siRNA沉默SCD1基因?qū)CF-7細(xì)胞增殖、凋亡及脂質(zhì)代謝的影響①

黃慧敏 楊 勇 魏 英 王靳琎 陳琴華 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心十堰442008

女性乳腺癌發(fā)病率占全球女性惡性腫瘤的30%,死亡率占女性惡性腫瘤的15%,且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。因此,進(jìn)一步研究乳腺癌的有效治療方法具有重要的意義。近年來(lái),脂質(zhì)代謝紊亂作為乳腺癌的危險(xiǎn)因素,受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoylcoenzyme A desaturase 1,SCD1)是脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵酶,廣泛參與脂肪代謝,進(jìn)而影響細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及信號(hào)傳導(dǎo)等生物學(xué)功能,與細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)等關(guān)系密切[2-3]。研究顯示SCD1的表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[4-7]。本研究擬通過(guò)小干擾RNA(small interfreing RNA,siRNA)干擾技術(shù)阻斷乳腺癌MCF-7細(xì)胞中SCD1表達(dá),通過(guò)MTT增殖實(shí)驗(yàn)、Annexin V-FITC/PI染色、ELISA等實(shí)驗(yàn),檢測(cè)SCD1基因沉默后對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡及脂質(zhì)代謝的影響,以期為深入研究SCD1基因在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的作用及靶向治療藥物開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；TRIzol Reagent購(gòu)自美國(guó)Omega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；RIPA裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；SCD1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；熒光二抗購(gòu)自?xún)?yōu)寧維公司；Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；MTT購(gòu)自南京凱基生物有限公司；膽固醇及三酰甘油試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；全蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京凱基生物有限公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；PCR引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成,引物序列見(jiàn)表1；SCD1特異性siRNA干擾序列(SCD1-siRNA)和siRNA陰性對(duì)照序列(NC-siRNA)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成,siRNA寡核苷酸序列見(jiàn)表2。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞來(lái)源及其培養(yǎng) 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)消化傳代,進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分成3組:SCD1-siRNA組、NC-siRNA組、Control組。SCD1-siRNA組轉(zhuǎn)染75 nmol/L的SCD1-siRNA,NC-siRNA組轉(zhuǎn)染等濃度的NC-siRNA,Control組加入等體積轉(zhuǎn)染試劑,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染前1 d,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞鋪于6孔板,轉(zhuǎn)染前觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),密度達(dá)60%～80%時(shí),按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)及siRNA說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-PCR

表2 siRNA寡核苷酸序列Tab.2 Sequences of siRNA

1.2.3 熒光顯微鏡觀察siRNA轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染前1 d,將約1.0×105個(gè)MCF-7細(xì)胞種于24孔板,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%時(shí),給予FAM標(biāo)記的siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染24 h后PBS洗滌2次,倒置熒光顯微鏡下觀察并攝片。熒光顯微鏡攝片時(shí),激發(fā)光為藍(lán)光,激發(fā)波長(zhǎng)480 nm,各組細(xì)胞攝片條件均一致。

1.2.4 RT-PCR法檢測(cè)SCD1 mRNA表達(dá) 按照

1.2.2 轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,48 h后收集細(xì)胞,TRIzol試劑提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,RT-PCR檢測(cè)SCD1的mRNA表達(dá)水平,以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行目的基因表達(dá)的相對(duì)定量分析,引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s；62℃反應(yīng)40 s,40個(gè)循環(huán),以2-ΔΔCt值表示待測(cè)基因mRNA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)SCD1蛋白的表達(dá) 按照1.2.2轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,48 h后收集細(xì)胞,加RIPA裂解液提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白,BCA法檢測(cè)蛋白濃度,GAPDH為內(nèi)參。取等量蛋白進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)膜后,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別加入1∶1 000稀釋的SCD1抗體和GAPDH抗體,4℃過(guò)夜,加入相應(yīng)1∶10 000稀釋的二抗,室溫孵育1 h。ECL發(fā)光,UVP凝膠成像系統(tǒng)顯影,Image J軟件分析目標(biāo)蛋白的光密度值。

