抗稻瘟病生防細(xì)菌的分離與篩選

衛(wèi)甜 呂敏 劉懷阿 朱錦磊 蘇建坤

摘要：由病原真菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病是水稻生產(chǎn)上的一種毀滅性病害。從稻瘟病發(fā)病嚴(yán)重的田塊分別采集健康株和病株，從14個(gè)不同生境（土壤、根莖葉圍、根莖葉內(nèi)）中共分離得到304株潛在生防細(xì)菌。通過(guò)對(duì)各細(xì)菌胞外產(chǎn)酶活性（葡聚糖酶、纖維素酶、蛋白酶）及產(chǎn)吲哚乙酸活性進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)不同指標(biāo)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行賦值，最終選擇評(píng)分≥3分的114株細(xì)菌進(jìn)行稻瘟病菌的平板拮抗試驗(yàn)，從中篩選得到15株對(duì)稻瘟病病菌有明顯拮抗作用的生防細(xì)菌。最終根據(jù)賦值評(píng)分結(jié)果及平板拮抗試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)篩選出的17株具有防治稻瘟病潛在能力的生防細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA鑒定，鑒定結(jié)果表明，有15株為芽孢桿菌，1株為糖霉菌，另1株為水庫(kù)桿菌。本研究以此建立一個(gè)針對(duì)稻瘟病生防細(xì)菌篩選的系統(tǒng)，得到的生防細(xì)菌可以為田間防治稻瘟病并最終應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：稻瘟病;細(xì)菌篩選;酶活性測(cè)定;平板拮抗;生防細(xì)菌

中圖分類(lèi)號(hào)： S435.111.4+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）07-0106-05

收稿日期：2020-06-04

基金項(xiàng)目：江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所專(zhuān)項(xiàng)基金[編號(hào)：SJ（17）103]。

作者簡(jiǎn)介：衛(wèi) 甜（1990—），女，山西運(yùn)城人，碩士，助理研究員，主要從事植物病害的生物防治工作。Tel：（0514）87302229;E-mail：weitian900128 @163.com。

通信作者：蘇建坤，碩士，研究員，主要從事植物病蟲(chóng)害的綠色防控工作。Tel：（0514）87302325;E-mail：yzsujk@163.com。

水稻（Oryza sativa）是草本稻屬中的一種，全球近50%的人口以此為主糧[1]。2019年全球水稻種植面積約為1.63億hm2，其中我國(guó)水稻種植面積約占全球的18.57%。由病原真菌稻瘟病病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是水稻生產(chǎn)上的一種毀滅性病害，被列為水稻三大病害之首，每年可造成10%～20%的產(chǎn)量損失，危害嚴(yán)重的地區(qū)損失達(dá)到40%～50%[2]?？共∮N、化學(xué)防治是目前針對(duì)稻瘟病防治的主要手段。

在抗病育種方面，由于稻瘟病病原真菌變異分化速度快、多樣性程度高及新的生理小種層出不窮，但常規(guī)育種方法選育周期長(zhǎng)，育出的抗病品種抗性單一，并且抗性喪失比較快，使抗病品種的廣譜抗性和持久抗性難以實(shí)現(xiàn)，育種行業(yè)發(fā)展舉步維艱[3]。在化學(xué)防治方面，相繼出現(xiàn)了一些防治稻瘟病效果較好的化學(xué)農(nóng)藥。據(jù)相關(guān)報(bào)道，0.2% 苯丙烯菌酮微乳劑、30% 戊唑·嘧菌酯懸浮劑、9%吡唑醚菌酯（稻清）微囊懸浮劑等均對(duì)稻瘟病的防效可達(dá)到60%～90%[4-6]?；瘜W(xué)農(nóng)藥的出現(xiàn)雖在一定程度上解決了稻瘟病防治難的問(wèn)題，但隨著公眾食品安全意識(shí)的提高，其過(guò)量使用帶來(lái)了病原菌抗性增強(qiáng)、環(huán)境污染加重、稻米農(nóng)藥殘留等新問(wèn)題?；瘜W(xué)防治帶來(lái)了植物抗藥性及食品安全問(wèn)題，而傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)防治又難達(dá)到預(yù)期的控制效果。在這種形式下，利用有益微生物來(lái)防治該病成為一種新的防治方向。

