苗藥熏蒸驗(yàn)方對體外培養(yǎng)骨性關(guān)節(jié)炎家兔軟骨組織的治療作用及機(jī)制研究①

張 琪 王 琳 李田洋 鄭曙光 貴州中醫(yī)藥大學(xué)貴陽550025

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是由多種因素引起的高發(fā)病率關(guān)節(jié)疾病,主要是骨、軟骨及滑膜等代謝變化導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)炎癥和破壞,甚至累及關(guān)節(jié)周圍組織的全方位慢性退行性病變,其典型癥狀為關(guān)節(jié)腫痛、畸形、活動時出現(xiàn)磨擦聲等,以膝關(guān)節(jié)受累最為常見,高發(fā)于女性及中老年患者[1-3]。OA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、起病隱匿、病程長、易復(fù)發(fā)、難痊愈,導(dǎo)致其致殘率居高不下,損傷患者身心健康,降低患者生存質(zhì)量。目前OA的病因及機(jī)制尚未明確,故尚無理想治療方案。課題組在臨床治療及前期實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn),苗熏驗(yàn)方對關(guān)節(jié)軟骨損傷性關(guān)節(jié)炎具有一定治療作用,抗炎鎮(zhèn)痛效果良好[4-6]。而在體外培養(yǎng)軟骨組織的藥效學(xué)研究尚未見報(bào)道,因此,本研究以碘乙酸鈉誘導(dǎo)OA家兔模型,分離培養(yǎng)目標(biāo)軟骨組織塊,苗熏驗(yàn)方水溶液培養(yǎng),研究苗熏驗(yàn)方有效成分對家兔退行性關(guān)節(jié)軟骨炎癥因子、二型膠原蛋白(COL-Ⅱ)和基質(zhì)金屬蛋白酶的影響,探討其防治關(guān)節(jié)軟骨退變的可能機(jī)制,進(jìn)一步驗(yàn)證苗熏驗(yàn)方緩解OA炎癥疼痛的機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康成年新西蘭大白兔36只,體重(2.0±0.2)kg,購自重慶騰鑫養(yǎng)殖公司,許可證號:SCXK(渝)2017-001。清潔級動物房飼養(yǎng),室溫下復(fù)合飼料喂養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑與儀器 苗醫(yī)熏蒸液組方由大血藤、小血藤、雞血藤、透骨香、飛龍掌血、骨碎補(bǔ)、淫羊藿等12味藥材組成,均購自貴州同濟(jì)堂(按配方比例稱取,以8倍水浸泡2 h,蒸餾冷凝提取藥物有效成分50 ml,相當(dāng)于生藥藥液3.6 g/ml,0.22μm微孔濾膜過濾,-20℃保存?zhèn)溆?；D-(+)-Glucosamine HCl(批號:G8240)購自北京索萊寶生物科技有限公司；Rabbit IL-1βELISA Kit(批號:JYM0011Rb)、Rabbit TNF-αELISA Kit(批號:JYM0003Rb)購自武漢基因美生物科技有限公司；Rabbit Anti-COL-Ⅱ(批號:bs-6319R)購自Bioss生物有限公司；酶標(biāo)儀(型號:1510)購自賽默飛世爾有限公司；水平電泳儀(型號:JY300)購自君意東方電泳設(shè)備有限公司；PCR儀(型號:EDC-810)購自東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物造模、分組及給藥 新西蘭大白兔隨機(jī)分為2組,正常組6只,模型組30只。以7.5 mg/kg劑量向雙膝關(guān)節(jié)腔推注碘乙酸鈉溶液復(fù)制膝骨OA模型[7]。造模成功后,取軟骨組織,切取表層尺寸為3 mm×3 mm×1 mm的軟骨組織塊作為實(shí)驗(yàn)對象,分為模型組、陽性對照組、苗熏低、中、高劑量組,與正常組共同培養(yǎng)2 d和4 d,陽性對照組于完全培養(yǎng)液中稀釋鹽酸氨基葡萄糖為10 mmol/L,苗熏低、中、高劑量組于完全培養(yǎng)液中培養(yǎng),稀釋原冷凝蒸餾提取的苗熏藥物原液培養(yǎng),分別為360、720、1 440 mg/ml,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)2 d和4 d。培養(yǎng)完成后采集軟骨組織培養(yǎng)樣品和培養(yǎng)上清液于-80℃待測。

1.2.2 ELISA檢測軟骨組織體外培養(yǎng)上清液IL-1β、TNF-α水平 Trizol法提取軟骨組織培養(yǎng)液,3 000 r/min離心20 min,取上清,ELISA測定IL-1β、TNF-α水平,按照試劑盒說明書操作。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR法檢測MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA在軟骨組織中的表達(dá) 提取軟骨組織總RNA。當(dāng)OD260/OD280值為1.8～2.0時,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為RNA,根據(jù)RT-PCR擴(kuò)增試劑盒說明檢測mRNA水平,2-ΔΔCt法計(jì)算。引物序列見表1。

