污水廠中草甘膦降解菌的篩選及其降解特性研究

許 斌，韓 萍，薛玉芬

（1青島市團島污水處理廠，山東青島 266002；2青島水務集團環(huán)境能源有限公司，山東青島 266002）

0 引言

草甘膦是一種廣譜滅生性除草劑[1]。近年來，隨著農(nóng)業(yè)的發(fā)展和環(huán)保措施的相對滯后，中國土壤、水體中的草甘膦污染越來越嚴重[2]。許多研究證實，利用微生物治理草甘膦污染水體和土壤是最有前景的手段[3]。近年來的研究表明，當草甘膦進入土壤后，由于吸附到土壤有機物和粘土顆粒上而停留的時間較長[4]，長期使用對環(huán)境中的微生物和水生生物具有較強的毒害作用[5]。土壤中的草甘膦易發(fā)生水解、光化學降解、生物降解等，而生物降解是草甘膦降解的最主要途徑。目前發(fā)現(xiàn)降解草甘膦的微生物主要有細菌和真菌，但自然環(huán)境復雜多變，影響微生物的降解效率[6]。因而，人工篩選或馴化高耐受性的菌株，再將其釋放至環(huán)境中去，有助于提高草甘膦降解的速率，對草甘膦污染的土壤、水體等的修復具有重要意義。

近年來，對于草甘膦降解菌篩選研究較多。賀望興等[7]采用生物富集、農(nóng)藥馴化等方式從茶園草甘膦污染土壤中篩選出一株潛在降解菌株CGL-1菌株，經(jīng)鑒定為微球菌屬，對草甘膦的最高耐受濃度為1200 mg/L。張慧芳等[8]從草甘膦農(nóng)藥污染的環(huán)境分離篩選到2株具有高效穩(wěn)定的草甘膦降解能力的菌株B-1和Y-1，分別為越南伯克氏菌和硝基還原假單胞菌，在以草甘膦農(nóng)藥(400 mg/L)為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基中對草甘膦農(nóng)藥的降解率分別為92.64%和87.73%；全鑫等[9]從受草甘膦污染的土壤中以草甘膦為唯一碳源進行篩選，發(fā)現(xiàn)QB-7菌株，鑒定該菌株為節(jié)桿菌屬，在草甘膦濃度為12 g/L的培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)7天后的降解率高達99.34%。以上研究表明，環(huán)境中存在著種類繁多的能耐受草甘膦的菌群，不同菌屬對草甘膦都顯示較好的降解效能。

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種微生物（如真菌[10]、細菌[11-12]等）能以草甘膦為唯一的磷源、碳源或氮源，表現(xiàn)出極高的降解率[13]，但相對于豐富的微生物菌群，目前對草甘膦降解菌的認識和研究仍然不夠，為進一步豐富草甘膦降解菌的品種，篩選高效降解菌，本實驗擬從污水處理廠活性污泥中分離、純化、富集、馴化菌株，并對其草甘膦降解特性及環(huán)境影響因素進行研究，為草甘膦污染水體的生物處理技術(shù)提供更大可能[14]。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

從青島市某污水處理廠的活性污泥中分離獲得。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 無機鹽液態(tài)培養(yǎng)基 分別取0.5 g MgSO4、0.5 g KCl、1.31 g K2HPO4、3.0 g NaNO3、0.018 g FeSO4加入1 L的蒸餾水中，再分別加入1.15、2.87 g和5.74 g草甘膦（純度99.8%）試劑，配制成草甘膦濃度分別為100、250和500 mmol/L的無機鹽培養(yǎng)基。

1.2.2 LB培養(yǎng)基 取牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g NaCl 5.0 g加入1 L蒸餾水中加熱融化，調(diào)節(jié)至pH 7.4～7.6。

1.3 藥品與儀器

1.3.1 主要藥品 草甘膦(99.8%)、溴化鉀、亞硝酸鈉、硝酸鈉、氯化銅、氯化鉻、硫酸(50%)、硝酸(50%)。

1.3.2 主要儀器 生化培養(yǎng)箱、紫外分光光度計、搖床、離心機、振蕩器、pH計、燒杯、移液管、滴管、玻璃棒、容量瓶、250 mL錐形瓶、比色皿等。

1.4 篩選鑒定方法

1.4.1 菌株的篩選和富集 取8份泥樣加入到100 mL含250 mmol/L草甘膦的無機鹽基礎液體培養(yǎng)基中，在28.8℃、127 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)1周后，取出10%連續(xù)馴化，富集馴化3次后在含250 mmol/L草甘膦的無機鹽平板上涂布富集液，28.5℃培養(yǎng)，挑取單菌落于250 mmol/L濃度草甘膦的無機鹽平板上進行劃線純化，重復2次后保存。

