化瘀通絡(luò)中藥通過抑制TGF-β1/ERK通路減輕糖尿病腎病大鼠腎纖維化研究

郭 帥，方 敬，楊 帆，李雅純，陳志強(qiáng),2*

1.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050000

2.河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050000

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見且嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎臟病的主要原因[1]。DN的主要病理改變?yōu)槟I小球和腎間質(zhì)內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度沉積，導(dǎo)致腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化[2]。轉(zhuǎn)化細(xì)胞因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是重要的致纖維化因子[3]。Smad依賴的信號(hào)通路是傳導(dǎo)TGF-β1的主要通路，此外，Smad非依賴的TGF-β1信號(hào)通路在腎纖維化中也具有重要作用[4]。Smad非依賴途徑以細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號(hào)通路為主，ERK信號(hào)通路是TGF-β1介導(dǎo)腎纖維化的另一重要信號(hào)通路[5]。因此，阻斷TGF-β1/ERK信號(hào)通路對(duì)于防治DN腎纖維化具有重要意義。

DN經(jīng)久不愈，久病多瘀、久病入絡(luò)。瘀血阻絡(luò)是DN的基本病機(jī)，化瘀通絡(luò)中藥臨床上對(duì)DN具有較好的療效[6-7]。課題組前期研究從DN大鼠的一般情況和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)等方面證實(shí)了DN中“血瘀證”的客觀存在[8]，并篩選出化瘀通絡(luò)中藥治療DN大鼠的最佳劑量，化瘀通絡(luò)中藥具有腎保護(hù)作用，作用比陽性對(duì)照藥物厄貝沙坦更穩(wěn)定、持久；化瘀通絡(luò)中藥能夠通過抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路來減輕DN腎病理損傷[9-12]。本研究探討化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN大鼠腎組織TGF-β1/ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，3～5周齡，體質(zhì)量60～80 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006。動(dòng)物飼養(yǎng)于河北中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房，溫度（23±2）℃、濕度50%～70%，12 h光照/12 h黑暗交替，通風(fēng)良好，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)DWLL2020052）。

1.2 藥品與試劑

化瘀通絡(luò)中藥所用藥物為顆粒劑，均由廣東一方制藥有限公司惠贈(zèng)，規(guī)格如下：丹參（批號(hào)8080971，1.8 g/袋，相當(dāng)于10 g飲片）、川芎（批號(hào)8122561，1.3 g/袋，相當(dāng)于6 g飲片）、地龍（批號(hào)7125701，1.0 g/袋，相當(dāng)于10 g飲片）、水蛭（批號(hào)8081351，1.5 g/袋，相當(dāng)于3 g飲片）、全蝎（批號(hào)8050111，1.0 g/袋，相當(dāng)于3 g飲片）；高脂飼料（批號(hào)HD001）購自北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；鏈脲佐菌素（批號(hào)S8050）購自北京索萊寶科技有限公司；肌酐試劑盒（批號(hào)AUZ3562）、尿素氮試劑盒（批號(hào)AUZ3611）、尿酸試劑盒（批號(hào)AUZ3629）購自美國Beckman公司；III型膠原（collagen type III，Col-III）兔多克隆抗體（批號(hào)GB111629）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體（批號(hào)GB23303）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；TGF-β1兔單克隆抗體（批號(hào)ab215715）購自英國Abcam公司；β-actin小鼠單克隆抗體（批號(hào)AF0003）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；c-Raf兔單克隆抗體（批號(hào)53745）、磷酸化c-Raf（p-c-Raf）兔單克隆抗體（批號(hào)9427）、絲裂原活化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（mitogen-activated extracellular signal regulated kinase，MEK）兔單克隆抗體（批號(hào)8728）、p-MEK兔單克隆抗體（批號(hào)9154）、兔單克隆抗體（批號(hào)4695）、p-ERK兔單克隆抗體（批號(hào)4376）購自美國CST公司。