1.2.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 按照1.2.2轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,48 h后消化細(xì)胞并計(jì)數(shù),5×103個(gè)/孔接種于96孔板,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。24 h后每孔加入5 mg/ml的MTT工作液20μl,5%CO2、37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng)基,每孔加DMSO 150μl,低速振蕩10 min,酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)每孔OD值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 Annexin V-FITC/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 ①按照1.2.2轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,48 h后棄上清,PBS清洗3遍,每孔加入1×Binding Buffer工作液500μl,并加Annexin V-FITC 5μl,3 min后再加入PI 10μl,輕輕混勻,室溫避光孵育10 min,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況。②轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞48 h后用不含EDTA·2Na的0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞至離心管,用4℃預(yù)冷的PBS洗滌2次,每孔收集的細(xì)胞數(shù)不少于1×106個(gè),各離心管中加入1×Binding Buffer 250μl重懸細(xì)胞,細(xì)胞懸液中加入Annexin V-FITC 5μl,輕輕混勻后間隔3 min,再加入PI 10μl,室溫避光孵育10 min,各反應(yīng)管中加入PBS 300μl,再次混勻后于488 nm的流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8 細(xì)胞膽固醇及三酰甘油水平檢測(cè) 按照1.2.2轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,48 h后收集沉淀,PBS清洗3遍,全蛋白提取試劑提取細(xì)胞總蛋白,BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度。細(xì)胞內(nèi)膽固醇及三酰甘油水平按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)測(cè)定,并以總蛋白濃度為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校正,酶標(biāo)儀550 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)樣本OD值。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析及作圖均采用GraphPad Prism 8軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布及方差齊性,以表示,三組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Dunnett-t檢測(cè),P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Lipofectamine2000介導(dǎo)FAM標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染效率測(cè)定 不同濃度(0、25、50、75 nmol/L)FAM標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,24 h后觀察轉(zhuǎn)染率。結(jié)果見(jiàn)圖1,當(dāng)siRNA濃度為0 nmol/L時(shí),MCF-7細(xì)胞無(wú)熒光當(dāng)siRNA濃度為25 nmol/L時(shí),出現(xiàn)熒光,隨著siRNA濃度的增加,熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),當(dāng)siRNA濃度為75 nmol/L時(shí),熒光強(qiáng)度最強(qiáng),80%以上MCF-7細(xì)胞發(fā)綠色熒光,表明有較多siRNA被轉(zhuǎn)染入細(xì)胞,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中所用siRNA濃度均為75 nmol/L。

圖1 熒光顯微鏡觀察不同濃度FAM標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染效果Fig.1 Transfection efficiency of different concentrations of FAM-siRNA observed by fluorescence microscope

2.2 RT-PCR法檢測(cè)siRNA沉默SCD1基因的效率如圖2所示,NC-siRNA轉(zhuǎn)染組中SCD1基因的mRNA表達(dá)量為0.971±0.043,與Control組(1.0±0.029)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；而SCD1-siRNA轉(zhuǎn)染組中SCD1基因的mRNA表達(dá)量為0.357±0.026,與NC-siRNA轉(zhuǎn)染組(0.971±0.043)相比顯著降低(P＜0.001)。結(jié)果提示轉(zhuǎn)染SCD1-siRNA后MCF-7細(xì)胞中SCD1 mRNA表達(dá)被有效抑制。

2.3 Western blot法檢測(cè)SCD1基因沉默對(duì)SCD1蛋白表達(dá)的影響 如圖3所示,SCD1-siRNA轉(zhuǎn)染組SCD1蛋白表達(dá)水平顯著低于NC-siRNA轉(zhuǎn)染組和Control組(P＜0.001),NC-siRNA轉(zhuǎn)染組和Control組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。表明SCD1-siRNA干擾可有效抑制SCD1蛋白表達(dá)。

2.4 MTT法檢測(cè)SCD1基因沉默對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響 如圖4所示,Control組MCF-7細(xì)胞增殖率為(100.00±2.943)%,NC-siRNA轉(zhuǎn)染組和SCD1-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖率分別為(98.54±2.365)%和(82.25±2.112)%。NC-siRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖率和Control組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),SCD1-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖率顯著低于NC-siRNA轉(zhuǎn)染組(P＜0.01)。表明SCD1基因表達(dá)下調(diào)后,MCF-7細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制。

