diào)節(jié)亞基HOIL-1L和SHARPIN通過(guò)其泛素樣（ubiquitin-like，UBL）結(jié)構(gòu)域結(jié)合到HOIP的UBA結(jié)構(gòu)域時(shí)，能解除HOIP的自抑制狀態(tài)，從而促進(jìn)線性泛素鏈組裝復(fù)合體的催化活性［21-22］。然而，到目前為止，HOIP自抑制狀態(tài)的結(jié)構(gòu)仍未被解析。LUBAC復(fù)合體各組分之間的相互調(diào)節(jié)及其發(fā)揮催化活性的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。

1.2 去線性泛素化酶 去泛素化酶在維持泛素系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)平衡中起著至關(guān)重要的作用。人類基因組中去泛素化酶可分為7種不同的類型，包括USP（ubiquitin-specific proteases）、OTU（ovarian tumor）、MJD（machado-joseph disease）、UCH（ubiquitin C-ter‐minal hydrolases）、MINDY（MIU-containing novel DUBfamily）、JAMM（JAB1/MPN/MOV34 metallopro‐tease DUBs）以及ZUP1（zinc finger-containing ubiqui‐tin peptidase 1）［23］。其中，OTULIN（OTU家族）和CYLD（USP家族）是目前已知的兩種能切割線性泛素鏈的去泛素化酶。OTULIN是唯一已知的能特異性切割線性泛素鏈的去泛素化酶［24］。在所有的8種泛素鏈型中，K63泛素鏈與線性泛素鏈的空間結(jié)構(gòu)最相似，而OTULIN與線性泛素鏈的結(jié)合能力是K63泛素鏈的100倍。OTULIN定位在細(xì)胞質(zhì)中，通過(guò)其PIM結(jié)構(gòu)域與HOIP的PUB結(jié)構(gòu)域相互作用，從而抑制LUBAC對(duì)自身的線性泛素化修飾。已有研究表明，表達(dá)OTULIN酶活突變體的細(xì)胞表現(xiàn)出更高水平的線性泛素化修飾，同時(shí)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡復(fù)合體Ⅱ的形成，從而對(duì)TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡更敏感。OTULIN在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)平衡中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。例如，有研究表明，OTULIN基因突變會(huì)導(dǎo)致以反復(fù)發(fā)燒、腹瀉、脂膜炎、關(guān)節(jié)炎和自身抗體產(chǎn)生為特征的早發(fā)型自身炎癥綜合征ORAS（OTULIN-related autoinflammatory syndrome），而OTULIN敲除小鼠會(huì)因血管發(fā)育缺陷而在胚胎期12.5 d發(fā)生胚胎致死［25］。值得注意的是，OTULIN既能通過(guò)酶活性依賴的方式調(diào)控機(jī)體穩(wěn)態(tài)平衡，也能以酶活性非依賴的方式發(fā)揮作用。因此，需結(jié)合特定的疾病模型以及在疾病發(fā)展的不同階段探究OTULIN的具體功能和作用機(jī)制。

CYLD最初被鑒定作為圓柱瘤的腫瘤抑制因子。CYLD基因缺陷會(huì)導(dǎo)致毛發(fā)上皮瘤，其體細(xì)胞突變會(huì)導(dǎo)致乳頭狀瘤病毒相關(guān)的頭頸癌［26］。而CYLD單等位基因突變會(huì)導(dǎo)致皮膚性腫瘤易感綜合征［27］。CYLD被報(bào)道能水解K63和M1多聚泛素化鏈，但不水解K48多聚泛素鏈，并且對(duì)K63和M1泛素鏈具有相同的切割活性［28］。與OTULIN不同的是，CYLD并不直接與HOIP相互作用，而是依賴SPATA2（PIM-containing spermatogenesis-associated 2）與HOIP互作。CYLD通過(guò)其USP結(jié)構(gòu)域結(jié)合SPATA2的PUB結(jié)構(gòu)域，而SPATA2通過(guò)其PIM結(jié)構(gòu)域結(jié)合HOIP的PUB結(jié)構(gòu)域，從而形成CYLD-SPA‐TA2-LUBAC復(fù)合體［29］。有趣的是，OTULIN和STA‐PA2能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合HOIP的PUB結(jié)構(gòu)域。與OTU‐LIN不同的是，SPATA2-CYLD并不會(huì)影響LUBAC的自泛素化過(guò)程［30］。研究表明，OTULIN的缺失會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)線性泛素化豐度增加，而CYLD缺失則不會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)線性泛素化水平［31］，因此CYLD可能通過(guò)發(fā)揮泛素鏈編輯功能調(diào)節(jié)K63-M1雜合泛素鏈的產(chǎn)生。