1.4.2 菌株的鑒定 取純化后的該菌株進行鑒定：取培養(yǎng)到對數(shù)生長期的純化菌株菌液1.5 mL，6000 r/min離心6 min，加600 μL無菌水洗滌，混勻靜置幾分鐘后，以5000 r/min離心 4 min，倒上清液，溶于 300 μL 無菌水[15]。加5 μL溶菌酶，溶菌酶終濃度(50～100 μg/mL)，37℃保溫1 h，加入1/5體積10%SDS，顛倒，靜置，60～65℃水浴10 min。加1/4體積5 mol/L NaCl，使NaCl終濃度1 mol/L，加等體積苯酚氯仿去蛋白。取上清，加0.6～0.8倍體積的異丙醇，旋轉(zhuǎn)使變成一團，1000 r/min離心10 min，倒去上清，加乙醇，真空抽干乙醇，溶解于去離子水中[16]。PCR引物采用真細菌16S rDNA通用引物：5’-GGACTAHAGGGTATCTAAT-3’和 5’-AGAGTTTGATCMTGG-3’。PCR擴增體系總體積為100 μL，其中去離子水65.5 μL，10 XPCR buffer（不含Mg2+）10 μL，MgCl22 uL，dNTP(20 mmol/L)10 μL，引物5 μL，模板DNA 5 μL，Taq DNA聚合酶2 μL。PCR程序為：94℃預熱5 min，94℃變性30 s，33℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)30次，72℃延伸5 min。電泳，EB染色，紫外凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化系統(tǒng)純化后，交由上海生物工程技術(shù)公司進行序列測定。

1.4.3 菌株生長量測定 取分離篩選出的菌株放入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在28.8℃，127 r/min搖床震蕩培養(yǎng)，分別出在10%的培養(yǎng)液中培養(yǎng)0、6、12、18、24、30、36、42 h和48 h，用紫外分光光度計（波長600 nm處）測定其OD值，畫出其生長曲線，并記錄對數(shù)期。

1.4.4 草甘膦標準曲線的繪制 首先稱取0.003 g（精確至0.0002 g）質(zhì)量分數(shù)99.8%的草甘膦，用水配制成250 mL草甘膦溶液后，分別配制14 g/L亞硝酸鈉溶液、體積比為50%的硫酸溶液和250 g/L的溴化鉀溶液，精確吸取草甘膦標準溶液0.4、0.55、0.7 mL和1.0 mL于編號為1～5號容量瓶中，并在容量瓶中再分別加入蒸餾水和之前配好的用于亞硝基化反應液（5 mL蒸餾水、0.5 mL硫酸溶液、0.1 mL硝酸鉀溶液、0.5 mL亞硝酸鈉溶液）后，放置20 min，用蒸餾水將其稀釋至刻度，搖勻，備用，用紫外分光光度計法測定草甘膦含量[17]。

1.4.5 草甘膦降解率的測定 不同草甘膦濃度：根據(jù)生長曲線找出該菌開始對數(shù)期的時間，并在該時間段取出1 mL的菌液分別接入100 mL草甘膦濃度分別為100、250和500 mmol/L的無機鹽液體培養(yǎng)基中，在30℃，127 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)。按10%的量分別取兩份0、8、16、24、32、40和48 h時的液體培養(yǎng)基。

不同pH：配置1 L草甘膦濃度為250 mmol/L的無機鹽液態(tài)培養(yǎng)基100 mL分裝在250 mL的三角瓶中，用10%的HCI和10%的NaOH調(diào)整三角瓶中的酸堿度，用pH計測定，使唯一碳源培養(yǎng)基的pH分布：1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，將預先培養(yǎng)至對數(shù)生長期的培養(yǎng)液，按照2%的接入量，接種于含草甘磷250 mmol/L的不同初始pH的無機鹽液態(tài)培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)48 h。

在100 mL含草甘膦250 mmol/L的無機鹽液態(tài)培養(yǎng)基中分別加入濃度為50 mg/kg和150 mg/kg的Cu2+，濃度分別為0.25 mg/kg和2.5 mg/kg的Cd2+，并按5%的接種量接入濃度為250 mg/kg草甘膦的無機鹽液態(tài)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，設不加重金屬為對照組(CK)。

