鹽穗木根際產(chǎn)ACC脫氨酶耐鹽菌株的篩選及鑒定

王偉楠，蘭智勇，喻文麗，孫慶培，李佩琪，樊永紅

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046）

鹽穗木（Halostachys caspica）是藜科鹽穗木屬的一類鹽生、旱生多汁半灌木，對(duì)鹽分適應(yīng)性極強(qiáng)，貯水組織發(fā)達(dá)，是荒漠、半荒漠的主要植物之一［1］。

1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）是乙烯生物合成的直接前體。ACC脫氨酶可以將根部的ACC分解成α-丁酮酸和氨，降低了在高鹽堿度［2-4］、旱［5-6］、水澇［7］、重金屬污染［8］等非生物脅迫條件下植物所產(chǎn)生乙烯的含量。因此，用產(chǎn)ACC脫氨酶的植物根際促生菌（PGPR）接種可促進(jìn)在脅迫條件下的植物生長(zhǎng)。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于產(chǎn)ACC脫氨酶細(xì)菌的研究，主要集中在產(chǎn)ACC脫氨酶菌株的篩選及鑒定［9-11］，產(chǎn)ACC脫氨酶微生物對(duì)促進(jìn)植物在逆境脅迫（鹽堿脅迫、干旱脅迫、重金屬污染等）下生長(zhǎng)的能力和定殖情況［2-8］，以及控制ACC脫氨酶合成的基因及相關(guān)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用［12］等方面。獨(dú)特的自然地理環(huán)境，使新疆成為了典型的干旱地區(qū)和鹽堿地的重發(fā)區(qū)。如何更有效地利用并治理鹽堿地，已成為新疆農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要任務(wù)。本研究從新疆鹽堿地植物根際篩選產(chǎn)ACC脫氨酶的耐鹽菌株，目的在于將ACC脫氨酶活性以及耐鹽性能均較強(qiáng)的菌株，作為植物根際促生菌接種到植物根際，從而提高植物在鹽脅迫下的生存能力，為豐富產(chǎn)ACC脫氨酶的植物根際促生菌的菌種資源及后續(xù)制作生物菌肥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

土壤樣品采自新疆五家渠市103團(tuán)鹽堿地的鹽穗木根際，裝于無(wú)菌自封袋中，保存于4℃冰箱內(nèi)待用，一部分土樣過(guò)篩去雜質(zhì)后送至新疆農(nóng)科院測(cè)試中心進(jìn)行測(cè)定土壤理化性質(zhì)，另一部分用于篩菌。

1.1.2 主要試劑

本實(shí)驗(yàn)所用的TSB培養(yǎng)基、PAF培養(yǎng)基、DF培養(yǎng)基、ADF培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基，具體配方參考Penrose等［13］的配方。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)ACC脫氨酶菌株的初篩

本實(shí)驗(yàn)基于Penrose等［13］和張國(guó)壯等［14］的方法上稍作了改變，稱取2 g土樣于100 mL PAF培養(yǎng)基中，30℃ 180 r/min培養(yǎng)24 h后，取1 mL加入50 mL DF液體培養(yǎng)基中，同樣條件培養(yǎng)24 h，再取1 mL上述培養(yǎng)液，加入50 mL ADF液體培養(yǎng)基中，30℃ 180 r/min培養(yǎng)48 h，梯度稀釋后，每個(gè)梯度各取200μL，涂布于ADF平板上，30℃培養(yǎng)48～72 h后觀察結(jié)果，選取不同菌落形態(tài)的菌株進(jìn)行編號(hào)并劃線純化，記錄純化后菌株的菌落形態(tài)。

保存時(shí)，將純化好的菌株用ADF培養(yǎng)液30℃180 r/min培養(yǎng)至渾濁，取1 mL菌液加入1 mL的20%無(wú)菌甘油中混勻至凍存管中，于-80℃保存。

1.2.2 ACC脫氨酶活性測(cè)定

ACC脫氨酶可以將ACC分解成α-丁酮酸和氨，本次酶活測(cè)定以產(chǎn)物α-丁酮酸作為檢測(cè)指標(biāo)，用2，4-二硝基苯肼作為染料，來(lái)測(cè)定菌液中α-丁酮酸的含量，從而說(shuō)明菌株的ACC脫氨酶活力，具體步驟參考Penrose等［13］和Glick等［15］的方法。蛋白質(zhì)含量的測(cè)定選擇考馬斯亮藍(lán)法，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