1.3 線性泛素鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域 不同類型的泛素鏈除了能調(diào)節(jié)底物蛋白的穩(wěn)定性、活性以及亞細(xì)胞定位外，還能作為支架招募特異識(shí)別泛素鏈的互作蛋白。這些互作蛋白具有特異的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能在特定刺激條件下被產(chǎn)生的泛素鏈所招募，調(diào)節(jié)泛素信號(hào)依賴的生物學(xué)功能。已有研究報(bào)道多種不同類型的結(jié)構(gòu)域能識(shí)別并結(jié)合線性泛素鏈，包括UBAN（ubiquitin-binding in ABIN and NEMO）、ZF7和NZF。多種蛋白含有UBAN結(jié)構(gòu)域，包括NEMO、OPTN（optineurin）、ABIN-1、ABIN-2和ABIN-3［32］。根據(jù)已被報(bào)道的NEMO、OPTN以及ABIN-2與線性泛素鏈和K63泛素鏈的復(fù)合體結(jié)構(gòu)，NEMO蛋白UBAN結(jié)構(gòu)域與線性泛素鏈的親和力是K63泛素鏈的100倍。線性泛素鏈近端和遠(yuǎn)端Ile44和Phe4的疏水區(qū)對(duì)UBAN的結(jié)合是至關(guān)重要的。NEMO的UBAN結(jié)構(gòu)域能促進(jìn)線性泛素鏈招募IKK復(fù)合體，從而誘導(dǎo)經(jīng)典NF-κB信號(hào)的激活［33-34］。此外，研究表明NEMO中UBAN結(jié)構(gòu)域的錯(cuò)義突變會(huì)導(dǎo)致X連鎖無(wú)汗性外胚層發(fā)育不良伴免疫缺陷，表明NEMO的線性泛素鏈結(jié)合能力在機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮重要的作用［35］。

OPTN被報(bào)道參與NF-κB信號(hào)激活、抗病毒感染、囊泡運(yùn)輸以及選擇性自噬等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。OPTN具有和NEMO相似的結(jié)構(gòu)域，但不與IKKα/β相互作用。OPTN-UBAN能選擇性結(jié)合線性泛素鏈，并且對(duì)線性泛素鏈具有高度的親和力（解離常數(shù)Kd=1.0μmo/lL）［36］。蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)表明人源的OPTN通過(guò)二聚體與兩分子的線性泛素鏈結(jié)合，而鼠源的OPTN形成泛素鏈后只結(jié)合一分子的線性泛素鏈［36-37］。OPTN-UBAN在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)過(guò)程中也發(fā)揮重要的作用。研究表明，OPTN的缺失會(huì)誘導(dǎo)RIPK1依賴的細(xì)胞壞死，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致肌萎縮側(cè)索硬化癥的發(fā)生［38］。OPTN-UBAN的E478G錯(cuò)義突變會(huì)徹底廢除OPTN與線性泛素鏈的結(jié)合能力，從而引起肌萎縮側(cè)索硬化癥。