圖2 SCD1-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MCF-7細(xì)胞SCD1 mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effect of SCD1-siRNA transfection on expression ofSCD1 mRNA in MCF-7 cells

圖3 SCD1-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)MCF-7細(xì)胞中SCD1蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of SCD1-siRNA transfection on expression of SCD1 protein in MCF-7 cells

2.5 SCD1基因沉默對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響如圖5A所示,Annexin V-FITC將早期凋亡細(xì)胞染成綠色,PI可將晚期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核染成紅色。熒光顯微鏡下,Control組及NC-siRNA轉(zhuǎn)染組凋亡細(xì)胞較少,SCD1-siRNA轉(zhuǎn)染組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多,且早期凋亡細(xì)胞多于晚期凋亡細(xì)胞。流式細(xì)胞凋亡圖中,凋亡細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞數(shù)(Q3)與晚期凋亡細(xì)胞數(shù)(Q2)之和。如圖5B所示,Control組、NCsiRNA轉(zhuǎn)染組和SCD1-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率分別為:(5.76±0.438)%、(7.74±0.467)%和(25.96±1.896)%。NC-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率與Control組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),SCD1-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著上升,與NC-siRNA轉(zhuǎn)染組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。提示沉默SCD1基因可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡。

圖4 SCD1基因沉默對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of SCD1 gene silencing on proliferation of MCF-7 cells

圖5 SCD1基因沉默對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of SCD1 gene silencing on apoptosis of MCF-7 cells

2.6 SCD1基因沉默對(duì)MCF-7細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響 如圖6所示,Control組、NC-siRNA轉(zhuǎn)染組、SCD1-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平分別為:(51.10±4.178)nmol/mg、(48.10±3.229)nmol/mg、(31.29±4.510)nmol/mg。NC-siRNA轉(zhuǎn)染組與Control組細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；SCD1-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平較NC-siRNA轉(zhuǎn)染組顯著降低(P＜0.01)。表明沉默SCD1基因可抑制MCF-7細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成。

圖6 SCD1基因沉默對(duì)MCF-7細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響Fig.6 Effect of SCD1 gene silencing on cholesterol level in MCF-7 cells

圖7 SCD1基因沉默對(duì)MCF-7細(xì)胞內(nèi)三酰甘油含量的影響Fig.7 Effect of SCD1 gene silencing on triglyceride level in MCF-7 cells

2.7 SCD1基因沉默對(duì)MCF-7細(xì)胞內(nèi)三酰甘油含量的影響 如圖7所示,Control組、NC-siRNA轉(zhuǎn)染組、SCD1-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)三酰甘油水平分別為:(61.21±8.949)nmol/mg、(58.66±9.132)nmol/mg、(42.49±3.707)nmol/mg。NC-siRNA轉(zhuǎn)染組與Control組細(xì)胞內(nèi)三酰甘油水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；SCD1-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)三酰甘油水平較NC-siRNA轉(zhuǎn)染組顯著降低(P＜0.05)。表明沉默SCD1基因可抑制MCF-7細(xì)胞內(nèi)三酰甘油合成。

3 討論

RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)是調(diào)控基因表達(dá)、功能基因組學(xué)研究的重要方法,siRNA是RNAi過(guò)程中的重要產(chǎn)物,具有高度特異性及級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)等特點(diǎn),可在轉(zhuǎn)錄水平后誘導(dǎo)基因沉默。近年siRNA高效并特異性阻斷了多種腫瘤細(xì)胞中靶基因的表達(dá),抑制了腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲,誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞凋亡,目前已成為研究腫瘤基因靶向治療的重要工具[8-9]。

