地塞米松對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病患兒睡眠-覺(jué)醒節(jié)律及炎性細(xì)胞因子水平的影響

石桂鸞，徐曉燕

（沭陽(yáng)銘和醫(yī)院兒科，江蘇 宿遷 223600）

小兒急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋcute lymphoblastic leukemi）是一種由未分化的骨髓/淋巴樣造血干細(xì)胞發(fā)生異?？寺⌒栽鲋乘鶎?dǎo)致的惡性疾病。有報(bào)道稱，急性淋巴細(xì)胞白血病患兒占急性白血病患兒總數(shù)的80%以上。3 ～7 歲的兒童是急性淋巴細(xì)胞白血病的高發(fā)群體。皮質(zhì)類固醇激素是臨床上治療小兒急性淋巴細(xì)胞白血病的常用藥。Margolin 等[1]研究指出，在使用皮質(zhì)類固醇激素對(duì)急性白血病患兒進(jìn)行治療期間，盡管會(huì)根據(jù)其病情對(duì)皮質(zhì)類固醇激素的用量和治療周期進(jìn)行了調(diào)整，但此類藥物引起的不良反應(yīng)仍不容忽視。皮質(zhì)類固醇激素易導(dǎo)致的不良反應(yīng)有疲勞、易怒、情緒低落、精神紊亂等[2-4]。地塞米松是臨床上常用的皮質(zhì)類固醇激素之一。在北美，地塞米松已被臨床上廣泛應(yīng)用于小兒急性白血病的治療中[1]。睡眠-覺(jué)醒節(jié)律是指夜間入睡、白天醒來(lái)這一人體生物節(jié)律。有研究指出，癌癥患者出現(xiàn)睡眠-覺(jué)醒節(jié)律紊亂主要與其存在癌因性疲乏有關(guān)。關(guān)于地塞米松對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病患兒睡眠-覺(jué)醒節(jié)律及炎性細(xì)胞因子水平的影響，臨床上的相關(guān)研究較少。本文主要是探討用地塞米松對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病患兒進(jìn)行治療對(duì)其睡眠-覺(jué)醒節(jié)律及炎性細(xì)胞因子水平的影響。

1 資料與方法

1.1 基線資料

選擇2015 年1 月至2020 年1 月期間我院收治的23 例急性淋巴細(xì)胞白血病患兒作為研究對(duì)象。其納入標(biāo)準(zhǔn)是：病情符合急性淋巴細(xì)胞白血病的診斷標(biāo)準(zhǔn)且初次得到確診；病歷資料完整；其家長(zhǎng)簽署了自愿參與本研究的《知情同意書》。其排除標(biāo)準(zhǔn)是：由其他惡性腫瘤誘發(fā)的急性淋巴細(xì)胞白血病；合并有其他嚴(yán)重的器質(zhì)性疾??；因病情復(fù)發(fā)入院。在這23 例患兒中，有男13 例，女10 例；其年齡為2 ～9 歲，平均年齡為5.5 歲。本研究已通過(guò)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 根據(jù)美國(guó)兒童腫瘤協(xié)作組（Children’s oncology group，COG）推薦的“CCLG-2010”化療方案對(duì)這23 例患兒進(jìn)行治療[5]?！癈CLG-2010”化療方案包括：對(duì)患兒進(jìn)行誘導(dǎo)化療所用的藥物為長(zhǎng)春新堿（VCR）、柔紅霉素（DNR）和左旋門冬酰胺（L-Asp）。對(duì)患兒進(jìn)行早期強(qiáng)化化療所用的藥物為環(huán)磷酰胺（CTX）、阿糖胞苷（Ara-C）和6- 巰基嘌呤（6-MP）。對(duì)病情危險(xiǎn)程度為低危和中危的患兒進(jìn)行鞏固化療所用的藥物為大劑量甲氨蝶呤（HDMTX）和6-巰基嘌呤（6-MP）。對(duì)病情危險(xiǎn)程度為高危的患兒進(jìn)行鞏固化療所用的藥物為甲氨蝶呤和（或）環(huán)磷酰胺-阿糖胞苷和（或）長(zhǎng)春新堿-地塞米松（MTX/CA/VD）+6-MP。每30 d 為1 個(gè)化療周期。在1 個(gè)化療周期的第1 天至第5 天，讓患兒口服6 mg/m2的地塞米松，每天分2 次服用。

1.2.2 睡眠監(jiān)測(cè)方法 在1 個(gè)化療周期內(nèi)，采用小米手環(huán)3（購(gòu)自中國(guó)小米公司）對(duì)本研究中的23 例患兒進(jìn)行睡眠監(jiān)測(cè)（在監(jiān)測(cè)前讓其佩戴手環(huán)1 周使其適應(yīng)），主要監(jiān)測(cè)其夜間睡眠時(shí)間、白天睡眠（小睡）時(shí)間、清醒時(shí)間及睡眠中發(fā)生喚醒事件的情況。夜間睡眠時(shí)間定義為夜間睡眠開(kāi)始的時(shí)間減去喚醒的時(shí)間。睡眠中的喚醒事件定義為在連續(xù)監(jiān)測(cè)過(guò)程中連續(xù)喚醒的次數(shù)。白天睡眠（小睡）時(shí)間定義為從早上醒來(lái)到當(dāng)天晚上入睡之間的睡眠時(shí)間。

