舍曲林對CUMS抑郁癥大鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制研究①

岳凌峰 仲照希 馬 敬 王 寧 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院精神四科新鄉(xiāng)453002

抑郁癥是一種廣泛分布的衰弱性疾病,每年有超過3.5億人口受抑郁癥的影響[1]。抑郁癥患者常伴有情感性精神障礙,情緒持久低落并且對事物缺少興趣,還伴有體重的顯著變化、睡眠時長急劇縮減、精神亢奮或者萎靡等癥狀,嚴(yán)重者甚至產(chǎn)生自殺的念頭或行為等[1]。由世界精神病協(xié)會近期發(fā)表的數(shù)據(jù)顯示,抑郁癥發(fā)病率每年以113%的速度急劇遞增。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步,抑郁癥的病理生理學(xué)相關(guān)機(jī)制研究也取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展。目前國內(nèi)外諸多研究證實氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)均在抑郁癥疾病發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。相關(guān)動物實驗表明,炎癥因子能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生抑郁癥相關(guān)癥狀的行為,當(dāng)給動物進(jìn)行LPS和IL-1β刺激時,能誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生抑郁樣行為[2]。炎癥細(xì)胞因子經(jīng)外周神經(jīng)損傷誘導(dǎo)而過量表達(dá)時也有動物抑郁樣的表現(xiàn)[3-4]。臨床實驗還證明抑郁癥患者體內(nèi)的MDA和SOD水平顯著高于常人,但經(jīng)過藥物治療之后,便可以降低至正常水平[5-6]。舍曲林(sertraline,STL)又名左洛復(fù),是一種選擇性血清素再吸收抑制劑類抗抑郁藥物。起初即被用來治療重度抑郁癥、強(qiáng)迫癥、恐慌癥和社交焦慮癥等[7]。STL是目前最具潛力和最重要的五羥色胺抑制劑藥物之一,對重度抑郁癥具有非常好的效果[8-9]。有文獻(xiàn)報道,STL可以有效降低血清中IL-6、TNF-α的表達(dá)水平,同時還可以上調(diào)抑炎因子IL-10表達(dá),通過抑制體內(nèi)炎癥的方式來治療抑郁癥[10]。另外,RAWDIN等[11]研究報道,在重度抑郁癥患者當(dāng)中,氧化應(yīng)激標(biāo)志物F2-lsoPs的表達(dá)量與IL-6的表達(dá)水平呈正相關(guān)性。說明氧化應(yīng)激反應(yīng)在抑郁癥患者的發(fā)病機(jī)制中占有重要地位。本研究根據(jù)前人科研成果,探究STL在大鼠CUMS抑郁癥模型中,對炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的效果和作用機(jī)制,期望為抑郁癥的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 ICAM-1(貨號:ab171123)、Caspase-3(貨 號:ab13847)、Caspase-9(貨 號:ab202068)、GAPDH(貨號:1056)一抗及BDNF(貨號:ab99978)試劑盒購自美國Abcam公司。HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購自美國Santa Cruz公司。IL-4(貨號:EEL-R0014)、IL-10(貨號:E-EL-R0016)、SOD(貨號:E-EL-R1424)、MDA(貨號:E-EL-0060)、LDH(貨號:E-EL-R2547)、IL-1β(貨號:E-EL-M0037c)和IL-6(貨號:E-EL-R0015c)等ELISA試劑盒購自Elabscience。Click-iT?Plus TUNEL assay試劑盒(貨號:C10618)購自Invitrogen公司。

1.1.2 儀器 半干轉(zhuǎn)膜儀、電泳儀以及PCR儀均購于美國伯樂公司。Multiskan GO酶標(biāo)儀購自Thermo。Gel View 6000化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀購自廣州云星儀器有限公司。分析天平ME204購自梅特勒托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司。生物安全柜HR30-IIA2、-86℃超低溫冰箱DW-86L578J、-25℃低溫保存箱DW-25L262h和2～8℃醫(yī)用冷藏箱HYC-310購自海爾公司。Eppendorf臺式冷凍離心機(jī)5702R購自德國艾本德股份公司。

