菌劑添加對人工林土壤呼吸和有機質(zhì)含量及細菌群落影響

錢壯壯，朱孔鑫，王會利，覃其云，鄧小軍，曹繼釗，莊舜堯★

（1.中國科學(xué)院南京土壤研究所，江蘇 南京210008；2.廣西林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧530002）

人類的化石燃料使用、工業(yè)生產(chǎn)以及毀林開荒等活動導(dǎo)致大量的CO2向大氣排放, 使得大氣CO2濃度顯著增加[1-2]。由于大氣CO2濃度上升引起的全球變暖已經(jīng)成為一個重大的環(huán)境挑戰(zhàn)，“溫室效應(yīng)”可能對世界環(huán)境和經(jīng)濟產(chǎn)生深遠的影響[3]。土壤是陸地生態(tài)系統(tǒng)最大的碳庫，土壤有機質(zhì)對維持土壤質(zhì)量和生態(tài)系統(tǒng)功能起著重要作用[4-5]。人工林栽植可以在較短時間內(nèi)吸收大氣中大量的CO2，把碳固定在植物和土壤中，因此，被廣泛認(rèn)為是緩解全球氣候變化的有效方法[6]。

桉樹（Eucalyptusspp. Smith）原產(chǎn)澳洲，由于其生長速度快，抗性強，適應(yīng)性強，經(jīng)濟價值高等特點在中國南方尤其是廣西壯族自治區(qū)廣泛引種，目前在廣西桉樹人工林面積已有171.29 萬hm2[7-8]。廣西地處中國西南方，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候和熱帶季風(fēng)氣候，水熱條件好，是中國的人工林種植大省。目前，廣西全區(qū)擁有林業(yè)用地約1 600 萬hm2，占全國林地面積的10%，林地資源相當(dāng)豐富[9]。廣西的重要人工林樹種還包括松樹（Pinus spp.） 和杉 木（Cunninghamia lanceolata），分別占全區(qū)樹種結(jié)構(gòu)的11.50%和17.66%[10]。但是，在人工林的經(jīng)營過程中，由于人工林經(jīng)營以純林為主，且輪伐期較短，林木被砍伐后，大量的生物量和養(yǎng)分被移出，使得養(yǎng)分無法歸還到土壤，隨著經(jīng)營時間的延長，土壤地力衰退，土壤生產(chǎn)能力急劇下降[11-12]。

森林凋落物是森林植物在其生長發(fā)育過程中新陳代謝的產(chǎn)物。凋落物作為土壤有機質(zhì)輸入的主要來源，是土壤微生物進行生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，而且對土壤溫度、濕度也會產(chǎn)生影響，進而影響到土壤呼吸作用[13-14]。目前已有很多關(guān)于廣西人工林地力維持的研究，但是主要集中在地力退化[15]，生態(tài)評估地力評價[16-17]，合理施肥[18-20]等方面，對于菌劑腐解凋落物和林地土壤微生物的研究還比較少。菌劑具有促進凋落物及土壤養(yǎng)分循環(huán)，增加土壤肥力的作用[21]。菌肥主要施用在水稻、小麥[22-23]及蔬菜[24-25]等農(nóng)作物土壤中，但是，目前缺乏菌劑對人工林土壤地力提升方面的研究。因此，本研究目的是通過比較不同市售菌劑對3 種林地凋落物分解及土壤有機質(zhì)含量的影響，明確菌劑對土壤有機質(zhì)提升的作用及機制，從而為廣西人工林地力提升和生態(tài)修復(fù)提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

研究區(qū)位于廣西壯族自治區(qū)崇左市扶綏縣東門林場，地理位置22°19′47″ N，107°50′31″ E，屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，年平均氣溫21.7 ℃，年平均降雨量約1 300 mm。

1.2 試驗設(shè)計

土壤樣品來自于廣西壯族自治區(qū)東門林場5年生桉樹林（Eucalyptus robusta），10年生杉木林（C.lanceolata）及15年生馬尾松林（P. massoniana）。每種人工林試驗地面積為50 m×50 m，從每個試驗樣地每種森林類型采用5 點交叉采樣法采集0~10 cm 深度土壤樣品，取樣前，要將枯枝落葉清除，取樣點的土樣由5 個重復(fù)混合而成。土樣去除根系和石頭后，在室溫下自然風(fēng)干，過2 mm 篩后備用。在采集土壤的過程中，同時隨機采集地面上的枯葉，取回實驗室烘干研磨過2 mm 篩備用。