本研究通過(guò)篩選生防菌對(duì)稻瘟病進(jìn)行防治，最終篩選得到17株具有生防潛力的細(xì)菌，以此為基礎(chǔ)，建立防治稻瘟病快速篩選、評(píng)估體系，以期為生物農(nóng)藥田間防控稻瘟病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 稻瘟病生防細(xì)菌的采集與分離

細(xì)菌采集：于2018年9月在江蘇省揚(yáng)州市廣陵區(qū)灣頭水稻試驗(yàn)基地稻瘟病發(fā)病嚴(yán)重的地塊，采用5點(diǎn)取樣法分別采集健康植株和發(fā)病植株及其根圍土壤。將采集后的樣品迅速裝入寫(xiě)好編號(hào)的塑料袋中帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離，植株體表及體內(nèi)細(xì)菌的分離方法分別參照Berg等的方法[7-8]。

細(xì)菌編號(hào)：B表示病株，J表示健康株;土壤分離的細(xì)菌用T表示;根圍細(xì)菌用GW表示，根內(nèi)細(xì)菌用GN表示;莖圍細(xì)菌用JW表示，莖內(nèi)細(xì)菌用JN表示;葉圍細(xì)菌用YW表示，葉內(nèi)細(xì)菌用YN表示;阿拉伯?dāng)?shù)字連續(xù)表示每次保留的細(xì)菌數(shù)量。如：細(xì)菌編號(hào)為BGW11，表示從發(fā)病植株根圍分離保留的第11株細(xì)菌，以此類(lèi)推。

1.2 產(chǎn)酶和代謝產(chǎn)物活性測(cè)定

產(chǎn)纖維素酶活性的測(cè)定：將待鑒定的菌落用牙簽轉(zhuǎn)移到纖維素酶活性測(cè)定平板，28 ℃條件下培養(yǎng) 48 h，用1 g/L的剛果紅溶液染1 h后，倒掉染液，用1 mmol/L的NaCl溶液浸泡1 h[9];產(chǎn)蛋白酶活性的測(cè)定采用同樣的方法，將待鑒定的菌落轉(zhuǎn)移到蛋白培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d[10];產(chǎn)β-1，3-葡聚糖酶活性的測(cè)定：將待鑒定的菌落用牙簽轉(zhuǎn)移到葡聚糖平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h。以上均須觀(guān)察透明圈有無(wú)，并記錄透明圈大小。產(chǎn)吲哚乙酸活性的測(cè)定，完全參照Sawar 等的方法[11]。

1.3 細(xì)菌的賦值評(píng)估

潛在生防細(xì)菌賦值評(píng)估，評(píng)分如下：產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶活性各3分，其中酶活透明圈半徑為0～3 mm 賦1分，3～6 mm 賦2分，>6 mm賦3分;產(chǎn)吲哚乙酸和葡聚糖酶活性各賦1分，共計(jì)8分。

1.4 細(xì)菌對(duì)稻瘟病菌的平板拮抗

采用對(duì)峙培養(yǎng)法，將保存于4 ℃冰箱中的稻瘟病病菌斜面用接種針接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基平板上活化，待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)平板后用滅菌的打孔器從菌落外邊緣均勻地打成直徑為8 mm的圓形菌塊。將菌絲塊接種在PDA平板的中心，在其四周距中心約35 mm處分別接種1株待測(cè)定的細(xì)菌。25 ℃條件下培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)平板后，分別記錄各抑菌圈的半徑（cm），重復(fù)4次。

1.5 細(xì)菌的16S rDNA鑒定

引物采用細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增通用引物U8-27、L1494-1514，測(cè)序由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司完成。獲得的16S rDNA序列在Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）中進(jìn)行比對(duì)，取得鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生境中生防菌的分離結(jié)果

本次試驗(yàn)共從水稻14個(gè)不同生境（分別是健康株和病株的根莖葉圍、根莖葉內(nèi)以及土壤等）中分離得到304株生防細(xì)菌（表1）。其中從健康株和病株不同生境中分離得到的細(xì)菌數(shù)量分別為140、164株，分別占總分離菌數(shù)的46.05%、53.95%，總體相差不大。而從健康株葉圍、病株莖圍以及病株根圍分離得到的細(xì)菌數(shù)量最多，分別為36、35、34株，共占總菌數(shù)的34.54%。葉內(nèi)分離到的細(xì)菌總數(shù)為13株，只占總菌數(shù)的4.28%。整體來(lái)說(shuō)，本研究通過(guò)對(duì)水稻稻瘟病健康株各個(gè)生境進(jìn)行細(xì)菌分離，初步獲得了數(shù)量比較豐富的潛在生防菌。