1.1.3 實驗動物 60只Sprague Dawley(SD)大鼠來源于中國科學(xué)院實驗動物中心,雄性,平均體重250～280 g,4～6周齡。

1.2 方法

1.2.1 大鼠抑郁癥模型建立 實驗前1周,大鼠可以自由獲得食物和水來適應(yīng)環(huán)境。溫度22℃左右,相對濕度約55%～60%,12 h晝夜交替進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)。以體重、日攝食量、糖濃度、自發(fā)性運(yùn)動距離5 min為基線最后將得分最接近的40只大鼠納入后續(xù)實驗,隨機(jī)平均分為對照組和抑郁模型組(n=20)。對照組大鼠正常飼養(yǎng),密度為5只/籠。抑郁模型組大鼠飼養(yǎng)密度為1只/籠,采用Willner報道的方法構(gòu)建抑郁模型。模型組大鼠受到13種類型的刺激,包括顛倒白天/黑夜(24和48 h)、重復(fù)45°傾斜鼠籠(每隔4、12和24 h)、斷水(6～12 h)、缺食物(12～24 h)、噪音(金屬沖突2 h和大鼠大聲叫嚷2 h)、濕墊、外來異物、無墊(6 h)、尾巴夾緊(輕微)、同籠、水平振動、籠子交換和喂養(yǎng)環(huán)境變化。每只大鼠每天只接受一種方法的刺激,并在籠子里單獨(dú)飼養(yǎng)35 d。從第4周開始,觀察總指標(biāo)(體重、飲料量和食物量)、糖水?dāng)z入量百分比和曠場運(yùn)動行為。大鼠分為4組:對照組(cTRL)、加藥組(STL,20 mg/kg,body weight)、模型組(CUMS)、治療組(STL+CUMS)[12]。

1.2.2 大鼠基本指標(biāo)檢測 各組處理過程中觀察記錄大鼠對蔗糖偏好。讓大鼠習(xí)慣于飲用兩瓶1%蔗糖溶液24 h,第二天用清水更換其中一瓶蔗糖溶液。經(jīng)過24 h后禁食、禁水后,允許大鼠飲用1%的蔗糖溶液(100 ml)和等量的水3 h。蔗糖偏好=蔗糖水消耗量/(純水消耗量+蔗糖水消耗量)×100%蔗糖水的體積。處理結(jié)束后稱量各組大鼠體重,提取大鼠血清,以備后續(xù)處理。

1.2.3 ELISA檢測炎癥因子 大鼠心內(nèi)取血1 ml,低溫離心機(jī)4 000 r/min離心8 min,取出上清液供實驗使用。加樣設(shè)置:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣品孔。酶標(biāo)包被的板子上加標(biāo)準(zhǔn)品50μl,先加入樣品稀釋液40μl于待測樣品孔,然后加待測樣品10μl。孵育:封板后37℃孵育30 min。液體配置:把30倍洗滌母液經(jīng)蒸餾水稀釋30倍留著備用。洗滌:緩慢揭掉封板膜,將液體棄去,甩干液體,每孔加洗滌液,放置30 s之后棄去,反復(fù)重復(fù)5次,拍干板子。加酶:每孔加酶標(biāo)試劑50μl,空白孔不加。孵育:再次封板后37℃孵育30 min。洗滌:小心取掉封板膜,甩干液體,每孔加適量洗滌液,放置30 s之后棄去,反復(fù)重復(fù)5次,拍干板子。顯色:各孔加入顯色劑A液50μl,再加顯色劑B液50μl緩慢震蕩混勻后,37℃避光進(jìn)行顯色10 min。終止:各孔加入50μl終止反應(yīng)液,反應(yīng)終止(終止后藍(lán)色立即轉(zhuǎn)為黃色)。測定:用空白孔進(jìn)行調(diào)零,450 nm波長下依次測量每孔吸光值(OD值)。測定應(yīng)在加入終止液后的15 min內(nèi)進(jìn)行。