各取20 g 過2 mm 篩的桉樹、杉木及馬尾松林下風(fēng)干土壤均勻混合為60 g 土（土壤初始有機質(zhì)含量為51.11·g kg-1），平鋪于500 mL 玻璃錐形瓶中，取粉碎后的桉樹葉，杉木葉和馬尾松葉0.2 g 分別與0.1 g 市售菌劑（韋美微生物菌劑，濰坊市信得生物科技有限公司，主要成分為棘孢木霉菌、枯草芽孢桿菌等；益加益發(fā)酵劑，益加益生物科技有限公司，主要成分為芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌、固氮菌等；貝佳有機肥發(fā)酵劑，山東貝佳生物科技有限公司，主要成分為芽孢桿菌、放線菌、酵母菌、木霉菌等）均勻混合灑在土壤表面，濕潤土壤水分至田間持水量（共計9 個處理，記為松益（SEb）、杉益（SHEb）、桉益（AEb）、松韋（SWb）、杉韋（SHWb）、桉韋（AWb）、松貝（SBb）、杉貝（SHBb）、桉貝（ABb）,同時做未加菌劑只加3 種凋落物的空白組記為松CK，杉CK，桉CK）。將一個裝有50 mL 0.1 mol·L-1KOH 溶液的小瓶子系在土壤表面上方，以吸收釋放的CO2。每個處理3 個重復(fù)，共計36 個錐形瓶封口放置在一個有密封蓋和無光的培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)。每周測定釋放的CO2并更換KOH 溶液及補充土壤水分。培養(yǎng)期為2 個月。用0.1 mol·L-1HCl 滴定KOH 溶液中吸收的CO2并計算呼吸速率。培養(yǎng)結(jié)束后仔細去除上層凋落物及菌劑后，取出錐形瓶中的土壤，一部分風(fēng)干過0.25 mm 篩測定土壤有機質(zhì)含量，一部分新鮮土壤放入－80 ℃冰箱保存，用于微生物測定。

1.3 土壤樣品分析方法

1.3.1 有機質(zhì)測定

土壤有機質(zhì)采用濃硫酸重鉻酸鉀外加熱法測定[26]。

1.3.2 DNA 提取和PCR 擴增

1.3.3 庫的構(gòu)建和排序

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 測序數(shù)據(jù)的處理

將原始的fastq 文件解復(fù)用，并使用QIIME（版本1.17）按照以下標(biāo)準(zhǔn)進行質(zhì)量過濾：1）在10 bp 滑動窗口中平均質(zhì)量得分＜20 的任何站點上，將250 bp的讀數(shù)都截短，并丟棄截短的讀數(shù)短于50 bp。2）精確的barcode 匹配，引物匹配中2 個核苷酸錯配，包含歧義字符的讀段被刪除。3）僅重疊超過10 bp 的序列根據(jù)其重疊序列進行組裝。無法組裝的讀物將被丟棄。使用UPARSE（7.1 版，http：//drive5.com/uparse/）對OUT 進行聚類，相似度為97%，并使用ucheime 對嵌合序列進行識別和去除。利用ucheime 對嵌合序列進行識別和去除。利用50%的置信閾值，用uclust 對silva（SSU123）16sRNA 數(shù)據(jù)庫分析了每個16sRNA 基因序列的親緣關(guān)系[27]。

1.4.2 Alpha 多樣性分析

進行了基于Mothur v.1.21.1 的稀疏性分析[28]，以揭示多樣性指數(shù)，包括Chao 和Shannon 多樣性指數(shù)。熱圖是通過R 中的Vegan 2.0 包繪制的。

1.4.3 方差分析

有機質(zhì)及土壤呼吸數(shù)據(jù)均通過方差分析進行統(tǒng)計學(xué)檢驗，3 個重復(fù)的平均數(shù)用IBM SPSS Statistics 20.0 進行鄧肯檢驗（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加菌劑對各處理土壤呼吸的影響