鋅指（zinc finger，ZF）結(jié)構(gòu)域是多種泛素結(jié)合蛋白都含有的一類重要結(jié)構(gòu)域，但并不是所有的ZF結(jié)構(gòu)域都能結(jié)合線性泛素鏈。A20是一種能水解K48和K63泛素鏈的去泛素化酶，能以去泛素化酶活性非依賴的方式抑制LUBAC介導(dǎo)的NF-κB激活，由N端的OTU結(jié)構(gòu)域以及七個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域（ZF1-ZF7）組成［39］。其中，ZF7被報(bào)道能結(jié)合線性泛素鏈。盡管A20-ZF7結(jié)構(gòu)域只含有約30個(gè)氨基酸，但與線性泛素分子形成的疏水界面保證了其能以高親和力和高特異性與線性泛素分子，而不是單泛素或者K63泛素分子結(jié)合（Kd=9μmo/lL）［15］。A20-ZF7與線性泛素分子的作用模式表明ZF結(jié)構(gòu)域能以一種不直接結(jié)合泛素連接區(qū)的方式選擇性地識(shí)別線性泛素鏈和K63泛素鏈。此外，HOIL-1L作為L(zhǎng)UBAC的調(diào)節(jié)亞基，除了可以被線性泛素化修飾外，還具有能結(jié)合線性泛素鏈的NZF（Npl4-type zinc finger）結(jié)構(gòu)域。研究表明，相比于單泛素、K48泛素鏈以及K63泛素鏈，NZF結(jié)構(gòu)域?qū)€性泛素鏈具有更高的結(jié)合能力（Kd=20μmo/lL）。NZF結(jié)構(gòu)域也存在于TAB2/3蛋白上，但與HOIL-1L-NZF不同的是，TAB2/3-NZF只能特異性結(jié)合K63泛素鏈。盡管這兩種NZF結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上很相近，但對(duì)遠(yuǎn)端泛素的識(shí)別能力上存在顯著差異。TAB2/3-NZF主要識(shí)別遠(yuǎn)端泛素分子的I44疏水界面，而HOIL-1L-NZF通過(guò)其C端的α螺旋識(shí)別F4疏水區(qū)，這種與遠(yuǎn)端泛素分子結(jié)合的能力也就導(dǎo)致了兩種NZF在泛素鏈識(shí)別上的差異性［40］。

1.4 線性泛素化復(fù)合體的調(diào)節(jié)機(jī)制 作為多個(gè)蛋白亞基組成的復(fù)合體，LUBAC的泛素連接酶活性受到蛋白-蛋白相互作用以及翻譯后修飾等多種不同機(jī)制的嚴(yán)格調(diào)控。已有研究表明，HOIP的UBA結(jié)構(gòu)域和HOIL-1L以及SHARPIN的UBL結(jié)構(gòu)域的相互作用對(duì)三聚體LUBAC復(fù)合體的形成是必需的，HOIL-1L或SHARPIN的缺失會(huì)導(dǎo)致LUBAC復(fù)合體不穩(wěn)定。OTULIN不僅能特異性去除線性泛素鏈，還能通過(guò)與HOIP相互作用調(diào)節(jié)LUBAC的催化活性。研究表明，OTULIN能通過(guò)其氨基端的PIM結(jié)構(gòu)域與LUBAC形成復(fù)合體，從而抑制LUBAC對(duì)底物的催化作用［41-42］。同時(shí)，OTULIN-LUBAC的相互作用也受到PIM結(jié)構(gòu)域中Tyr56磷酸化修飾的調(diào)控。OTULIN Tyr56磷酸化修飾會(huì)降低其與LUBAC的相互作用，從而促進(jìn)LUBAC的催化活性。同時(shí)Tyr56磷酸化會(huì)增強(qiáng)OTULIN與β-catenin的相互作用，從而促進(jìn)Wn/tβ-catenin信號(hào)的激活［43］。此外，MST1（mammalian Ste20-like kinase 1）激酶能通過(guò)磷酸化HOIP反向調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)激活［44］。TRIM32能作為OTULIN的泛素連接酶，通過(guò)促進(jìn)OTULIN的泛素化修飾阻止OTULIN與LUBAC的相互作用，從而促進(jìn)NF-κB信號(hào)的激活［45］。OTU‐LIN能被caspase-3剪切從而抑制細(xì)胞凋亡，而DUSP14（dual-specificity phosphatase 14）則作為磷脂酶通過(guò)將OTULIN Tyr56去磷酸化從而抑制細(xì)胞壞死［46］。E3泛素連接酶HOIL-1L能將LUBAC三個(gè)亞基單泛素化并促進(jìn)LUBAC的自線性泛素化修飾，從而抑制LUBAC的功能［47］，而線性泛素化復(fù)合體在不同疾病模型中的調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待深入研究。