2.2 細(xì)菌產(chǎn)酶活性測(cè)定結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn)，生防細(xì)菌產(chǎn)生的某些次生代謝產(chǎn)物如水解酶蛋白酶、纖維素酶以及胞壁降解酶β-1，

3-葡聚糖酶會(huì)幫助增強(qiáng)寄主植物的競(jìng)爭(zhēng)力;吲哚乙酸作為一種生長(zhǎng)激素，會(huì)影響植物細(xì)胞的分裂、伸長(zhǎng)、分化和種子萌發(fā)、根系的發(fā)育以及營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程。為此，對(duì)從不同生境中分離得到的304株細(xì)菌分別進(jìn)行胞外酶活性及產(chǎn)吲哚乙酸活性測(cè)定，結(jié)果（表1）表明，在304株潛在生防菌中，具有蛋白酶活性的細(xì)菌最多，共計(jì)235株，占總菌數(shù)的77.30%;其次是纖維素酶（98株）、葡聚糖酶（57株），分別占總菌數(shù)的32.24%、18.75%;產(chǎn)吲哚乙酸的生防細(xì)菌最少（10株），只占3.29%。

具體分析各種酶活性發(fā)現(xiàn)，在健康株中，產(chǎn)蛋白酶活性高的細(xì)菌來(lái)源于葉內(nèi)，高達(dá)100%，產(chǎn)纖維素酶活性高的細(xì)菌來(lái)源于根圍（65.38%），產(chǎn)葡聚糖酶活性高的細(xì)菌來(lái)源于莖內(nèi)（22.22%），產(chǎn)吲哚乙酸活性高的細(xì)菌來(lái)源于葉內(nèi)（20.00%）;在病株中，產(chǎn)蛋白酶活性高的細(xì)菌來(lái)源于根圍（82.35%），產(chǎn)纖維素酶活性高的細(xì)菌來(lái)源于葉內(nèi)（50.00%），產(chǎn)葡聚糖酶活性高的細(xì)菌來(lái)源于葉內(nèi)（37.50%），產(chǎn)吲哚乙酸活性高的細(xì)菌來(lái)源于葉內(nèi)（25.00%）?？傊诓煌仓晟持蟹蛛x得到的細(xì)菌產(chǎn)酶活性和產(chǎn)吲哚乙酸能力差異較大，從病株不同生境中分離得到的細(xì)菌數(shù)量明顯高于健康株生境。無(wú)論是健康或發(fā)病植株，從葉圍和根圍中分離得到的細(xì)菌普遍具有較高的產(chǎn)酶活性。

2.3 細(xì)菌中酶活性賦值得分結(jié)果

對(duì)分離得到的304株潛在生防細(xì)菌進(jìn)行賦值評(píng)估，評(píng)分較高的說(shuō)明防治稻瘟病效果好的可能性高。在304株細(xì)菌中，有256株細(xì)菌至少具有1種活性，其中有3株細(xì)菌同時(shí)具有4種活性，有23株細(xì)菌具有3種活性，有91株細(xì)菌具有2種活性。具有4種活性的3株生防細(xì)菌全部來(lái)自健康植株內(nèi)，賦予最高分值8分。7株生防菌評(píng)分為7分，大多數(shù)來(lái)自病株。根據(jù)賦值評(píng)分結(jié)果，選取賦值評(píng)分≥3分的細(xì)菌對(duì)稻瘟病病菌進(jìn)行平板拮抗試驗(yàn)，共計(jì)114株（表2）。

2.4 細(xì)菌對(duì)稻瘟病病菌的平板拮抗結(jié)果

通過(guò)114株細(xì)菌對(duì)稻瘟病病菌的平板拮抗試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)共15株對(duì)稻瘟病病菌具有不同程度的抑制效果，占總測(cè)定菌數(shù)的13.16%。抑菌率在50%以上的有10株，其中7株來(lái)源于病株，3株來(lái)源于健康株（表3）。來(lái)自健康株葉圍的JYW21對(duì)稻瘟病病菌的抑制率最高，達(dá)78.25%。

2.5 生防菌的鑒定結(jié)果

結(jié)合表2的酶活測(cè)定結(jié)果，選取賦值評(píng)估為8分，外加15株對(duì)稻瘟病具有明顯拮抗作用的生防細(xì)菌，本次共初步得到17株潛在生防細(xì)菌。根據(jù)16S rDNA基因序列的測(cè)序結(jié)果，與BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果（表4）顯示，篩選出的17株細(xì)菌中有1株為糖霉菌屬（Glycomyces）細(xì)菌，1株為水庫(kù)桿菌屬（Piscinibacter）細(xì)菌，另外15株均為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）細(xì)菌，其中4株為蠟質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus cereus），4株為高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis），2株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