對不同凋落物添加菌劑后發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間延長，各個處理土壤呼吸速率均呈現(xiàn)先降低后增長再降低的趨勢。在試驗剛開始時，各處理呼吸速率在2.31～6.05 μmol·m-2·s-1之間，直到培養(yǎng)結(jié)束，各處理呼吸速率處于0.12～1.27 μmol·m-2·s-1之間。其中，桉樹添加益加益處理呼吸速率在培養(yǎng)21 d 后開始超過其他處理，并于培養(yǎng)42 d 和培養(yǎng)結(jié)束時顯著高于所有處理。與未添加菌劑的對照相比，添加菌劑顯著提升了土壤呼吸效率，綜合比較各凋落物添加益加益菌劑的呼吸速率均高于添加其他菌劑，益加益對土壤呼吸具有較好的促進作用。

2.2 菌劑對土壤有機質(zhì)含量的影響

由表1 和表2 可知，與未添加菌劑的對照相比，添加菌劑后均提升了土壤有機質(zhì)含量，但是可能由于培養(yǎng)時間較短及菌劑和凋落物添加數(shù)量的原因，各處理均沒有顯著差異。最高增幅為馬尾松+益加益的處理，對比初始有機質(zhì)含量提升了5.48%，其次為桉樹+益加益和杉木+益加益的處理，培養(yǎng)結(jié)束后有機質(zhì)含量比對照有機質(zhì)含量分別提高了4.49%和4.17%。綜合比較，松杉桉3 種凋落物均表現(xiàn)為添加益加益對有機質(zhì)提升效果最佳。

圖1 添加菌劑對各處理土壤呼吸的影響Fig. 1 Effects of microbial agents on soil respiration in different treatments

表1 添加菌劑對土壤有機質(zhì)含量的影響Tab. 1 Effects of microbial agents on soil organic matter

2.3 菌劑對土壤細菌群落豐富度和多樣性的影響

在對低質(zhì)量的reads 和嵌合體序列進行過濾和去除后，共獲得2 448 個OTUs，它們的相似度為97%。細菌群落α 多樣性指數(shù)如圖2 所示。各處理的的Chao1 指數(shù)表現(xiàn)為松益＞桉益＞杉韋＞桉韋＞松韋＞桉貝＞松貝＞杉益＞杉貝，松+益加益顯著高于其他處理。此外，Shannon 指數(shù)表現(xiàn)為桉益＞松益＞桉貝＞杉韋＞松貝＞杉貝＞松韋＞桉韋＞杉益（圖2b）。益加益對比其他菌劑具有更好的提升土壤細菌群落多樣性的作用，尤其是對松樹和桉樹土壤效果提升最明顯。

2.4 菌劑對土壤細菌群落組成的影響

圖2 不同菌劑處理的Chao1(a)和Shannon(b)細菌群落多樣性指數(shù)Fig. 2 Bacterial community diversity of Chao1 (a) and Shannon (b) index in different treatments

對相對豐度排名前20 位的土壤細菌門進行了分析（圖3），在各處理土壤中，5 個主要門類為厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度最高，占8.16%～99.52%，其次為變形菌門（Proteobacteria），占0.17%～90.31%；其它細菌門分別為放線菌門（Actinobacteria，0.02%～16.82%）、酸桿菌門（Acidobacteria，0.11%～6.41%）、和浮霉菌門（Planctomycetes ，0.06%～5.06%）。這5 個細菌門的相對豐度共占92.94%～99.91%。

圖3 土壤細菌群落主要門的相對豐度Fig. 3 The relative abundance of soil bacterial community at major phylum levels

圖4 FAPROTAX 功能注釋聚類熱圖Fig. 4 Heatmap of FAPROTAX functional annotation clustering

2.5 功能注釋聚類分析

通過對樣品在數(shù)據(jù)庫中的功能注釋及豐度信息，繪制熱圖，并從功能差異層面進行聚類分析（圖4）。結(jié)果表明：桉益處理細菌群落在硫化合物的呼吸作用纖維素化、甲醇氧化、甲基營養(yǎng)、芳香族化合物降解、木聚糖分解、碳氫化合物降解、芳烴降解、脂肪族非甲烷烴降解、硫代硫酸鹽呼吸功能強度顯著表達；松益處理細菌群落在好氧亞硝酸鹽氧化、硝化作用、硫酸鹽呼吸、硝酸鹽還原、硝酸鹽呼吸和氮呼吸能強度顯著表達。