2 線性泛素化修飾在天然免疫反應(yīng)中的調(diào)控作用

天然免疫系統(tǒng)以其動(dòng)態(tài)有序、精密調(diào)控的免疫細(xì)胞和信號(hào)分子產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)構(gòu)成了維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)平衡以及抵抗病原感染的重要防線。作為重要的翻譯后修飾，泛素化修飾能以多種不同的調(diào)節(jié)機(jī)制精細(xì)調(diào)控天然免疫信號(hào)網(wǎng)絡(luò)以及免疫細(xì)胞的激活、反應(yīng)和失活過(guò)程。線性泛素化修飾最初被報(bào)道參與TNF介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)激活，隨后的研究表明線性泛素化修飾在細(xì)胞死亡、NOD樣受體信號(hào)通路激活、干擾素信號(hào)通路激活和細(xì)胞自噬等天然免疫相關(guān)的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中也發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

2.1 NF-κB信號(hào)通路激活 NF-κB轉(zhuǎn)錄因子在天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。靜息狀態(tài)下，NF-κB被IκBα滯留在胞質(zhì)中。多種受體的激活都能活化NF-κB信號(hào)，包括TNFR（tumor necrosis factor recep‐tor）、IL-1R（interleukin-1 receptor）和TLR（toll-like re‐ceptor）等［48］。TNF-α 結(jié)合到TNFR1受體上會(huì)導(dǎo)致TNF-RSC（TNFR1 signaling complex）的形成和寡聚，隨后，TRADD（TNFreceptor-associated death domain）和RIPK1（receptor-interacting protein kinase 1）分別被招募到TNF-RSC。TRADD可以充當(dāng)信號(hào)平臺(tái)招募TRAF2/5（TNF receptor-associated factor 2/5）和E3泛素連接酶cIAP1/2（cellular inhibitor of apopto‐sis1 and 2）。LUBAC在TNF刺激過(guò)程中會(huì)被cIAP1/2催化產(chǎn)生的K63多聚泛素鏈招募到TNF-RSC，催化RIPK1和NEMO（NF-κB essential modulator）發(fā)生線性泛素化修飾。隨后，線性泛素鏈可以作為支架招募由IKKα、IKKβ以及調(diào)節(jié)亞基NEMO組成的IKK復(fù)合體。有趣的是，NEMO與線性泛素鏈的高親和力會(huì)促進(jìn)IKK復(fù)合體的聚集以及IKKβ的激活［49］。IKKβ隨后會(huì)促進(jìn)IκBα的磷酸化和K48泛素化降解，引起NF-κB入核促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)。同時(shí)，LUBAC介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)也受到多種因子的調(diào)控，如MST1（mammalian Ste20-like kinase）可被TRAF2招募到TNFR上抑制LUBAC的催化活性，PACRG（parkin-coregulated gene）可代替SHARPIN穩(wěn)定LU‐BAC復(fù)合體［50］。IL-1β也是能激活NF-κB信號(hào)通路的重要促炎因子。IL-1β刺激會(huì)促進(jìn)IRAK1（inter‐leukin 1 receptor-associated kinase 1）和IRAK4的K63/M1雜合泛素化修飾從而誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路的激活［51］。因此，LUBAC在不同的刺激條件下可以通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控NF-κB信號(hào)通路的激活。