1.2.4 免疫組織化學(xué)法分析組織中抗原表達(dá) 將組織從-86℃冰箱取出后用PBS緩沖液清洗8次,去掉壞死組織和血凝塊。4%多聚甲醛于4℃固定24 h。PBS緩沖液清洗3次,再用30%、50%和70%酒精依次清洗。脫水,石蠟包埋。1%Triton-100進(jìn)行處理15 min,3%H2O2處理15 min。5%的羊血清封閉30 min后,依次孵育一抗及二抗。染色封片。

3.全面性原則。綜合素質(zhì)測評要全面反映習(xí)近平總書記提出的要求，能夠從多個方面、多個層次和多個角度深入刻畫學(xué)生的綜合素質(zhì)狀態(tài)。全面性要求詳細(xì)刻畫學(xué)生的德育、體育和專業(yè)能力，指標(biāo)并不是越多越好，而是要客觀描述學(xué)生綜合素質(zhì)的靜態(tài)和動態(tài)特征。

1.2.5 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡 將裸鼠處死后腫瘤組織經(jīng)過石蠟包埋,二甲苯中脫蠟10 min,換用新鮮二甲苯,再脫蠟10 min,無水乙醇5 min,90%乙醇2 min,70%乙醇2 min,蒸餾水2 min。滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K用P0106免疫染色洗滌液室溫作用30 min。PBS洗滌3次。配制適當(dāng)量TUNEL檢測液滴加樣品上,37℃避光孵育60 min。洗滌后用抗熒光猝滅封片液封片后顯微鏡下(激發(fā)波長范圍為450～500 nm)觀察。

1.2.6 Western blot檢測細(xì)胞中蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞,PBS清洗3次,用添加有終濃度為1 mmol/L的蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)的細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解,提取各組細(xì)胞總蛋白。用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度(具體檢測按照試劑說明書進(jìn)行),10%SDS-PAGE膠分離蛋白后用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h,隨后加入一抗于4℃封閉過夜,第二天加入對應(yīng)二抗室溫封閉1 h,最后滴加ECL曝光顯影。SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜,經(jīng)5%BSA封閉后依次孵育相應(yīng)一抗和二抗。顯色并統(tǒng)計灰度值計算相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有實驗數(shù)據(jù)均使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,實驗結(jié)果以表示。方差齊且服從正態(tài)分布則組間比較用One-Way ANOVA。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CUMS誘導(dǎo)建立抑郁癥大鼠模型 CUMS誘導(dǎo)建立抑郁癥大鼠模型后,體重指標(biāo)顯示:相較于健康cTRL組大鼠,STL組大鼠體重?zé)o顯著差異,而模型CUMS組大鼠體重則顯著下降(P＜0.01,圖1A)；與CUMS組比較,CUMS+STL組大鼠體重發(fā)生明顯上調(diào)(P＜0.01,圖1A)。蔗糖偏好實驗檢測結(jié)果顯示:相較于健康cTRL組大鼠,單獨(dú)加藥組大鼠對蔗糖偏好無顯著差異,而模型CUMS組大鼠則對蔗糖偏好發(fā)生顯著下降(P＜0.01,圖1B)；與CUMS組比較,CUMS+STL組大鼠對蔗糖偏好發(fā)生明顯上調(diào)(P＜0.01,圖1B)。如圖1C所示,CUMS組5-HT濃度明顯下降,而STL可以逆轉(zhuǎn)5-HT濃度明顯下降(P＜0.01,圖1C)。

2.2 STL改善大鼠體內(nèi)炎癥因子水平 ELISA檢測血清中相關(guān)促炎癥因子IL-6、IL-1β和抗炎因子IL-4、IL-10等,結(jié)果顯示:與正常cTRL組比較,STL組促炎因子和抗炎因子表達(dá)水平均無顯著差異；CUMS模型組促炎因子IL-6和IL-1β顯著上升,而抗炎因子IL-4和IL-10則顯著下降(P＜0.01,圖2A、B)；相較于CUMS模型組,CUMS+STL組大鼠IL-6和IL-1β水平有明顯下調(diào),而IL-4和IL-10水平顯著升高(P＜0.01,圖2A、B)。同時,在腦脊液中,與正常cTRL組比較,STL組IL-6和IL-4表達(dá)水平均無顯著差異；CUMS模型組IL-6顯著上升,而IL-4顯著下降(P＜0.01,圖2C)；相較于CUMS模型組,CUMS+STL組大鼠IL-6水平有明顯下調(diào),而IL-4水平顯著升高(P＜0.01,圖2C)。