取上述需測定生長曲線時用的菌液，包括不同濃度，不同pH，重金屬條件下的菌液。離心后取上清液并加入反應液后，將紫外分光光度計的波長調(diào)節(jié)至243 nm，測其吸光度，并根據(jù)標準曲線的方程，得出剩余濃度，根據(jù)草甘膦剩余濃度與初始濃度之比計算出草甘膦的降解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 草甘膦降解菌株的富集和篩選

2.1.1 菌株P(guān)P84的形態(tài)特征及顯微鏡下的形態(tài)觀察 通過反復劃線、分離、純化，在以草甘膦為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基上得到可以降解草甘膦的菌株P(guān)P84，在基礎固態(tài)培養(yǎng)基上27.5℃培養(yǎng)32 h后，培養(yǎng)基上出現(xiàn)白色、表面光滑、濕潤、粘稠、隆起、邊緣整齊、半透明的圓形菌落（圖1）。革蘭氏染色后顯微鏡觀察可知，該菌體呈桿狀，無鞭毛，為革蘭氏染色陽性反應。

圖1 LB培養(yǎng)基中菌株形態(tài)

2.1.2 16S rRDNA序列測定 為進一步確定菌株P(guān)P84的分類學位置，測定了其16S rDNA的部分基因序列。所得到的部分16S rDNA基因序列長度為690 bp，該序列在GenBank中的登錄號為KX356681。將PP84的16S rDNA基因輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，進行BLAST比對，表明該菌株的16SrDNA基因序列與數(shù)據(jù)庫中多個菌種的同源性都為100%，它們分別是Bacillussp.FJAT25768(KU161292.1)、BacillusspFJAT257668(KR077857.1)、Bacillusmegaterium.strainBS9(KR0631831.1)、Bacillusmegaterium.strain.XT31(KF797989.1)、Bacillusmegaterium.strainL24(KU179337.1)、Bacillusmegaterium.strainL15(KU179331.1)、Bacillusmegaterium.strain.AIMST(JQ012010.1)、Alcaligenessp.(AJ002808.1)和Alcaligenessp.(EF540877.1)。綜合形態(tài)特征和16S rDNA序列分析結(jié)果，PP84菌株被鑒定為巨大芽孢桿菌。巨大芽孢桿菌是自然界中具有降解有機物性能的菌種之一[18]，實驗中巨大芽孢桿菌PP84可以在只有草甘膦作為碳源的液體無機鹽培養(yǎng)基上良好生長，可以證明該菌具有降解草甘膦的能力。

2.1.3 PP84在牛肉膏蛋白胨液態(tài)培養(yǎng)基中的生長曲線 由圖2可以看出，在LB培養(yǎng)基中的菌種，適應期只有6 h左右，6 h的OD600值為0.27。之后大約在10～12 h時為菌株P(guān)P84的生長對數(shù)期，12 h的OD600值為2.13。在培養(yǎng)16～20 h左右進入了穩(wěn)定期，18 h的OD600值為2.46。培養(yǎng)至24 h時OD600值為2.54。在30 h到達了最大生長量，30 h的OD600值為2.62。培養(yǎng)至36 h時，OD600值為2.69。42 h的OD600值為2.75。培養(yǎng)至48 h時的OD600值為2.81。由此可以看出，菌株P(guān)P84培養(yǎng)到30 h時，生長逐漸緩慢，生長量的變化不再明顯，由此菌株P(guān)P84進入了生長穩(wěn)定期。本實驗取在生長對數(shù)期的菌株，即取10 h的菌液為母液，以5%的接種量接入含草甘膦的無機鹽培養(yǎng)基中。

圖2 菌株生長曲線圖

2.2 菌株的降解特性討論分析

2.2.1 PP84降解菌在不同濃度草甘膦的降解量的分析 圖3為草甘膦起始濃度在100、250、500 mmol/L時的草甘膦降解率曲線。從圖中可以看出，PP84菌株對草甘膦降解性能良好，無明顯差異，隨著菌株的生長，草甘膦降解率逐漸升高。在試驗條件下，菌株P(guān)P84在100 mmol/L、250 mmol/L、500 mmol/L的草甘膦培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h之后的降解率分別為48.02%、51.24%、54.67%。