2.2 細(xì)胞死亡 TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB靶基因表達(dá)在抑制細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。當(dāng)NF-κB靶基因的表達(dá)受到抑制，如蛋白合成抑制劑放線菌酮和TNF-α聯(lián)用可以通過(guò)促進(jìn)由RIPK1、FADD和cas‐pase-8組成的Ⅱ型TNFR復(fù)合體的形成誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而caspase-8可以通過(guò)激活caspase-3誘導(dǎo)外源性細(xì)胞凋亡，同時(shí)激活的caspases會(huì)切割LUBAC催化亞基HOIP的氨基端。當(dāng)TNF-RSC的形成受到擾亂時(shí)，TNFR的激活會(huì)導(dǎo)致Ⅱ型TNFR復(fù)合體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，而不是誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)激活［52］。而LUBAC介導(dǎo)的RIPK1的線性泛素化修飾可以抑制Ⅱ型TNFR復(fù)合體的形成和細(xì)胞死亡［53］。在小鼠模型中，LUBAC亞基的缺失會(huì)引起NF-κB靶基因表達(dá)減少，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究表明，TNF或TNFR的敲除能極大緩解SHARPIN缺失導(dǎo)致的慢性增生性皮炎，而對(duì)SHARPIN缺失導(dǎo)致二級(jí)淋巴器官缺陷沒(méi)有影響，表明TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在SHARPIN缺失引起的慢性皮炎中發(fā)揮重要作用［54］。隨后的研究表明，caspase-8和RIPK3的雙敲小鼠能徹底緩解SHARPIN缺失導(dǎo)致二級(jí)淋巴器官缺陷。Myd88的敲除也能緩解SHARPIN缺失導(dǎo)致的皮膚損傷和慢性炎癥［55］。由于線性泛素化修飾在多個(gè)炎癥免疫信號(hào)通路中發(fā)揮重要調(diào)控作用，因此，線性泛素化修飾對(duì)細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)可能是多信號(hào)共同作用的結(jié)果。此外，線性泛素化修飾在不同類型細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)方式也存在差異，仍需更深入的研究進(jìn)一步揭示該修飾對(duì)細(xì)胞死亡的具體調(diào)控機(jī)制。

2.3 NOD樣受體信號(hào)通路激活 作為重要的模式識(shí)別受體，NOD樣受體（nucleotide-binding and oligo‐merization domain-like receptors，NLRs）構(gòu)成了宿主抵御病原菌感染的第一道防線。其中，NOD1主要識(shí)別肽聚糖中的D谷氨酰內(nèi)旋二氨基庚二酸（D-glutamyl-meso-diaminopimelic acid，iE-DAP），而NOD2能感知并被組成肽聚糖的胞壁酰二肽（mur‐amyldipeptide，MDP）所激活。NOD1/2被激活后能通過(guò)活化NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)炎癥因子TNF-α和IL-6的產(chǎn)生。作為NLRs受體家族的重要成員，NL‐RP3能與ASC、pro-caspase-1組裝形成炎癥小體，在PAMPs或DAMPs刺激條件下激活caspase-1引起細(xì)胞焦亡和炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的成熟和釋放［56］。研究表明，泛素連接酶XIAP（X-linked inhibi‐tor of apoptosis）能將RIPK2泛素化并招募LUBAC促進(jìn)NOD2信號(hào)通路的激活，而當(dāng)XIAP突變導(dǎo)致RIPK2不能被泛素修飾，喪失招募LUBAC的能力時(shí)則會(huì)引起二型X染色體關(guān)聯(lián)的淋巴細(xì)胞增生綜合征［57］。此外，在NLRP3炎癥小體的組裝和激活過(guò)程中，LUBAC能通過(guò)將ASC線性泛素化修飾從而促進(jìn)NLRP3炎癥小體的組裝。LUBAC組分的缺失會(huì)減弱NLRP3炎癥小體的激活，但對(duì)AIM2炎癥小體的激活則不是必需的［58］。而線性泛素化修飾在其他NOD樣受體激活過(guò)程中的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究。

