黃連根腐病土赤殼屬病原真菌的鑒定

伍曉麗,陳大霞,劉 飛,王 鈺,李隆云*

(1.重慶市中藥研究院種植研究所，重慶 400065；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心重慶分中心，重慶 400065；3.重慶市中藥研究院大健康中心，重慶 400065)

【研究意義】黃連是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，為毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch．)、 三角 葉 黃 連(CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao)或云連(Coptisteetawal1．)的干燥根莖。以上3種分別習(xí)稱味連、雅連、云連，是我國(guó)內(nèi)銷和出口的大宗藥用植物。其中，味連品質(zhì)好，產(chǎn)量最高；黃連性寒，味苦，具有瀉火解毒、清熱燥濕的功效，使用十分廣泛。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，13部宋代以前著作的3.2萬(wàn)多個(gè)古方劑中，含有黃連的方劑有1760種，占5 %左右[1]。重慶市石柱縣是味連主產(chǎn)區(qū)，也是全國(guó)聞名的“黃連之鄉(xiāng)”，黃連產(chǎn)量約占全國(guó)總產(chǎn)量的60 %左右。石柱黃連于2006年獲得了“國(guó)家地理標(biāo)志”產(chǎn)品稱號(hào)，目前石柱黃連的種植面積達(dá)3333 hm2[2]。黃連根腐病近年來(lái)在多個(gè)產(chǎn)地發(fā)生，造成減產(chǎn)3～4萬(wàn)元/667m2，嚴(yán)重挫傷連農(nóng)種植積極性，影響了該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本項(xiàng)目組前期研究發(fā)現(xiàn)，根腐病是多種真菌復(fù)合侵染所導(dǎo)致的病害，目前已鑒定出少部分鐮刀菌屬的病原真菌，但還有一些病原真菌的分類地位尚不明確，開(kāi)展這些病原菌的鑒定工作，對(duì)防治該病具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】黃連根腐病的相關(guān)研究報(bào)道很少，宋旭紅等通過(guò)Illumina高通量測(cè)度比較根腐病黃連根際土壤、健康黃連根際和未種植黃連的土壤的微生物群落，發(fā)現(xiàn)二者微生物群落有顯著不同：鐮刀菌屬的相對(duì)豐度，根腐病黃連根際土壤顯著高于健康黃連根際土；細(xì)菌種群豐富度，黃連病株根際土壤低于未種植黃連土壤和健康黃連根際土壤[3-4]。Luo X M等[5]發(fā)現(xiàn)，茄腐鐮刀菌是黃連根腐病的病原真菌之一，本課題組通過(guò)病根組織分離內(nèi)生真菌，所分離出的真菌進(jìn)行離體回接和活體回接篩選出病原真菌，分子鑒定和形態(tài)鑒定結(jié)果表明，尖孢鐮刀菌也是致病菌之一，它在黃連病根中分離頻率較高，是鐮刀菌屬的優(yōu)勢(shì)菌，且致病力很強(qiáng)[6]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，根腐病病株根部土赤殼屬真菌分離頻率很高，且該屬真菌可能含根腐病病原[7]，但目前尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。而準(zhǔn)確鑒定出所有的病原菌是防治的基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采集石柱黃連根腐病植株根條，使用組織分離法進(jìn)行可培養(yǎng)真菌分離后，通過(guò)離體根條回接和活體回接對(duì)其中的土赤殼屬真菌進(jìn)行致病性檢測(cè)，對(duì)其ITS序列進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，分子鑒定結(jié)果結(jié)合形態(tài)鑒定，將病原菌鑒定到種，為黃連根腐病的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料、試劑及儀器參照文獻(xiàn)[7]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 可培養(yǎng)內(nèi)生真菌分離與純化 分離培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[7]。培養(yǎng)4～8 d后，挑取組織周圍長(zhǎng)出的棕黃色、氈絨狀、生長(zhǎng)緩慢的菌絲[8]，轉(zhuǎn)接PDA中純化，直到獲得純菌落。