酶活的計(jì)算方式以每分鐘產(chǎn)出1μmol α-丁酮酸的量為1酶活力單位（U），計(jì)算方式參考Bal等［16］和姬文秀等［17］的方法。

1.2.3 耐鹽菌株的篩選

將ADF固體培養(yǎng)基分別調(diào)至不同的鹽（NaCl）濃度，再將所篩菌株通過(guò)劃線的方式接到這些平板上，30℃培養(yǎng)3～5 d后觀察記錄其生長(zhǎng)情況。鹽（NaCl）濃度選擇0%、4%、8%、12%和16%，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

選擇耐鹽能力較好且ACC脫氨酶活性高的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 菌株形態(tài)觀察

對(duì)所選菌株進(jìn)行革蘭氏染色和掃描電鏡形態(tài)觀察。

1.2.5 生理生化實(shí)驗(yàn)

用所選的菌株做生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)。所采用的方法參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》［18］和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［19］上有關(guān)細(xì)菌的生理生化測(cè)定部分。本次實(shí)驗(yàn)選擇了石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)、葡萄糖、乳糖、蔗糖的糖酵解實(shí)驗(yàn)、明膠水解實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、油脂水解實(shí)驗(yàn)和過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)這8項(xiàng)，將這8項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與細(xì)菌伯杰氏手冊(cè)上的描述進(jìn)行比對(duì)，初步鑒定所選菌株的科屬。

1.2.6 Biolog鑒定

Biolog檢測(cè)是通過(guò)檢測(cè)菌株在一定時(shí)間內(nèi)對(duì)不同碳氮源的利用程度，來(lái)鑒定菌株種屬關(guān)系的一種方法。Biolog專用的微孔板上，除第一個(gè)孔是未加任何碳源的蒸餾水外，其他95個(gè)孔中加入了95種單一碳氮源和四唑染料。微生物利用了孔內(nèi)碳氮源，四唑染料就會(huì)變成紫色。顏色的深淺說(shuō)明了碳氮源被利用的程度。不同種類的微生物有不同種類的處理液和微孔板。

將所選菌株劃線接種至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～18 h后，挑單菌落劃線接種在BUG培養(yǎng)基上，37℃下培養(yǎng)12～24 h。在濁度儀上檢驗(yàn)接種液的濁度，將接種液濁度調(diào)至100后，用Biolog專用的無(wú)菌棉簽輕輕蘸取單菌落，接入接種液中，搖勻。再檢測(cè)其濁度，濁度控制在95左右即可。將處理液倒在專用的無(wú)菌小槽中，用加樣槍吸取小槽中的接種液，加到GenIII板的每一個(gè)孔中，記錄好時(shí)間，37℃培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行檢測(cè)。系統(tǒng)會(huì)根據(jù)所測(cè)微孔板每個(gè)孔的OD值，與系統(tǒng)內(nèi)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，從而提供匹配度最高的結(jié)果。

1.2.7 16S rDNA測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株樣品送至上海生物工程有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)，并從Ezbiocloud上找到相應(yīng)的模式菌株的16S rDNA序列，之后利用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定其種屬關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

從表1中可以看出，所選的3份土樣均是堿性土壤，pH均在9左右，且含鹽量較高，屬于典型的鹽堿地土壤。

表1 土樣理化測(cè)試結(jié)果

2.2 ACC脫氨酶活性測(cè)定

α-丁酮酸標(biāo)曲的回歸方程為y=0.6043x+0.0175，相關(guān)系數(shù)為0.9949，考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.6361x+0.0047，相關(guān)系數(shù)為0.9973。經(jīng)3次 測(cè) 量（圖1），菌 株W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9和W10的酶比活力依次為3.611、4.921、12.430、2.957、9.412、3.642、2.301、7.671、13.013和1.958 U/mg。其 中W3、W5、W8、W9這4株菌株的ACC脫氨酶活性較高，W9的酶比活力最高，為13.013 U/mg。