2.4 干擾素信號(hào)通路激活 在天然免疫反應(yīng)中，病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）被模式識(shí)別受體（pattern-recogni‐tion receptors，PRRs）識(shí)別后會(huì)激活NF-κB和Ⅰ型干擾素信號(hào)通路。胞質(zhì)RNA主要被包括RIG-Ⅰ、MDA5以及LGP2在內(nèi)的RIG-Ⅰ樣受體（RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs）所感知。RIG-Ⅰ和MDA5能通過(guò)MAVS激活抗病毒Ⅰ型干擾素信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的激活。隨后，Ⅰ型干擾素會(huì)結(jié)合多種細(xì)胞表面廣泛表達(dá)的干擾素受體IFNAR1/2（IFNα/βreceptors），通過(guò)JAK（Janus kinase）激酶招募并激活STAT1/2（signal transducer and activator of transcription 1/2），從而誘導(dǎo)抗病毒基因（IFN-stimu‐lated genes，ISGs）的表達(dá)。已有研究表明，LUBAC能通過(guò)促進(jìn)TRIM25的線性泛素化修飾，而HOIL-1L能通過(guò)與TRIM25競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RIG-Ⅰ從而抑制RIG-Ⅰ介導(dǎo)的干擾素信號(hào)激活［59］。此外，NEMO的線性泛素化修飾能干擾MAVS-TRAF3復(fù)合體的形成，從而抑制RIG-Ⅰ信號(hào)通路［60］。然而，也有研究表明HOIL-1L能促進(jìn)鼠諾如病毒誘導(dǎo)Ⅰ型和Ⅲ干擾素產(chǎn)生［61］。而在Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)的信號(hào)通路中，LUBAC對(duì)STAT1的線性泛素化修飾阻止了JAK1對(duì)STAT1的招募，從而抑制JAK-STAT信號(hào)通路的激活［62］。因此，線性泛素化修飾在不同病毒感染或刺激條件下能通過(guò)不同的調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

2.5 細(xì)胞自噬 自噬是細(xì)胞通過(guò)形成雙層膜的囊泡結(jié)構(gòu)清除胞質(zhì)內(nèi)的外源異物或自身受損和異常折疊的物質(zhì)從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要生物學(xué)過(guò)程。細(xì)胞自噬的發(fā)生和完成受到多種復(fù)合體的共同調(diào)控，包括ULK復(fù)合體、Ⅲ型PI3K復(fù)合體和ATG2-WIPI復(fù)合體等。其中，ULK復(fù)合體由ULK1/2、ATG13、RB1CC1/FIP200以及ATG101組成，主要在自噬的起始階段發(fā)揮作用［63］。研究表明，LUBAC能通過(guò)線性泛素化ATG13穩(wěn)定ULK復(fù)合體，從而促進(jìn)自噬的發(fā)生，而ATG13過(guò)度的線性泛素化修飾則會(huì)抑制自噬的成熟［64］，表明線性泛素化修飾在細(xì)胞自噬的發(fā)生和成熟過(guò)程中都發(fā)揮重要的調(diào)控作用。此外，受損的細(xì)胞器和入侵的病原都能通過(guò)自噬途徑被選擇性降解。研究表明，存在于細(xì)胞質(zhì)中的沙門氏菌會(huì)被泛素化修飾并通過(guò)自噬途徑被清除，進(jìn)一步的泛素化修飾組學(xué)分析表明沙門氏菌感染會(huì)通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)CDC42和LUBAC的活性，并且多種泛素連接酶（包括parkin、smurf1、LRSAM1和LUBAC）都參與宿主對(duì)沙門氏菌的選擇性自噬降解［23］。有關(guān)線性泛素鏈與其他泛素鏈在異源自噬（xenophagy）中的相互調(diào)節(jié)方式仍有待進(jìn)一步的研究。

3 線性泛素化修飾在適應(yīng)性免疫反應(yīng)中的調(diào)控作用

NF-κB信號(hào)通路在淋巴細(xì)胞發(fā)育和抗原遞呈細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)中也發(fā)揮著重要的作用［65］。CD40是表達(dá)在抗原遞呈細(xì)胞表面的TNFR超家族的重要成員，在適應(yīng)性免疫反應(yīng)的激活過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。B細(xì)胞表面CD40分子被CD40L激活后會(huì)引起MAPKs和經(jīng)典NF-κB信號(hào)的激活。有意思的是，SHARPIN敲除小鼠來(lái)源的B細(xì)胞在CD40L刺激下，經(jīng)典NF-κB和MAPK信號(hào)的激活嚴(yán)重受損，而非經(jīng)典NF-κB信號(hào)的激活則不受影響。與TNF系統(tǒng)類似的是，HOIP-HOIL-1L-SHARPIN復(fù)合體也會(huì)被cIAP1/2招募到CD40復(fù)合體上調(diào)節(jié)信號(hào)的激活，然而，CD40復(fù)合體上的線性泛素化修飾底物尚未被報(bào)道。