1.2.2 可培養(yǎng)真菌分子鑒定 分子鑒定步驟參照文獻(xiàn)[7]。

1.2.3 離體回接 根據(jù)分子鑒定的結(jié)果，每一個(gè)菌種選擇1個(gè)菌株做離體回接，回接方法見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。

1.2.4 活體回接 取離體回接發(fā)病嚴(yán)重的菌株做回接，回接方法及病情指數(shù)計(jì)算和病菌再分離見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。

1.2.5 菌株形態(tài)鑒定 用插片法對(duì)致病菌進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.2.6 致病菌遺傳變異分析 在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)2株菌的菌落形態(tài)發(fā)生了變異，利用SeqMan軟件對(duì)2個(gè)變異菌株和它們的原始菌株ITS序列進(jìn)行了突變位點(diǎn)比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土赤殼屬真菌分子鑒定結(jié)果

從黃連病根中共分離到土赤殼屬真菌38株(表1)，Ilyonectriadestructans、Ilyonectrialiliigena、Ilyonectriasp.isolate Cg07是其中的優(yōu)勢(shì)菌。此外，5.6、B5在保存過(guò)程中菌株形態(tài)發(fā)生了明顯變化，菌絲變得更短、稀疏，由棕黃色變成了米白色，變異后的菌株編號(hào)分別是5.6W、B5W。

2.2 離體回接發(fā)病情況

離體回接結(jié)果表明，除5.6和10.4外，其余菌均有強(qiáng)弱不等的致病性，B5、5.6和它們的變異株致病性不同。因此挑取除5.6和10.4外的8個(gè)菌株做活體回接試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1和表2。

2.3 活體回接發(fā)病情況

活體回接的根均有不同程度的發(fā)病(表3、圖2)，其中12.12病情指數(shù)最高，其次是12.4。B5和它的變異株致病性不同。發(fā)病的根部分或全部變黑腐爛。病情輕緩的植株葉片較正常，有新葉生長(zhǎng)；病情嚴(yán)重的植株新芽極少或沒(méi)有，大量葉片枯死。而活體回接發(fā)病的根進(jìn)行再分離，仍然能分離到回接所用菌株。

2.4 致病菌形態(tài)鑒定

選取致病性最強(qiáng)的兩株菌12.4和12.12進(jìn)行形態(tài)觀察。

12.4(圖3)。菌落在PDA上生長(zhǎng)慢，氣生菌絲很短，呈氈絨狀，幼嫩時(shí)白色，后變成棕黃色。菌落生長(zhǎng)前期主要產(chǎn)生分生孢子，后期產(chǎn)生厚垣孢子。菌絲粗，直徑2.7～5.4 μm，黃色，有明顯的隔，節(jié)間向內(nèi)縊縮，呈現(xiàn)臘腸狀。厚垣孢子多，球形或橢球形，光滑，間生或頂生，單生、成串狀或成簇生長(zhǎng)，茶褐色，直徑11.5～16.7 μm。分生孢子梗多為單生。產(chǎn)生大分生孢子和小分生孢子。小分生孢子0～1 隔，無(wú)色透明，大小5.2～13.0 μm×2.2～5.3 μm；大分生孢子圓柱狀，稍彎，無(wú)色，1～3 隔，1 隔大孢子 19.7～35.4 μm×1.8～8.5 μm；2隔大孢子22.8～37.5 μm×4.2～7.5 μm；3隔大孢子38.1～43.4 μm×3.1～7.9 μm。分子鑒定結(jié)果表明該菌與I.destructansisolate 17eum01-01相似性99 %，而I.destructans是Cylindrocarpondestructans的有性型。參考龍?jiān)戮甑鹊奈墨I(xiàn)報(bào)道[9]，將該菌鑒定為I.destructans(C.destructans)。