2.3 菌株耐鹽堿實(shí)驗(yàn)結(jié)果

綜合3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2），菌株W1、W5、W8、W9的耐鹽能力最強(qiáng)，在12%的鹽濃度下仍能生長(zhǎng)，部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 各菌株ACC脫氨酶活性測(cè)定結(jié)果

表2 菌株耐鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果

綜合菌株的ACC脫氨酶活性以及其耐鹽能力，選擇兩方面能力都最為突出的W5、W8、W9作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的供試菌株。

圖2 菌株耐鹽實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 菌種鑒定

2.4.1 菌落形態(tài)及顯微觀察結(jié)果

從圖3～圖5可以看出，W5和W8菌落呈白色不透明圓形凸起，為革蘭氏陽(yáng)性的桿菌，W9菌落呈無(wú)色透明圓形凸起，為革蘭氏陰性的桿菌。

2.4.2 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，3株菌均能使明膠液化，有過(guò)氧化氫酶活性，可以利用葡萄糖，且都能使石蕊牛奶顏色改變并產(chǎn)生凝乳反應(yīng)。W5和W8可以利用蔗糖，但W9不能。

圖4 W5、W8、W9革蘭氏染色結(jié)果

圖5 W5、W8、W9掃描電鏡結(jié)果照片

表3 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.3 Biolog鑒定結(jié)果

W5在培養(yǎng)48 h后，檢出可利用糊精、N-乙酰-D-葡萄糖胺、L-果糖、乳酸鈉、甘油、α-氨基乙酰-L-脯氨酸、果膠、葡糖醛酰胺、L-乳酸和L-蘋(píng)果酸等20多種碳氮源，經(jīng)系統(tǒng)比對(duì)得出最匹配的結(jié)果為乳酪短桿菌（Brevibacterium casei），可能性（PROB）為0.704，相似性（SIM）為0.704；W8培養(yǎng)48 h后，檢測(cè)出可利用D-麥芽糖、蔗糖、D-松二糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、L-果糖、乳酸鈉、α-氨基乙酰-L-脯氨酸、L-丙氨酸和β-羥基苯乙酸等20多種碳氮源，經(jīng)系統(tǒng)比對(duì)得出最匹配的結(jié)果也是乳酪短桿菌（Brevibacterium casei），可能性（PROB）為0.864，相似性（SIM）為0.576；W9經(jīng)48 h的培養(yǎng)，檢測(cè)出可利用D-麥芽糖、D-海藻糖、D-纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖、D-松二糖、棉子糖、α-D-乳糖、蜜二糖、β-甲酰-D-葡萄糖苷、D-水楊苷、α-D-葡萄糖、D-果糖、D-半乳糖、L-鼠李糖和D-甘露醇等30余種碳氮源，系統(tǒng)給出的最匹配結(jié)果為放射型根瘤菌（Rhizobium radiobacter），可能性（PROB）為0.562，相似性（SIM）為0.562。

2.4.4 16S rDNA同源序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

如表4、圖6和圖7所示，經(jīng)BLAST后W5和W8匹配度最高的種屬均為短桿菌屬，W5和W8的測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)與乳酪短桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和其他一些短桿菌屬的序列進(jìn)行比對(duì)后，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上被分在同一分支，說(shuō)明W5和W8均為短桿菌屬的乳酪短桿菌（Brevibacterium casei）。W9則為根瘤菌屬，親緣關(guān)系最近的是普沙根瘤菌（Rhizobiumpusense）。

表4 三株菌的16S rDNA基本信息與核酸序列比對(duì)（BlastN）結(jié)果

圖6 菌株W5和W8基于16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖7 菌株W9基于16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)所得的產(chǎn)ACC脫氨酶菌株，酶比活力在2.3～13.1 U/mg之間，最高為13.013 U/mg。費(fèi)詩(shī)萱等［9］從紅棗根際篩出的產(chǎn)ACC脫氨酶菌株，按本文所用的計(jì)算方法，酶比活力在0.5～7.3 U/mg之間，最高為7.218 U/mg，與本實(shí)驗(yàn)相比，都是從植物根際篩得的菌株，測(cè)酶活的方法和計(jì)算方式也相近，但酶活力的區(qū)間和最大值均比本實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果要低一些，這可能是由于本實(shí)驗(yàn)所用的土樣性質(zhì)以及植物本身的抗脅迫能力都有不同；姬文秀等［17］從人參中篩出的產(chǎn)ACC脫氨酶內(nèi)生細(xì)菌的酶比活力在0.2～10 U/mg之間，最高為9.728 U/mg，與本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相比，本次實(shí)驗(yàn)所用方法和計(jì)算方式與之相同，酶活力的區(qū)間以及最大值稍低于本次實(shí)驗(yàn)，可能是由于菌株的來(lái)源不同；代金霞等［20］從檸條根際篩出的產(chǎn)ACC脫氨酶菌株，酶活區(qū)間在0.33～2.43 U/mg之間，最高酶活為2.427 U/mg，與本次實(shí)驗(yàn)相比，都是從荒漠植物根際土壤中篩得的菌株，所用方法和計(jì)算方式也相同，但本次實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果要明顯更高一些，可能與土壤性質(zhì)以及植物本身抗脅迫能力的差異有關(guān)。