3 結(jié)論與討論

土壤呼吸是生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)過程中不可或缺的部分[29]，它受到土壤溫度、濕度、有機質(zhì)含量和土壤微生物等因素影響[30]。本研究結(jié)果表明，不同處理土壤呼吸速率具有明顯的時間差異，在培養(yǎng)后期各處理土壤呼吸速率降低了69.28%～97.05%，說明不同菌劑對于不同凋落物分解促進效果不同，后期有些菌劑已經(jīng)與凋落物基本反應(yīng)完全，無法起到長期促進凋落物分解的作用。通過對不同菌劑相同凋落物的處理比較，總體呈現(xiàn)出馬尾松＞杉木＞桉樹葉的趨勢，這與吳志東等[31]研究一致，但是與楊鈣仁等[32]研究結(jié)果不同，可能是受到桉樹林齡和菌劑的影響。

土壤呼吸的升高并不一定意味著土壤有機質(zhì)分解與大氣二氧化碳濃度之間存在正反饋，單獨測量土壤呼吸并不能為評估土壤在氣候變暖下是碳源或碳匯提供確鑿的證據(jù)[33]。筆者通過對凋落物分解之后的土壤有機質(zhì)含量進行測定，發(fā)現(xiàn)菌劑對于凋落物分解具有促進作用，雖然由于處理時間的限制，各處理沒有呈現(xiàn)顯著差異，但是由圖1 可以看出，益加益菌劑到培養(yǎng)后期仍維持了較高的土壤呼吸速率，在田間長期施用可能可以促進土壤有機質(zhì)的顯著上升，這點需要配合田間試驗進行檢驗。

凋落物分解對于土壤有機質(zhì)的補充具有重要作用[34]。由于凋落物的添加引起土壤有機碳的增加，為微生物提供較多可利用碳源，微生物的數(shù)量增多；土壤微生物在土壤有機質(zhì)和土壤養(yǎng)分循環(huán)轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮著重要作用[35-36]。從土壤細菌群落組成結(jié)果可以看出，益加益可以顯著提升松樹和桉樹Shannon 和Chao1 多樣性和豐富度指數(shù)，說明菌劑添加對于提升微生物物種總數(shù)及多樣性具有顯著作用（圖2），尤其是益加益提升效果最佳，表明益加益更能提高凋落物土壤中微生物的數(shù)量和活性，使微生物在養(yǎng)分豐富的條件下生長迅速。對比其他處理，馬尾松及桉樹添加益加益后，F(xiàn)irmicutes，Proteobacteria，Actinobacteria，Acidobacteria是相對豐度最高的4 個門，但是Proteobacteria門所占比例顯著上升，Proteobacteria 門具有增加養(yǎng)分可利用性的作用[37]，表明添加益加益后可以有效提升植物對土壤養(yǎng)分的利用情況。

土壤微生物功能多樣性與土壤功能關(guān)系密切，土壤微生物功能多樣性是土壤功能的保證,同時也是恢復(fù)土壤功能的基礎(chǔ)[38]。筆者的研究表明桉益處理芳香族化合物降解，碳氫化合物降解和芳烴降解等碳代謝的功能表達有強烈上升（圖4），這與之前土壤呼吸的結(jié)果一致（圖1），表明益加益對桉樹葉有機質(zhì)分解具有很好的促進作用。

本研究結(jié)果表明，通過對不同凋落物添加3 種菌劑顯著增加了土壤呼吸速率，土壤有機質(zhì)含量也得到了有效提升，對土壤微生物群落及功能多樣性有明顯的提升效果。其中益加益菌劑對凋落物分解及土壤有機質(zhì)含量提升效果最佳，馬尾松添加益加益處理對比初始有機質(zhì)含量提升了5.48%，桉樹添加益加益處理對比初始有機質(zhì)含量提升了4.55%。并且馬尾松處理和桉樹處理添加益加益菌劑后，Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)顯著上升，表明益加益顯著改善了土壤微生物群落多樣性，對于提升土壤地力及改善土壤生態(tài)環(huán)境具有重大促進作用。