B細(xì)胞受體和T細(xì)胞受體介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)激活依賴于CARMA1、BCL10和MALT1組成的復(fù)合體［66］。在小鼠B淋巴細(xì)胞中，LUBAC對(duì)IgM誘導(dǎo)的BCR通路沒(méi)有顯著的影響，然而LUBAC的活性對(duì)CD40介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路激活以及B1細(xì)胞發(fā)育都很重要［67］。只有在B淋巴細(xì)胞系中，BCR誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)激活才依賴線性泛素鏈，在小鼠原代細(xì)胞中LUBAC的活性對(duì)BCR信號(hào)不是必需的。而線性泛素鏈在CD40誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)激活中則一直是需要的。B細(xì)胞中缺乏HOIP會(huì)嚴(yán)重?fù)p害抗體的產(chǎn)生并導(dǎo)致B1細(xì)胞功能障礙。相比之下，LUBAC活性對(duì)CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NKT（natural killer T cells）以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）的分化、存活以及穩(wěn)態(tài)都是至關(guān)重要的。小鼠Tregs細(xì)胞缺乏HOIP會(huì)導(dǎo)致Treg功能缺陷、外周耐受以及致死性免疫損傷。LUBAC能以NF-κB信號(hào)依賴和非依賴的方式維持T細(xì)胞的分化和存活［68］。研究表明，HOIL-1L在T細(xì)胞受體介導(dǎo)的反應(yīng)中能被半胱氨酸蛋白酶MALT1剪切［69］。LUBAC能通過(guò)促進(jìn)CARMA1-BCL10-MALT1復(fù)合體中BCL10的線性泛素化修飾調(diào)節(jié)B細(xì)胞受體（BCR）和T細(xì)胞受體（TCR）誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)激活［66］。因此，線性泛素化修飾在適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。然而，仍需更進(jìn)一步的研究揭示調(diào)控適應(yīng)性免疫反應(yīng)發(fā)生的線性泛素化修飾底物以及線性泛素化酶活性在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的具體機(jī)制。

4 線性泛素化修飾在病原免疫逃逸過(guò)程中的作用

如前所述，線性泛素化修飾在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能及維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。而在機(jī)體抵抗病原微生物感染的過(guò)程中，一方面，機(jī)體會(huì)啟動(dòng)免疫系統(tǒng)抵抗和清除病原以保護(hù)機(jī)體免于外來(lái)病原的侵染［70］；另一方面，病原會(huì)產(chǎn)生和分泌多種毒力因子通過(guò)模擬和劫持宿主免疫系統(tǒng)避免被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別和清除［71］。線性泛素化修飾是一種宿主免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制，因此，病原在與宿主長(zhǎng)期博弈的過(guò)程中產(chǎn)生了一系列能靶向線性泛素化修飾過(guò)程的效應(yīng)蛋白，通過(guò)調(diào)控線性泛素鏈依賴的免疫應(yīng)答從而逃逸機(jī)體抗感染免疫反應(yīng)。