圖1 STL對CUMS抑郁癥模型大鼠癥狀的影響Fig.1 Effects of STL on rat model of CUMS

2.3 STL降低抑郁癥大鼠腦組織中ICAM-1表達(dá)免疫組化實驗顯示,與cTRL組相比較,STL組大鼠腦組織中ICAM-1表達(dá)水平無顯著差異；而CUMS模型組表達(dá)水平急劇升高(P＜0.01,圖3)；與CUMS模型組比較,CUMS+STL組大鼠腦組織中ICAM-1的表達(dá)水平顯著下降(P＜0.01,圖3)。

2.4 STL改善抑郁癥大鼠血清中氧化應(yīng)激相關(guān)分子含量 ELISA檢測血清中氧化應(yīng)激相關(guān)因子SOD、MDA和LDH,結(jié)果顯示:相較于cTRL組,STL組三者表達(dá)水平無顯著差異；但CUMS模型組中SOD表達(dá)水平明顯降低,而MDA和LDH表達(dá)則顯著上升(P＜0.01,圖4)；與CUMS模型組相比,CUMS+STL組SOD水平顯著上調(diào),且MDA和LDH水平顯著下調(diào)(P＜0.01,圖4)。

圖3 免疫組化檢測大鼠腦組織中ICAM-1表達(dá)水平Fig.3 Expression of ICAM-1 was detected with immunohistochemical method in rat brain tissues

圖4 ELISA檢測血清中氧化因子表達(dá)水平Fig.4 Expression of oxidative-related factors were detected with ELISA in serum

圖5 TUNEL染色鑒定細(xì)胞凋亡及Western blot檢測各處理凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平(×200)Fig.5 Activation of apoptosis and apoptosis-related factors were detected in rat brain tissue by TUNEL staining and Western blot(×200)

3 討論

世界精神病協(xié)會最近發(fā)表的數(shù)據(jù)表明,抑郁癥發(fā)病率以每年113%的高速度進(jìn)展。其中重度抑郁癥已發(fā)展成全球第五大致殘因素[13]。有研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)下我國抑郁癥患者終生患病率大約為3.3%[14]。逐漸增加的抑郁癥患者不僅給個人和家庭帶來痛苦和負(fù)擔(dān),同時也給社會帶來很多問題和影響[15]。伴隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)不斷進(jìn)步,抑郁癥相關(guān)的病理生理學(xué)機(jī)理研究也獲得巨大突破。抑郁癥發(fā)病機(jī)制除了與遺傳因素相關(guān)外,目前諸多研究表明氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展中起到巨大作用[16]。

深入研究抑郁癥發(fā)病機(jī)理對控制抑郁癥發(fā)展具有重大意義。當(dāng)前的研究顯示,抑郁癥患者體內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等功能均有不同程度的病理性改變,由此產(chǎn)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)假說、單胺假說、免疫系統(tǒng)異常假說、神經(jīng)遞質(zhì)受體假說、神經(jīng)內(nèi)分泌功能假說等[14-17]。其中炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激假說逐漸受到人們的重視,此假說主要觀點(diǎn)為:機(jī)體受到應(yīng)激后,原有的氧化還原平衡被打破,相應(yīng)的抗氧化酶功能產(chǎn)生異常,ROS表達(dá)過量,導(dǎo)致釋放大量促炎癥因子,產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),進(jìn)一步引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)重要生物大分子結(jié)構(gòu)和功能紊亂,進(jìn)而促進(jìn)抑郁癥發(fā)生[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)STL可以有效緩解CUMS模型組大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。