圖3 不同濃度草甘膦的降解量

2.2.2 pH對菌株P(guān)P84降解草甘膦的影響分析 在草甘膦含量為250 mmol/L的培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)其pH分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和 9.0，可得出菌株P(guān)P84在不同pH環(huán)境下對草甘膦的降解情況，如圖4所示。由圖可以看出，當pH 1～3時，菌株P(guān)P84生長受到迫害，生長受到抑制，導致菌株P(guān)P84降解草甘膦的作用較小，草甘膦降解率最高僅能達到3.2%左右。當調(diào)節(jié)至pH 4.0時，菌株P(guān)P84生長情況明顯變好，對草甘膦的降解作用也明顯增強，降解率突增至20.5%。當逐漸調(diào)至中性時，隨著環(huán)境的酸度越來越小，菌株P(guān)P84逐漸適應環(huán)境并且生長情況逐漸變好，當調(diào)節(jié)至pH 6.0時，在此環(huán)境下，菌株P(guān)P84的生長情況最為良好，降解作用也最大，培養(yǎng)48 h后的降解率達到55.9%。當調(diào)節(jié)至pH 7.0時，由于菌株P(guān)P84本身的適應條件，雖然環(huán)境為中性，但菌株P(guān)P84的生長量較pH 6.0時略有下降，故其降解草甘膦的作用也比pH 6.0時的作用要小，其降解率降至為34.7%。當調(diào)節(jié)至pH 8.0、9.0時，環(huán)境逐漸偏于堿性，菌株P(guān)P84在此環(huán)境下的生長量也降低，降解率同時降低，當調(diào)節(jié)至pH 9.0時，草甘膦降解率降至為22.1%。

圖4 不同pH下草甘膦的降解量

2.2.3 重金屬Cu2+、Cd2+對菌株P(guān)P84菌種降解草甘膦的影響 為進一步研究重金屬離子對菌株降解性能的影響，本實驗選取Cu2+、Cd2+作為代表研究其對PP84菌株降解性能的影響。圖5顯示Cu2+對PP84菌株降解草甘膦性能的影響。由圖可以看出，菌株P(guān)P84在培養(yǎng)10 h后，未添加Cu2+時，草甘膦降解率能達到65.6%，當Cu2+為50 mg/kg時，降解率稍有下降，但仍能達到58.9%，當Cu2+濃度在150 mg/kg時，降解率下降明顯，僅為37.9%。由此可以看出，重金屬Cu2+對菌株有一定的毒害作用，能影響PP84菌株對草甘膦的降解性能，在一定范圍內(nèi)，隨著Cu2+離子濃度的增加，毒害作用增強，會抑制草甘膦的降解。

圖5 Cu2+對草甘膦降解的影響

Cd2+其毒性較強，對菌株P(guān)P84降解草甘膦的作用有一定的抑制[19]。試驗探究了Cd2+對菌株P(guān)P84降解草甘膦的影響，結(jié)果如圖6所示。由圖可看出，菌株P(guān)P84在培養(yǎng)10 h后，表現(xiàn)出與Cu2+相似的趨勢，隨著Cd2+濃度的增大，對菌株P(guān)P84生長的抑制作用就越強，草甘膦降解率就越低。在CK組中，草甘膦降解率能達到60%，而當濃度為0.25 mg/kg時，重金屬對菌株P(guān)P84起了毒害作用，致使PP84對草甘膦的降解作用受到阻礙，降解率降低為50.4%。濃度為2.5 mg/kg時，降解率為28.8%。由此可以看出，Cd2+濃度越大，對菌株P(guān)P84的生長越有害?！锻寥拉h(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風險管控標準（試行）》[20]農(nóng)用地土壤防控污染風險管控值鎘的濃度在pH 5.5～7.5的范圍內(nèi)為3.0 mg/kg，通過對比發(fā)現(xiàn)，PP84菌株也可以用于重金屬Cu、Cd污染的土壤中草甘膦污染的生物修復。

圖6 Cd2+對草甘膦降解的影響

3 討論

本實驗中從青島市某污水處理廠活性污泥中，以草甘膦為唯一碳源進行篩選和富集得到菌株后，選出一株作為實驗菌株P(guān)P84，通過對它的形態(tài)的觀察得到該菌株呈乳白色，表面光滑濕潤，芽胞為圓形。通過生化實驗，得出菌株P(guān)P84為革蘭氏陽性菌。再通過DNA序列的對比，菌株P(guān)P84鑒定為巨大芽孢桿菌。實驗中巨大芽孢桿菌PP84可以在只有草甘膦作為碳源的液體無機鹽培養(yǎng)基上良好生長，可以證明該菌具有降解草甘膦的能力。運用紫外分光光度法測定PP84菌在草甘膦中的生長情況和草甘膦的降解率進一步證明了這個事實。