1.3 儀器

HEMIX-180全自動(dòng)生化分析儀（日本Sysmex公司）；Active血糖儀（瑞士Roche公司）；RM2016病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；BX51光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；Case Viewer 2.2掃描瀏覽軟件（匈牙利3DHISTECH公司）；Image-Pro Plus 6.0圖片分析軟件（美國Media Cybemetics公司）；Stepone plus熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；22331 hamburg蛋白濃度定量?jī)x（德國Eppendorf公司）；DYCZ-24DN電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；WSE-4040半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)（日本ATTO公司）；Odyssey紅外激光掃描儀（美國LI-COR公司）。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)選取10只作為對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)，其余大鼠給予高脂飼料飼養(yǎng)6周。大鼠禁食不禁水12 h，對(duì)照組ip枸櫞酸緩沖液，其余ip鏈脲佐菌素（40 mg/kg），72 h后于尾靜脈連續(xù)采血3次，血糖≥16.7 mmol/L則表明DN模型制備成功。造模過程中無大鼠死亡，2只大鼠血糖＜16.7 mmol/L予以剔除。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組和化瘀通絡(luò)中藥組，每組14只?；鐾ńj(luò)中藥組丹參、川芎、地龍、水蛭、全蝎劑量分別為1.35、1.08、0.9、0.54、0.54 g/kg（以中藥飲片量計(jì)），相當(dāng)于臨床等效劑量，以上5種顆粒按劑量配比混勻，溶于熱純凈水配制成混懸液，放置至室溫?；鐾ńj(luò)中藥組ig相應(yīng)藥物，對(duì)照組和模型組ig等體積純凈水，1次/d，連續(xù)16周。

2.2 化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN大鼠空腹血糖的影響

給藥第0、4、8、12、16周末，大鼠尾靜脈采血，采用血糖儀檢測(cè)各組大鼠空腹血糖水平。

2.3 化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN大鼠血清中肌酐、尿素氮和尿酸水平的影響

給藥結(jié)束后，大鼠禁食12 h，ip 10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉，腹主動(dòng)脈采血，離心取上清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清中肌酐、尿素氮和尿酸水平。

2.4 化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN大鼠腎臟組織病理變化的影響

大鼠脫頸椎處死，取腎組織于4%中性甲醛中固定，梯度乙醇脫水、透明、浸蠟后，石蠟包埋并切片（厚3 μm），進(jìn)行PAS和Masson染色，脫水后，中性膠封片，于顯微鏡下觀察腎臟病理變化。PAS染色中，糖蛋白呈紅色，細(xì)胞核呈淺藍(lán)色；Masson染色中，膠原纖維呈藍(lán)色，免疫復(fù)合物、纖維蛋白呈紅色。

2.5 化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN大鼠腎組織Col-III和TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

取各組大鼠腎組織石蠟切片，于二甲苯常規(guī)脫蠟，加入檸檬酸抗原修復(fù)，于3%雙氧水溶液室溫避光孵育25 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，于3%牛血清白蛋白中室溫封閉30 min，分別加入Col-III抗體（1∶300）、TGF-β1抗體（1∶500），4 ℃孵育過夜；加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體，室溫孵育50 min，DAB顯色并水洗后，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。于顯微鏡下觀察，細(xì)胞核為藍(lán)色，陽性表達(dá)為棕黃色。

2.6 化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN大鼠腎組織TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響

按照試劑盒說明書提取各組大鼠腎組織總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列：TGF-β1上游引物5’-ATGGTGGACCGCAACAAC-3’，下游引物5’-TGAGCACTGAAGCGAAAGC-3’；GAPDH上游引物5’-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3’，下游引物5’-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3’。

2.7 化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN大鼠腎組織c-Raf、p-c-Raf、MEK、p-MEK、ERK和p-ERK蛋白表達(dá)的影響

取各組大鼠腎組織，加入裂解液勻漿，提取總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫封閉30 min，分別加入c-Raf抗體（1∶600）、p-c-Raf抗體（1∶750）、MEK抗體（1∶600）、p-MEK抗體（1∶800）、ERK抗體（1∶600）、p-ERK抗體（1∶750）、β-actin抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體，室溫孵育30 min后顯影，采用Quantity one軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以±s表示，方差齊者采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；方差不齊者采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠死亡情況

給藥16周內(nèi)，模型組大鼠死亡4只，化瘀通絡(luò)中藥組大鼠死亡3只。經(jīng)大體解剖發(fā)現(xiàn)5只大鼠死于感染，表現(xiàn)為皮下多發(fā)膿腫及腎膿腫；另2只大鼠死亡原因不明確，推測(cè)與高血糖導(dǎo)致的酮癥酸中毒或高滲性高血糖狀態(tài)有關(guān)。