現(xiàn)有大量研究證實STL具有抗炎、抗氧化等特性。ABDEL等[20]報道STL可以通過降低過氧化氫酶和PON1的活性來減少大腦氧化損傷。STL可以降低慢性心力衰竭患者體內(nèi)細(xì)胞質(zhì)中氧化應(yīng)激標(biāo)志物MDA的表達(dá)水平,并有效降低患者抑郁傾向[21]。同時,STL還可以降低慢性心力衰竭合并重度抑郁癥患者體內(nèi)炎癥因子的表達(dá)水平,有效改善患者抑郁癥狀[22]。本研究結(jié)果表明,在對CUMS大鼠模型進(jìn)行STL治療后,有效降低大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA和LDH等表達(dá),并促進(jìn)SOD上調(diào)以應(yīng)對大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)；同時經(jīng)過STL治療后CUMS大鼠體內(nèi)大量促炎癥因子IL-6和IL-1β等顯著下調(diào),并促進(jìn)抑炎因子IL-10和IL-4等上調(diào)。表明STL在大鼠抑郁癥模型中可以有效抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。

已報道STL具有抗炎和抗氧化應(yīng)激效用,本研究在CUMS誘導(dǎo)的大鼠抑郁癥模型中證實,STL可以有效降低大鼠血清中ICAM-1和IL-6、IL-1β等相關(guān)炎癥因子,并且能夠提高IL-4和IL-10水平,說明STL可以有效抵抗炎癥因子的作用。腦脊液中,各組大鼠IL-6水平表現(xiàn)出比血清更明顯的變化,而IL-4在腦脊髓和血清中水平相當(dāng),說明IL-6水平在STL誘導(dǎo)的CUMS抑郁癥減輕其關(guān)鍵作用。文獻(xiàn)報道這些促炎癥因子可以激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB/ICAM-1途徑,而ICAM-1可以在炎癥部位促進(jìn)細(xì)胞黏連性[23-24]。經(jīng)過免疫組化實驗證實當(dāng)抑郁癥模型大鼠經(jīng)過STL治療后,腦組織中ICAM-1表達(dá)水平顯著下調(diào)。也有文獻(xiàn)證明IL-10可以通過STAT3磷酸化從而抑制IL-6、IL-1β和TNF-α表達(dá),抑制炎癥反應(yīng)[25-28]。同時,在抗氧化應(yīng)激方面,IL-4可以有效增加SOD含量,減少M(fèi)DA和LDH表達(dá),說明細(xì)胞可以有效應(yīng)對氧化應(yīng)激(SOD升高),減少氧化應(yīng)激水平(MDA降低),同時細(xì)胞活性增加(LDH降低)[5-6]。

同時,有部分文獻(xiàn)報道在抑郁癥患者體內(nèi)持續(xù)的慢性炎癥最終會發(fā)展成為細(xì)胞凋亡,造成神經(jīng)細(xì)胞降解,改變大腦結(jié)構(gòu)[29-30]。針對抑郁癥患者自身氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的氧化自由基同時也會促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子降解,從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[31-32]。本研究通過TUNEL染色發(fā)現(xiàn)CUMS大鼠模型組大腦組織細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的凋亡現(xiàn)象,在經(jīng)過STL治療后凋亡現(xiàn)象得到明顯改善。同時利用Western blot技術(shù)也檢測到STL治療后大鼠腦組織細(xì)胞凋亡程度得到良好改善。說明,在抑郁癥大鼠大腦組織內(nèi)伴隨著炎癥和氧化應(yīng)激的同時,還有腦細(xì)胞凋亡發(fā)生。

綜上所述,STL對抑郁癥大鼠具有一定治療效果,其發(fā)揮作用的機(jī)制可能是通過STL抑制CUMS大鼠體內(nèi)炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡來實現(xiàn)。STL治療可以有效降低大鼠體內(nèi)炎癥因子表達(dá)量；同時又可以增加抑炎因子表達(dá)并有效抑制大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)物的水平,且對腦細(xì)胞凋亡有一定的緩解作用。說明STL在大鼠抑郁癥模型中具有一定治療效果,為抑郁癥臨床治療提供借鑒。