3.1 菌株的降解特性分析

環(huán)境中草甘膦的濃度對巨大芽孢桿菌降解草甘膦的特性有一定的作用。在一定范圍內(nèi)，隨著草甘膦濃度的增加，降解作用越好，降解效率也越大。當草甘膦濃度達到500 mmol/L時，PP84菌株可以得到很多的營養(yǎng)而迅速的生長，導致降解率也不斷的增加，表現(xiàn)出最好的降解性能。但根據(jù)韓麗珍等[21]的研究表明，當草甘膦濃度增加到一定的濃度后，會因為草甘膦本身的毒性，對降解菌起一定的毒害作用，從而明顯抑制菌株的生長，導致降解率的下降[22-23]。

3.2 不同pH對草甘膦的降解量的影響

在對環(huán)境因素pH影響巨大芽孢桿菌PP84降解草甘膦的特性研究中發(fā)現(xiàn)，巨大芽孢桿菌菌株對酸堿的變化能夠很好的適應，雖然不能在強酸(pH＜2.0)和堿性條件下良好生長，但適應范圍較寬，并且在pH 6.0時，菌株生長情況會最好，對草甘膦的降解作用也可達到最好。通過對比膠紅酵母菌等[24]的研究可以得知，膠紅酵母有很強的適應環(huán)境的能力同時對草甘膦的耐受力很強[25-26]，相比較下來，本實驗篩選出來的菌株P(guān)P84，適應環(huán)境能力和降解效率雖沒有膠紅酵母高，但其具有較寬的酸堿適應范圍，能夠適應環(huán)境中酸堿變化，值得篩選富集并運用。

3.3 重金屬Cu2+、Cd2+對菌株P(guān)P84菌種降解草甘膦的影響

當環(huán)境中有重金屬時，因為重金屬毒害作用，所以對巨大芽孢桿菌的生長也起一定的抑制作用，從而抑制降解，抑制作用隨著重金屬的濃度增大而增大[27]。這個在重金屬環(huán)境下的降解特性與劉麗琴等[28]研究的草甘膦降解菌是有一定的差異，本實驗的菌株P(guān)P84無論在Cd2+還是在Cu2+的條件下菌株的生長都受到重金屬的抑制，且抑制作用隨著重金屬離子濃度的增大而增大，根據(jù)劉麗琴等的研究，降解菌G-6在有Cu2+的條件下降解草甘膦的作用，雖然同樣受到抑制，但其在高濃度Cu2+的時候抑制作用反而不及低濃度的抑制作用，這主要由菌株本身的特性決定的。與其他草甘膦降解菌的特性相比，菌株P(guān)P84生長迅速且在對不同濃度的草甘膦的降解作用都很客觀，運用反而較廣。且菌株P(guān)P84的耐酸堿性更為寬泛，對重金屬的耐受性較寬，可以運用在工農(nóng)業(yè)廢水之中。

4 結(jié)論

通過實驗可以得出，從青島某污水廠活性污泥中篩選的PP84菌株能夠在以草甘膦為唯一碳源的基礎鹽培養(yǎng)基上生長，已證明其能夠利用草甘膦，且在合適的培養(yǎng)基(pH 6,250 mmol/L)中，48 h的草甘膦降解率可達到55.9%。在對環(huán)境因素影響巨大芽孢桿菌PP84草甘膦降解特性的研究中發(fā)現(xiàn)，菌株P(guān)P84對酸堿的變化能夠很好的適應，雖然不能在強酸(pH＜2.0)的條件下良好生長，但適應范圍較寬，并且在特定的pH下，菌株生長情況會很好，對草甘膦的降解作用也可達到最好。當環(huán)境中有Cu、Cd重金屬時，因為重金屬毒害作用，對巨大芽孢桿菌的生長起一定的抑制作用，抑制作用隨著重金屬的濃度增大而增大。但與其他草甘膦降解菌的特性相比，菌株P(guān)P84生長迅速且在對不同濃度的草甘膦的降解作用都很客觀，且菌株P(guān)P84的耐酸堿性更為寬泛，對重金屬的耐受性較寬，可以運用在改善農(nóng)藥污染土壤和水體的工程中。因為它的生長量和對外界的適應效果很好，所以是一種可以長期使用的菌種，且因為菌株的耐受力比較強，不僅可以將其運用在含草甘膦的工業(yè)農(nóng)業(yè)廢水處理之中，同時對于土壤修復也具有重要意義，因此，該菌株P(guān)P84具有良好的應用前景。