3.2 化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN大鼠空腹血糖的影響

如圖1所示，給藥第0、4、8、12、16周末，與對(duì)照組比較，模型組大鼠空腹血糖水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，化瘀通絡(luò)中藥組大鼠空腹血糖水平無明顯變化。

圖1 化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN大鼠空腹血糖的影響 (±s )Fig.1 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on fasting blood glucose in DN rats (±s)

3.3 化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN大鼠血清中肌酐、尿素氮和尿酸水平的影響

如表1所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中肌酐、尿素氮和尿酸水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，化瘀通絡(luò)中藥組大鼠血清中肌酐和尿素氮水平顯著降低（P＜0.01），尿酸水平有所降低，但無顯著性差異。

表1 化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN大鼠血清中肌酐、尿素氮和尿酸水平的影響 (±s)Table 1 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on levels of creatinine,urea nitrogen and uric acid in serum of DN rats(±s)

表1 化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN大鼠血清中肌酐、尿素氮和尿酸水平的影響 (±s)Table 1 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on levels of creatinine,urea nitrogen and uric acid in serum of DN rats(±s)

與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01##P ＜ 0.01 vs control group; **P ＜ 0.01 vs model group

組別 n 肌酐/(μmol·L?1) 尿素氮/(mmol·L?1) 尿酸/(μmol·L?1)對(duì)照 10 24.57±3.18 8.22±1.62 43.97±10.68模型 10 58.10±7.75## 18.68±1.49## 88.27±23.82##化瘀通絡(luò)中藥 11 44.85±5.71** 13.45±2.78** 70.74±16.05

3.4 化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN大鼠腎臟組織病理變化的影響

如圖2所示，對(duì)照組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)正常，腎小球、腎小管及間質(zhì)均無異常改變；模型組大鼠腎小球毛細(xì)血管袢肥大，基底膜輕中度增厚，系膜細(xì)胞和基質(zhì)輕中度增生，腎小管空泡和顆粒變性，局灶狀萎縮，腎間質(zhì)有較多的膠原纖維沉積；與模型組比較，化瘀通絡(luò)中藥組大鼠腎臟損傷和膠原纖維沉積均有一定程度地減輕。

圖2 化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN大鼠腎臟組織病理變化的影響(×200)Fig.2 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on pathological changes of kidneys in DN rats (× 200)

3.5 化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN大鼠腎組織Col-III和TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，對(duì)照組大鼠腎間質(zhì)有少量Col-III和TGF-β1蛋白沉積；模型組大鼠腎小管間質(zhì)Col-III和TGF-β1陽性表達(dá)增加；化瘀通絡(luò)中藥組大鼠腎間質(zhì)Col-III和TGF-β1沉積減少。

圖3 化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN大鼠腎組織Col-III和TGF-β1蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on expressions of Col-III and TGF-β1 in kidney tissue of DN rats

3.6 化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN大鼠腎組織TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響

如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠TGF-β1mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，化瘀通絡(luò)中藥組大鼠TGF-β1mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。

圖4 化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN大鼠腎組織TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響 (±s )Fig.4 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on TGF-β1 mRNA level in kidney tissue of DN rats (±s)

3.7 化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN大鼠腎組織p-c-Raf、p-MEK和p-ERK蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織p-c-Raf、p-MEK和p-ERK蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，化瘀通絡(luò)中藥組大鼠腎組織p-c-Raf、p-MEK和p-ERK蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。

圖5 化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN大鼠腎組織p-c-Raf、p-MEK和p-ERK蛋白表達(dá)的影響 (±s )Fig.5 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on expressions of p-c-Raf,p-MEK and p-ERK in kidney tissue of DN rats(±s)