1.2.3 炎性細(xì)胞因子的檢測(cè)方法 在用地塞米松對(duì)患兒進(jìn)行治療前及治療的第5 天，分別抽取其適量的靜脈血，對(duì)血液標(biāo)本進(jìn)行離心處理，分離出血漿，采用酶聯(lián)免疫吸附（Elisa）法檢測(cè)血漿中TNF-α、IL-1α 及IL-6 的水平。取小兒的急性淋巴細(xì)胞RS4:11 和TOM-1，用2μm 的地塞米松進(jìn)行處理，在處理后的3 h 及后6 h 分別收集細(xì)胞的上清液，提取RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6 及IL-1α 的mRNA 水平。之后采用Elisa 法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6 及IL-1α 的蛋白水平，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1α 及IL-6 受體IL-6R 的蛋白水平。檢測(cè)時(shí)所用的人源性TNFα、IL-1α 和IL-6Elisa 試劑盒均購(gòu)自上海萊茲生物科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。在檢測(cè)小兒急性淋巴細(xì)胞RS4:11 和TOM-1上清液中TNF-α、IL-6 及IL-1α 的mRNA 水平時(shí)，為了量化相對(duì)基因表達(dá)，將甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參。在進(jìn)行qPCR 檢測(cè)時(shí)所用的引物如表1 所示。

表1 進(jìn)行qPCR 檢測(cè)時(shí)所用的引物

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism 8.0.2（263）統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理本研究中的數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用方差檢驗(yàn)，兩組之間的差異采用t檢驗(yàn)或雙因素方差分析；不符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 地塞米松對(duì)患兒睡眠活動(dòng)的影響

在1 個(gè)化療周期內(nèi)對(duì)這23 例患兒進(jìn)行睡眠監(jiān)測(cè)的結(jié)果顯示，在使用地塞米松的1 ～5 d 內(nèi)，其夜間睡眠時(shí)間和白天睡眠（小睡）時(shí)間均明顯增加；在停用地塞米松后，其夜間睡眠時(shí)間和白天睡眠（小睡）時(shí)間均顯著下降。詳見(jiàn)圖1。

圖1 使用地塞米松后在1 個(gè)化療周期內(nèi)患兒夜間睡眠時(shí)間及白天睡眠（小睡）時(shí)間的統(tǒng)計(jì)圖Figure 1 Statistics of nighttime sleep and daytime sleep (napping)within 30 days of dexamethasone (6 mg/m2/day) chemotherapy cycle

2.2 地塞米松對(duì)患兒血漿炎性細(xì)胞因子水平的影響

隨機(jī)在這23 例患兒中選取3 例患兒，在使用地塞米松進(jìn)行治療的第5 天抽取其適量靜脈血，分離出血漿，采用Elisa 法檢測(cè)其血漿中TNF-α、IL-6 和IL-1α 的水平（記為Dexamethasone 組），并與這些患兒未使用地塞米松進(jìn)行治療前其血漿TNF-α、IL-6 和IL-1α 的水平（記為Non組）進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，與治療前相比，治療后其血漿TNF-α、IL-6 和IL-1α 的水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖2。

2.3 經(jīng)地塞米松處理的小兒急性淋巴細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子的mRNA 水平及蛋白水平

用地塞米松對(duì)小兒急性淋巴細(xì)胞RS4:11 和TOM-1 進(jìn)行處理后3 h 及6 h，收集細(xì)胞的上清液，提取RNA，采用qPCR 法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6 及IL-1α的mRNA 水平，結(jié)果顯示，用地塞米松對(duì)小兒急性淋巴細(xì)胞RS4:11 和TOM-1 進(jìn)行處理后，細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6 和IL-1α 的mRNA 水平均顯著降低（詳見(jiàn)圖3）。用地塞米松對(duì)小兒急性淋巴細(xì)胞RS4:11 和TOM-1 進(jìn)行處理后3 h 及6 h，收集細(xì)胞的上清液，采用Elisa 法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6 及IL-1α 的蛋白水平，結(jié)果顯示，用地塞米松對(duì)小兒急性淋巴細(xì)胞RS4:11 和TOM-1 進(jìn)行處理后，細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6 和IL-1α 的蛋白水平均顯著降低（詳見(jiàn)圖4）。用地塞米松對(duì)小兒急性淋巴細(xì)胞RS4:11 和TOM-1 進(jìn)行處理后3 h 及6 h，收集細(xì)胞的上清液，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1α及IL-6 受體IL-6R 的蛋白水平，結(jié)果顯示，用地塞米松對(duì)小兒急性淋巴細(xì)胞RS4:11 和TOM-1 進(jìn)行處理后，細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1α 和IL-6 受體IL-6R 的蛋白水平均顯著降低（詳見(jiàn)圖5）。由以上結(jié)果可知，用地塞米松對(duì)小兒急性淋巴細(xì)胞RS4:11 和TOM-1 進(jìn)行處理后，細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1α 和IL-6 的蛋白水平和mRNA 水平均顯著降低，且IL-6 受體IL-6R 的表達(dá)受到顯著抑制。