最近有研究報(bào)道了嗜肺軍團(tuán)菌能產(chǎn)生特異性水解線性泛素鏈的去泛素化酶RavD。RavD能在感染過(guò)程中被存在于胞質(zhì)中的嗜肺軍團(tuán)菌分泌，通過(guò)直接靶向NEMO抑制其線性泛素化修飾進(jìn)而減弱感染誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)［72］。還有研究表明，線性泛素鏈能直接包裹傷寒沙門氏菌，通過(guò)招募NEMO和OPTN介導(dǎo)宿主炎癥反應(yīng)以及對(duì)病原菌的自噬清除［73］，而志賀氏菌可分泌具有E3泛素連接酶活性的效應(yīng)蛋白IpaH1.4和IpaH2.5，通過(guò)促進(jìn)HOIP和NEMO的K48泛素化降解、抑制線性泛素鏈介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路激活［74］。此外，線性泛素鏈也能被病原劫持促進(jìn)其在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和擴(kuò)增。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）被報(bào)道能通過(guò)其編碼的NSP1α和NSP11效應(yīng)蛋白分別抑制LUBAC復(fù)合體的形成以及招募宿主細(xì)胞內(nèi)的OTULIN促進(jìn)NEMO的去線性泛素化過(guò)程，從而抑制NF-κB信號(hào)激活［75-76］。Epstein-Barr病毒（EBV）能通過(guò)其LMP1效應(yīng)蛋白招募LU‐BAC，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子IRF7的泛素化修飾，從而減弱病毒感染誘導(dǎo)的干擾素反應(yīng)［77］。乙型肝炎病毒（hepati‐tis Bvirus，HBV）能通過(guò)HBx招募LUBAC抑制RIG-IMAVS介導(dǎo)的干擾素信號(hào)激活［78］。丙型肝炎病毒（hepatitis Cvirus，HCV）能通過(guò)其NS3效應(yīng)蛋白競(jìng)爭(zhēng)性阻斷LUBAC與NEMO的相互作用，從而抑制NF-κB信號(hào)的激活［79］。值得一提的是，致癌病毒則能利用線性泛素化修飾促進(jìn)癌癥的發(fā)生。例如，Ⅰ型人類T細(xì)胞白血病病毒（human T-lymphotropic virus 1，HTLV-1）被報(bào)道能通過(guò)Tax效應(yīng)蛋白結(jié)合LUBAC促進(jìn)NF-κB信號(hào)激活，而EBV能招募LUBAC促進(jìn)NEMO和TRAF1的線性泛素化修飾進(jìn)而誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)激活和細(xì)胞增殖（圖2）［80］。

5 展望

作為一種新型的多聚泛素化修飾，越來(lái)越多的研究報(bào)道了線性泛素化修飾在包括免疫系統(tǒng)在內(nèi)的多種器官系統(tǒng)中的重要調(diào)控作用。線性泛素化修飾能通過(guò)精密調(diào)控重要免疫信號(hào)分子和免疫細(xì)胞的生物學(xué)功能來(lái)維持免疫系統(tǒng)在生理病理過(guò)程中的穩(wěn)態(tài)平衡，而免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失衡會(huì)導(dǎo)致感染、癌癥、自身免疫病和神經(jīng)退行性疾病等免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生。目前對(duì)線性泛素化修飾的認(rèn)識(shí)還很不全面，仍存在許多亟待解決的問(wèn)題。例如，線性泛素化和去線性泛素化酶在生理病理過(guò)程中是否存在酶活性非依賴的生物學(xué)功能？線性泛素化相關(guān)復(fù)合體在疾病發(fā)生過(guò)程中的酶活性調(diào)節(jié)方式是怎樣的？是否存在對(duì)線性泛素化復(fù)合體功能至關(guān)重要的新的調(diào)節(jié)亞基？線性泛素化修飾與其他翻譯后修飾之間的相互調(diào)節(jié)方式？目前有關(guān)線性泛素化修飾的研究主要集中在炎癥、感染和癌癥等疾病，而其在自身免疫病和神經(jīng)退行性疾病等免疫性疾病方面的調(diào)控功能及機(jī)制還遠(yuǎn)未明確。今后可利用蛋白質(zhì)組和泛素化修飾組等多組學(xué)方法揭示組織特異性和不同病理?xiàng)l件下的線性泛素化修飾新底物，并進(jìn)一步構(gòu)建特定細(xì)胞類型敲除的小鼠模型和基因敲入小鼠模型，開發(fā)更多特異性識(shí)別線性泛素鏈的檢測(cè)工具，同時(shí)結(jié)合臨床病理樣本和體外生化實(shí)驗(yàn)方法，深入探究線性泛素化修飾對(duì)免疫系統(tǒng)正常生理功能的調(diào)控作用及其在免疫系統(tǒng)功能異常導(dǎo)致的多種疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的動(dòng)態(tài)調(diào)控功能和精細(xì)調(diào)控機(jī)制，從而為多種免疫相關(guān)性疾病的干預(yù)和治療提供新思路和新策略。

圖2 線性泛素化修飾對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用Fig.2 Regulatory roles of linear ubiquitination in im?mune system