在細(xì)菌鑒定過(guò)程中，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)合了傳統(tǒng)鑒定方法，基于碳氮源利用的Biolog檢測(cè)手段和目前廣泛使用的通過(guò)16S rDNA鑒定方法，3種方法相互佐證，各有特點(diǎn)。傳統(tǒng)方法操作繁瑣，且生理生化實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目有限，存在一定誤差；Biolog由于數(shù)據(jù)庫(kù)有限，也會(huì)存在一定誤差；16S rDNA鑒定方法是現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的結(jié)果，數(shù)據(jù)庫(kù)豐富，所以所得結(jié)果也較為可靠。本次實(shí)驗(yàn)的W9菌株Biolog檢測(cè)結(jié)果與16S rDNA鑒定的結(jié)果在種水平上并不一致，最終以16S rDNA鑒定的結(jié)果為準(zhǔn)。Biolog檢測(cè)結(jié)果不一致，可能是由于在接近菌的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)，Biolog并未給出鑒定結(jié)果，而繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后過(guò)了菌株的對(duì)數(shù)期，或者其數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有普沙根瘤菌的數(shù)據(jù)這兩方面原因?qū)е隆?/p>

本次實(shí)驗(yàn)所篩出的W5和W8菌株雖都是乳酪短桿菌，但在酶活和菌體形態(tài)，以及碳氮源利用等方面還是有一定程度的不同。在產(chǎn)ACC脫氨酶細(xì)菌的文獻(xiàn)中也少有短桿菌屬的菌株報(bào)道，這一結(jié)果也進(jìn)一步豐富了產(chǎn)ACC脫氨酶細(xì)菌的菌種資源。乳酪短桿菌有能富集重金屬離子［21］，產(chǎn)腈水解酶［22］，合成銀和金的納米顆粒［23］等報(bào)道。根瘤菌屬也屬于常見(jiàn)的產(chǎn)ACC脫氨酶的菌屬，有根瘤菌的ACC脫氨酶基因能促進(jìn)其結(jié)瘤［24-25］的報(bào)道。普沙根瘤菌也有作為植物根際促生菌，能夠富集鎘污染土壤中的鎘［26］，以及作為油田增油細(xì)菌［27］的報(bào)道。后續(xù)也可以繼續(xù)進(jìn)行對(duì)這3株產(chǎn)ACC脫氨酶的耐鹽堿菌株的促生能力、接種效應(yīng)，以及在植物根際定殖情況等方面研究。

4 結(jié)論

本文通過(guò)ADF培養(yǎng)基，以ACC為唯一氮源，從3種不同的鹽穗木根際土樣中，篩選出10株菌落形態(tài)不同的產(chǎn)ACC脫氨酶的菌株，通過(guò)對(duì)其ACC脫氨酶活性的測(cè)定和耐鹽實(shí)驗(yàn)得出W5、W8和W9這3株菌株有較高的ACC脫氨酶活性，W1、W5、W8和W9這4株菌株均能在鹽（NaCl）濃度12%下生長(zhǎng)，有很好的耐鹽能力，故選擇W5、W8和W9這3株進(jìn)行了后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。經(jīng)菌落形態(tài)和顯微觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)、Biolog檢測(cè)、16S rDNA測(cè)序、BLAST比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析后，最終鑒定W5和W8為短桿菌屬乳酪短桿菌（Brevibacterium casei），W9為普沙根瘤菌（Rhizobium pusense）。