乳腺癌是全球女性發(fā)病率最高的腫瘤之一。研究顯示,機(jī)體脂質(zhì)代謝與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),肥胖既是乳腺癌發(fā)病的高危因素,同時(shí)影響其預(yù)后[10]。SCD1是催化飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為單不飽和脂肪酸的限速酶,與脂質(zhì)代謝紊亂關(guān)系密切,在結(jié)腸癌、肺癌、腎癌、肝癌等多種癌細(xì)胞及腫瘤組織中異常表達(dá)。MASON等[11]研究發(fā)現(xiàn),降低結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中SCD1表達(dá),可阻斷脂肪酸的合成從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡；HESS等[12]研究發(fā)現(xiàn)抑制肺癌H460細(xì)胞中SCD1的表達(dá),可阻斷細(xì)胞周期進(jìn)展,誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡從而抑制H460肺癌細(xì)胞增殖；VON ROEMELING等[13]發(fā)現(xiàn)在腎透明細(xì)胞癌組織中SCD1基因呈高表達(dá),同時(shí)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均表明SCD1缺陷可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,阻斷細(xì)胞生長(zhǎng),并促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)；BANSAL等[14]研究發(fā)現(xiàn),SCD1在HepG2等多種肝癌細(xì)胞及肝癌組織中高表達(dá),抑制SCD1可顯著提高HepG2細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性并抑制肝癌細(xì)胞增殖。以上研究表明SCD1是癌癥治療的潛在靶點(diǎn)。

研究SCD1在乳腺癌中的作用可為乳腺癌治療提供新的思路。本研究通過(guò)RNAi技術(shù)干擾SCD1在人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)。RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示,經(jīng)SCD1-siRNA轉(zhuǎn)染后,SCD1 mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低,提示MCF-7細(xì)胞中SCD1的表達(dá)得到有效抑制。細(xì)胞的異常生長(zhǎng)與增殖是惡性腫瘤最基本的生物學(xué)特征之一,本研究MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示,SCD1-siRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖率顯著低于NC-siRNA轉(zhuǎn)染組,即SCD1基因表達(dá)下調(diào)后,MCF-7細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制。細(xì)胞凋亡能力降低是腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的重要區(qū)別,本研究進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)觀察了SCD1沉默對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示SCD1表達(dá)抑制后,MCF-7細(xì)胞凋亡率顯著較高,本研究從反面驗(yàn)證了SCD1具有促進(jìn)乳腺癌發(fā)展的作用。趙靜[15]研究發(fā)現(xiàn)SCD1抑制劑MF-438干預(yù)MCF-7細(xì)胞48 h,可顯著抑制細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡,與本研究結(jié)果一致。

細(xì)胞增殖失控和能量代謝異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),溫伯格效應(yīng)與脂肪酸合成增加是腫瘤細(xì)胞2個(gè)標(biāo)志性代謝改變[16-17]。脂類(lèi)作為人體三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一,具有儲(chǔ)存和供應(yīng)能量、參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、構(gòu)成血漿脂蛋白、維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)等重要的生理功能。和正常細(xì)胞相比,腫瘤細(xì)胞持續(xù)分裂增殖的能力顯著提高,因此需要合成大量的脂質(zhì)用于新細(xì)胞膜和促癌脂質(zhì)信號(hào)分子的合成,并為腫瘤細(xì)胞提供能量支持,因此在腫瘤細(xì)胞中脂質(zhì)從頭合成途徑被高度激活[18-20]。本實(shí)驗(yàn)沉默SCD1基因后,MCF-7細(xì)胞內(nèi)膽固醇和三酰甘油水平顯著低于NCsiRNA轉(zhuǎn)染組。黃光明等[21]研究發(fā)現(xiàn),抑制SCD1表達(dá)可明顯降低肝癌SMMC-7721細(xì)胞中膽固醇和三酰甘油水平,曹白鴿等[22]研究發(fā)現(xiàn),SCD1過(guò)表達(dá)后HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴及三酰甘油合成明顯增加,下調(diào)SCD1表達(dá)細(xì)胞內(nèi)脂滴及三酰甘油合成明顯減少。以上研究結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SCD1在癌細(xì)胞脂質(zhì)合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述,SCD1是MCF-7細(xì)胞中脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵基因,沉默SCD1可顯著抑制MCF-7細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝水平及細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。本研究為乳腺癌的靶向治療和新藥研發(fā)提供了新的思路和方法,SCD1抑制劑作為乳腺癌治療的新藥值得進(jìn)一步研究。