3 結(jié)論與討論

本研究在對(duì)防治稻瘟病生防細(xì)菌的酶活篩選、平板拮抗及賦值評(píng)估體系時(shí)發(fā)現(xiàn)，在植株不同生境中分離得到的細(xì)菌產(chǎn)酶活性和產(chǎn)吲哚乙酸能力差異較大，從病株不同生境中分離得到的具有產(chǎn)酶活性和產(chǎn)吲哚乙酸能力的細(xì)菌數(shù)量明顯高于健康株生境，可能是由于在稻瘟病病菌侵染的情況下，更能激發(fā)植株體內(nèi)的防御反應(yīng)，分離得到的細(xì)菌產(chǎn)生防御酶活性也相對(duì)更高。對(duì)稻瘟病病菌的平板拮抗是建立在酶活篩選基礎(chǔ)上的，因?yàn)橛行┘?xì)菌酶活評(píng)分很高但對(duì)稻瘟病病菌并未表現(xiàn)出明顯的拮抗效果（如來(lái)源于健康土壤內(nèi)的JT7），分析可能是由于該細(xì)菌對(duì)稻瘟病的防治并不會(huì)直接殺死病原菌，而是通過(guò)誘導(dǎo)抗病性。在分離得到的細(xì)菌田間防效指標(biāo)未知的情況下，評(píng)估生防細(xì)菌潛能應(yīng)該是取兩者之和更為客觀(guān)科學(xué)。因此，該體系可以作為針對(duì)稻瘟病篩選生防細(xì)菌的基礎(chǔ)，為大規(guī)模篩選生防菌體系的建立提供參考。

本研究以此體系為基礎(chǔ)最終得到具有防治稻瘟病潛在能力的17株生防細(xì)菌，并且其中9株來(lái)源于健康株，分析可能是此時(shí)植株生境有益生菌能保護(hù)植物，抑制病原菌發(fā)生發(fā)展，而益生菌也會(huì)相應(yīng)發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)菌群，但最終得到的17株細(xì)菌也不能說(shuō)對(duì)稻瘟病的防治會(huì)有絕對(duì)的效果，后期仍須進(jìn)行溫室及田間試驗(yàn)等研究，主要由于當(dāng)這些細(xì)菌實(shí)際應(yīng)用于水稻時(shí)，其防效必將會(huì)受到田間土壤、氣候、溫濕度、土壤微生物等諸多因素的綜合影響。

芽孢桿菌屬（Bacillus）的細(xì)菌早已在國(guó)內(nèi)外得到了廣泛的關(guān)注，應(yīng)用潛力最大[12]。其廣泛受關(guān)注的原因是芽孢桿菌易于分離和純化，同時(shí)能產(chǎn)生耐熱、抗逆性強(qiáng)的芽孢，且制劑穩(wěn)定、抑菌能力強(qiáng)、施用方便、便于運(yùn)輸[13]。針對(duì)稻瘟病的生物防治，早有研究報(bào)道，從水稻根際篩選的208 株細(xì)菌對(duì)稻瘟病病菌有較好的拮抗作用，其中包括蠟狀芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌在內(nèi)的一些芽孢桿菌防效可達(dá)50%以上[14];枯草芽孢桿菌 IK-1080的培養(yǎng)濾液，當(dāng)芽孢濃度在1×108、5×108CFU/mL時(shí)，明顯可以抑制稻瘟病病菌分生孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，葉瘟的發(fā)生率分別減輕13.8%、7.7%，產(chǎn)量損失減少522%、735%[15];從水稻根系土壤中分離得到的枯草芽孢桿菌 T492對(duì)稻瘟病病菌的抑制率達(dá) 626%[16]。本次試驗(yàn)初步得到17株生防細(xì)菌，經(jīng)過(guò)鑒定絕大多數(shù)為芽孢桿菌，相信對(duì)稻瘟病的生物防治具有重要意義，后續(xù)將專(zhuān)門(mén)對(duì)芽孢桿菌的生防效果進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)并且研究其抗病機(jī)制，從理論及實(shí)際應(yīng)用為稻瘟病的生物防治提供基礎(chǔ)。

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