4 討論

瘀血既是DN的主要病理產(chǎn)物，又是其重要致病因素，貫穿DN始終。DN病程冗長，葉天士在《臨證指南醫(yī)案》中強(qiáng)調(diào)“凡經(jīng)主氣，絡(luò)主血，久病血瘀”“初為氣結(jié)在經(jīng)，久則血傷入絡(luò)”。瘀阻腎絡(luò)，氣血不暢，水谷精微外泄而見蛋白尿；瘀血阻絡(luò)，新血不生，脾腎失養(yǎng)，水濕停滯，故見水腫；DN晚期，脾腎衰微、瘀血內(nèi)停、三焦壅滯、氣機(jī)逆亂，可見惡心、嘔吐、納差。因此，瘀血阻絡(luò)是貫穿DN全程的主體病機(jī)。化瘀通絡(luò)法是DN的基本治法，在辨證論證的基礎(chǔ)上加用化瘀通絡(luò)中藥成為治療DN的基本原則。課題組經(jīng)過多年的臨證篩選，最終確定了丹參、川芎、地龍、水蛭和全蝎5味中藥作為相對(duì)固定的治療DN的化瘀通絡(luò)藥物。《血證論·瘀血》謂“瘀血在經(jīng)絡(luò)臟腑之間，則結(jié)為癥瘕”，《醫(yī)宗必讀》曰“蓋積之為義，日積月累，匪伊朝夕”，可見瘀血久不消散，息以成積，深入于絡(luò)，難以祛之，故在使用丹參、川芎常規(guī)活血化瘀藥物的基礎(chǔ)上，加用水蛭、地龍、全蝎等蟲類藥入絡(luò)搜剔，此5種藥合用，共奏化瘀通絡(luò)之效，可使絡(luò)脈得通、瘀滯盡去。

DN的病理特征為正常腎單位丟失、大量肌成纖維細(xì)胞激活和增殖、ECM過度沉積、腎小球和腎小管基底膜增厚、腎小球內(nèi)K-W結(jié)節(jié)形成、小管間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致DN腎纖維化[2]。膠原是ECM的骨架結(jié)構(gòu)，Col-III是腎間質(zhì)ECM的主要成分。因此，檢測(cè)腎組織中Col-III蛋白表達(dá)，對(duì)評(píng)估腎纖維化程度、判定DN預(yù)后具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠出現(xiàn)了DN典型的病理改變，腎組織Col-III蛋白表達(dá)增多，血清中肌酐、尿素氮、尿酸水平升高，表明DN模型制備成功；化瘀通絡(luò)中藥顯著減輕了腎病理損害和纖維化程度；模型組大鼠空腹血糖水平顯著升高，化瘀通絡(luò)中藥無明顯降糖作用，提示化瘀通絡(luò)中藥對(duì)DN的腎保護(hù)作用并不依賴于降低血糖。

TGF-β1是腎纖維化的重要刺激因子，TGF-β1與細(xì)胞膜上的受體（TβRI、TβRII）結(jié)合，激活c-Raf/MEK/ERK途徑，在腎纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。c-Raf是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，活化的c-Raf磷酸化雙特異性激酶MEK，繼而磷酸化ERK，活性ERK易位進(jìn)入細(xì)胞核或在細(xì)胞質(zhì)中磷酸化多種底物，使細(xì)胞對(duì)外來信號(hào)產(chǎn)生生物學(xué)應(yīng)答[13]。ERK是絲裂原活化蛋白激酶家族（mitogen-activated protein kinase，MAPK）中研究最廣泛的成員，ERK分為ERK1和ERK2 2種亞型，二者基因同源性為84%，負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、衰老、死亡、遷移等生理過程。白色念珠菌感染導(dǎo)致的小鼠腎纖維化模型中，TGF-β1/c-Raf/ERK1/2處于高度激活狀態(tài)，c-Raf抑制劑可顯著減輕腎纖維化和損傷[14]。ERK信號(hào)通路在多種腎纖維化動(dòng)物模型中均呈激活狀態(tài)，抑制該通路可以改善腎纖維化[15-18]。TGF-β1可激活體外培養(yǎng)的足細(xì)胞ERK信號(hào)通路，并誘導(dǎo)金屬基質(zhì)蛋白酶-9表達(dá)，從而抑制ECM降解[19]。在高糖處理的小鼠系膜細(xì)胞SV40-MES13中，抑制長非編碼RNA ANRIL可以通過抑制Wnt/β-catenin和MEK/ERK通路，從而抑制細(xì)胞增殖、炎癥和纖維化[20]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腎組織中TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著升高，p-c-Raf、p-MEK和p-ERK蛋白表達(dá)水平顯著升高；化瘀通絡(luò)中藥顯著下調(diào)TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)水平，顯著降低p-c-Raf、p-MEK和p-ERK蛋白表達(dá)水平，表明化瘀通絡(luò)中藥能夠抑制DN大鼠腎組織TGF-β1/ERK信號(hào)通路的激活。

綜上所述，化瘀通絡(luò)中藥能夠改善DN大鼠的腎病理損傷和腎纖維化，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1/ERK信號(hào)通路有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突