圖2 應(yīng)用地塞米松前后患兒血漿TNF-α、IL-6 及IL-1α 水平的變化Figure 2 The patient took venous blood 5 days after dexamethasone treatment and before treatment to separate the plasma. Elisa detected the protein levels of TNF-α, IL-6 and IL-1α in the child’s plasma.

圖3 經(jīng)地塞米松處理的小兒急性淋巴細(xì)胞RS4:11 和TOM-1 中TNF-α、IL-6 及IL-1α 的mRNA 水平Figure 3 Pediatric acute lymphocytes RS4: 11,TOM-1 were treated with dexamethasone for 3 h and 6 h,cells were collected,RNA was extracted,and mRNA levels of TNF-α,IL-6 and IL-1α were detected

圖4 經(jīng)地塞米松處理的小兒急性淋巴細(xì)胞RS4:11 和TOM-1 中TNF-α、IL-6 及IL-1α 的蛋白水平Figure 4 Pediatric acute lymphocytes RS4: 11,TOM-1 were treated with dexamethasone for 3 h and 6 h,and the cell supernatants were collected.Elisa detected the protein levels of TNF-α,IL-6 and IL-1α

圖5 經(jīng)地塞米松處理的小兒急性淋巴細(xì)胞RS4:11 和TOM-1 中TNF-α、IL-6 及IL-6 受體IL-6R 的蛋白水平Figure 5 Pediatric acute lymphocytes RS4: 11,TOM-1 were treated with dexamethasone for 3 h and 6 h,cells were collected,total protein was extracted,and protein levels of TNF-α,IL-6 and IL-1α were detected

3 討論

睡眠是身體發(fā)育、晝夜節(jié)律、體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和其他綜合因素的平衡過(guò)程。在睡眠時(shí)間方面，同一年齡段的兒童存在很大的個(gè)體化差異。隨著年齡的增長(zhǎng)，兒童的睡眠時(shí)間會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的變化[6-9]。但通常情況下兒童對(duì)夜間睡眠的需求基本一致[10-12]。本研究的結(jié)果顯示，急性淋巴細(xì)胞白血病患兒在使用地塞米松進(jìn)行治療后，其夜間睡眠的時(shí)間延長(zhǎng)，喚醒頻率降低，且大部分患兒恢復(fù)了白天短暫睡眠的習(xí)慣。這一結(jié)果與Hind 等[13]的研究結(jié)果相似。患兒在應(yīng)用地塞米松后盡管其白天可短暫睡眠，但不會(huì)對(duì)其夜間睡眠造成影響。有研究證實(shí)，急性淋巴細(xì)胞白血病患兒在應(yīng)用大劑量的地塞米松后，可能對(duì)其下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）和（或）體內(nèi)的多種細(xì)胞因子產(chǎn)生影響，進(jìn)而可對(duì)其睡眠造成影響[14-17]。有研究指出，皮質(zhì)類固醇激素可通過(guò)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行多層次的影響〔如提高警覺(jué)性或間接地通過(guò)反饋機(jī)制抑制促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）的釋放〕而影響睡眠[18-22]。CRH 可激活藍(lán)斑-去甲腎上腺素系統(tǒng)，從而可降低清醒度并增加慢波睡眠。地塞米松已被證實(shí)可增加慢波睡眠及促進(jìn)白天嗜睡[23-24]。地塞米松對(duì)睡眠的影響可能涉及到炎性細(xì)胞因子。Zupanec 等[25]研究指出，TNF-α、IL-1α 和IL-6 在睡眠調(diào)節(jié)中起著重要作用。Sadeh 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α 與IL-6 單核苷酸的多態(tài)性與急性淋巴細(xì)胞白血病患兒出現(xiàn)睡眠紊亂有關(guān)。TNF-α、IL-1α 和IL-6 被認(rèn)為是研究人類和動(dòng)物“疾病綜合征”的媒介，這三種炎性細(xì)胞因子被認(rèn)為是介導(dǎo)疲勞的重要因子[27-33]。

綜上所述，用地塞米松對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病患兒進(jìn)行治療能增加其夜間睡眠時(shí)間和白天睡眠（小睡）時(shí)間，抑制其體內(nèi)TNF-α、IL-1α 和IL-6 的表達(dá)。地塞米松影響急性淋巴細(xì)胞白血病患兒睡眠的機(jī)制可能與此藥能夠抑制患兒體內(nèi)TNF-α、IL-1α 和IL-6 的表達(dá)有關(guān)。