1.2.4 Western blot檢測軟骨組織COL-Ⅱ蛋白表達(dá) 在剪碎的組織塊中加入RAPI裂解液裂解,充分勻漿,冰上裂解,離心收集上清,BCA定量法測定蛋白濃度,沸水中變性,取40μg上樣,凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,浸泡于COL-Ⅱ抗體(1∶2 000)孵育液中4℃孵育過夜,加入二抗(1∶50 000)室溫孵育,ECL顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以表示,統(tǒng)計(jì)分析前進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn),組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 家兔軟骨組織培養(yǎng)上清IL-1β、TNF-α水平相同培養(yǎng)時間,與正常組相比,模型組IL-1β、TNF-α水平明顯上調(diào)(P＜0.05),與模型組相比,苗熏驗(yàn)方低、中、高劑量組及陽性對照組IL-1β、TNF-α水平明顯下調(diào)(P＜0.05),相同組不同培養(yǎng)時間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,表2)。提示苗藥熏蒸驗(yàn)方可降低OA軟骨組織炎癥因子IL-1β、TNF-α水平,抑制軟骨基質(zhì)降解,修復(fù)軟骨組織。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

表2 培養(yǎng)上清中IL-1β、TNF-α表達(dá)(，ng/L)Tab.2 Expressions of IL-1βand TNF-αin culture supernatant(，ng/L)

表2 培養(yǎng)上清中IL-1β、TNF-α表達(dá)(，ng/L)Tab.2 Expressions of IL-1βand TNF-αin culture supernatant(，ng/L)

Note:Compared with Normal group,1)P＜0.05；compared with Model group,2)P＜0.05.

Groups IL-1β TNF-α 2 d 4 d Normal 17.10±0.63 16.96±0.67 6.31±0.59 6.98 2 d 4 d±0.19 Model 28.57±1.561) 26.29±0.751) 13.47±0.501) 13.13±1.181)Positive 23.99±0.732) 22.71±0.652) 10.99±0.802) 10.57±0.542)Low-dose 24.23±0.522) 23.31±0.242) 11.73±0.272) 11.46±0.572)Mid-dose 20.81±0.442) 20.83±0.682) 10.45±0.442) 9.99±0.372)High-dose 19.19±0.642) 17.74±1.132) 9.15±0.402) 8.53±1.42)

圖1 軟骨組織MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表達(dá)Fig.1 Expressions of MMP-3，MMP-9 and MMP-13 mRNA in cartilage

圖2 軟骨組織COL-Ⅱ蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of COL-Ⅱprotein in cartilage

2.2 家兔軟骨組織MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表達(dá) 相同培養(yǎng)時間中,與正常組相比,模型組MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05),與模型組相比,苗熏驗(yàn)方低、中、高劑量組及陽性對照組MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05),相同組不同培養(yǎng)時間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,圖1)。提示苗藥熏蒸驗(yàn)方可能通過調(diào)節(jié)MMPs mRNA表達(dá)改善關(guān)節(jié)軟骨病理狀態(tài)。

2.3 家兔軟骨組織COL-Ⅱ蛋白表達(dá) 相同培養(yǎng)時間中,與正常組相比,模型組COL-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05),與模型組相比,苗熏驗(yàn)方低、中、高劑量組及陽性對照組COL-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯上升(P＜0.05),相同組不同培養(yǎng)時間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,圖2)。提示苗藥熏蒸驗(yàn)方可能通過上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用。

3 討論

OA作為臨床常見慢性炎癥性疾病,以關(guān)節(jié)腔內(nèi)慢性炎癥和軟骨組織損傷為主要病理特征。研究顯示,SDF-1/CXCR4結(jié)合參與多種炎癥性疾病及炎癥調(diào)節(jié),信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)蛋白水解酶釋放,上調(diào)炎癥細(xì)胞因子表達(dá),導(dǎo)致軟骨分解合成代謝失衡,細(xì)胞外基質(zhì)破壞,炎癥反應(yīng)發(fā)生[8-9]。苗藥熏蒸驗(yàn)方為按照苗醫(yī)理論方劑收集的民間驗(yàn)方,在黔南、黔東南地區(qū)長期應(yīng)用于OA、股骨頭壞死等骨科疾病,方法獨(dú)特,簡便易行,療效確切,毒副作用較小,含有藤本類植物,苗醫(yī)理論認(rèn)為此類植物長而薄的分布與人體肌肉和筋脈相似,且具有通氣除風(fēng)散血和舒筋通脈活絡(luò)作用[10]；透骨香有祛風(fēng)除濕、理氣散寒止痛、活血通絡(luò)之功效；淫羊藿、骨碎補(bǔ)溫陽散寒,壯骨通痹,合用既能排毒、抗炎鎮(zhèn)痛,還可通筋脈,補(bǔ)氣、血,臨床常用于治療OA、股骨頭壞死、皮膚病等疾病,療效顯著[11]。前期研究發(fā)現(xiàn),苗熏療法可有效抑制OA兔軟骨中炎癥因子蛋白表達(dá),同時抑制OA軟骨細(xì)胞凋亡,延緩OA病理進(jìn)程,改善軟骨病變。提示苗藥熏蒸療法對OA家兔具有一定治療作用,但具體作用機(jī)制尚未明確[12]。苗熏驗(yàn)方曾作為臨床經(jīng)驗(yàn)方劑通過外用熏蒸療法直接用于臨床治療,將藥療及熱療相結(jié)合,針對早期股骨頭壞死臨床治療效果顯著,且優(yōu)于常規(guī)藥物治療對照組,療效確切、用藥安全,可明顯緩解關(guān)節(jié)腫痛,改善功能障礙等臨床癥狀和體征,提高患者生存質(zhì)量,并具有簡、便、廉、驗(yàn)等特點(diǎn)[6]。課題組前期已進(jìn)行了較為系統(tǒng)的苗醫(yī)理論和驗(yàn)方的調(diào)查整理工作,并進(jìn)行了動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究,苗醫(yī)熏蒸療法不僅可改善實(shí)驗(yàn)動物局部血液循環(huán)、降脂、改善骨組織結(jié)構(gòu),而還可改善臨床癥狀,縮短病程。

本研究采用關(guān)節(jié)腔注射碘乙酸鈉法復(fù)制OA家兔模型,檢測不同劑量苗藥熏蒸驗(yàn)方水溶液對體外培養(yǎng)OA家兔關(guān)節(jié)軟骨組織炎癥因子水平的影響,結(jié)果表明苗熏驗(yàn)方有效成分可顯著降低以活化單核巨噬細(xì)胞為主的促炎因子IL-1β和TNF-α水平。TNF-α與IL-1β存在協(xié)同作用,TNF-α不僅可破壞軟骨細(xì)胞,還可促進(jìn)IL-1β分泌,放大炎癥反應(yīng),加重軟骨組織損傷。研究顯示,人或動物OA模型中IL-1β、TNF-α水平均明顯提高[13-14]。因此,本研究結(jié)果表明苗藥熏蒸驗(yàn)方可通過減少IL-1β、TNF-α分泌抑制OA家兔軟骨組織損傷。

關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞及周圍細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成,細(xì)胞外基質(zhì)主要由膠原蛋白和蛋白多糖組成。其中COL-Ⅱ占膠原蛋白90%以上,是關(guān)節(jié)軟骨的主要膠原成分,維持軟骨表型結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能,為軟骨細(xì)胞外基質(zhì)提供支架及彈性。當(dāng)軟骨退化速度遠(yuǎn)快于合成速度時,意味著軟骨細(xì)胞分泌大量水解酶,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中最重要的蛋白水解酶之一,是一類鋅離子依賴性肽鏈內(nèi)切酶,直接參與軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)移、代謝和凋亡,促進(jìn)基質(zhì)蛋白和膠原降解,導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨纖維結(jié)構(gòu)受損,引起關(guān)節(jié)軟骨抗外力作用降低,從而導(dǎo)致軟骨損傷,同時受IL-1β等炎癥因子影響,介導(dǎo)軟骨損傷。其中MMP-3具有強(qiáng)大的基質(zhì)分解作用,可降解多型膠原,參與結(jié)締組織重構(gòu)；MMP-9多由炎癥細(xì)胞分泌,具有促凋亡作用,參與細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解過程；MMP-13通過抑制成骨細(xì)胞分泌COL-Ⅱ發(fā)揮膠原降解作用。研究顯示,MMP-3、MMP-9基因敲除小鼠OA得到明顯改善[15-16],且體外通過TNF-α誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞并敲除MMP-3、MMP-13可明顯抑制膠原蛋白和聚集蛋白聚糖降解。本研究進(jìn)一步探討苗藥熏蒸驗(yàn)方對OA大鼠軟骨組織中細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解蛋白表達(dá)的影響,表明苗藥熏蒸驗(yàn)方可明顯上調(diào)COL-Ⅱ蛋白表達(dá),下調(diào)MMP-3、MMP-9、MMP-13基因表達(dá),維持軟骨基本結(jié)構(gòu)。對比2 d和4 d的研究結(jié)果,藥物干預(yù)組無明顯差異,說明苗熏驗(yàn)方水溶液在軟骨組織的治療中具有穩(wěn)定性,具有較高臨床價值。

綜上所述,苗藥熏蒸驗(yàn)方可通過促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成,抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解,減少炎癥因子分泌,進(jìn)而抑制OA家兔軟骨組織損傷,療效確切,但遠(yuǎn)期療效有待進(jìn)一步研究。