表1 黃連病根中土赤殼屬真菌的分子鑒定結(jié)果

表2 黃連根條離體回接結(jié)果

12.12(圖4)。菌落形態(tài)類似12.4。菌落生長(zhǎng)前期主要產(chǎn)生分生孢子，后期產(chǎn)生厚垣孢子。顯微鏡下，菌絲形狀類似12.4，直徑3.6～6.7 μm。厚垣孢子很多，光滑，球狀或橢圓形，間生或頂生，單生或成串生長(zhǎng)，淺褐色，直徑11.2～15.3 μm。分生孢子梗單生或分枝。分生孢子長(zhǎng)圓形，無(wú)色透明，直或微彎，大分生孢子36.5～44.8 μm×8.8～10.3 μm，1～3隔，小分生孢子12.1～26.8 μm×5.9～7.6 μm，0～1隔。分子鑒定結(jié)果表明該菌與I.liliigenastrain G2相似性99 %。參考Ana Cabral等的文獻(xiàn)報(bào)道[10]，將該菌鑒定為I.liliigena。

2.5 突變菌株比對(duì)分析結(jié)果

菌株5.6和B5 ITS序列堿基的突變?nèi)堪l(fā)生在該序列的兩端，包括堿基的突變和缺失。突變的堿基數(shù)不等，5.6有21個(gè)，B5有10個(gè)。2個(gè)菌的ITS序列堿基易突變區(qū)域都集中在兩端1～23個(gè)堿基以內(nèi)(圖5)。

表3 黃連根條活體回接結(jié)果

3 討 論

本研究結(jié)果表明，土赤殼屬的Ilyonectriadestructans和I.liliigena是導(dǎo)致黃連根腐病的致病菌，而已報(bào)道的黃連根腐病菌均屬于鐮刀菌屬[5-6]。土赤殼屬的真菌作為植物根腐病病原菌報(bào)道的不多[11-12]。I.destructans能引起虎舌紅莖腐病[13]。I.liliigena導(dǎo)致百合根腐病，以其寄主王百合(Liliumregale)命名[10]。土赤殼屬的上述2個(gè)菌雖然導(dǎo)致黃連根腐病，但從根條腐爛程度看，其對(duì)根條的侵染能力不如鐮刀菌強(qiáng)[6]。這兩株真菌在病根中分離頻率比較高，也屬于主要病原真菌。

不少土赤殼屬菌株在PDA上培養(yǎng)過(guò)程中也會(huì)發(fā)生形態(tài)變異，由棕黃色變成米白色，菌絲變得更短。離體回接和活體回接的結(jié)果表明，其致病性也發(fā)生了變化。分子鑒定結(jié)果表明其ITS序列堿基也發(fā)生了突變。說(shuō)明這類真菌變異性比較強(qiáng)。真菌在生長(zhǎng)、培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生基因組的突變，導(dǎo)致其生理生化特征、毒性、致病性變化的現(xiàn)象比較常見(jiàn)。引起小麥赤霉病的禾谷鐮刀菌(FusariumgraminearumSchw.)在PDA平板上可產(chǎn)生菌落角變，純化的角變菌株較親本菌落生長(zhǎng)速度慢，分生孢子和子囊殼產(chǎn)生能力下降或喪失，對(duì)小麥寄主的致病力減弱[14]。蟬擬青霉[Paecilomycescicadae(Mique1) Samson]菌株在沙氏培養(yǎng)基上可產(chǎn)生孢子型和菌絲型兩類不同的突變菌株，它們和原始菌株相比較，胞外多糖、蛋白酶、SOD等的含量以及對(duì)甘藍(lán)蚜的致病性均有顯著變化[15]。由此也推測(cè)，在大田里，這些土赤殼屬真菌會(huì)不斷發(fā)生基因變異，導(dǎo)致其生物學(xué)特性和致病性變化，因此生產(chǎn)上靠單一農(nóng)藥防控效果不好，需采用復(fù)配農(nóng)藥制劑，同時(shí)結(jié)合調(diào)整栽培措施、土壤治理等手段進(jìn)行綜合防治。

本研究雖然鑒定出了部分土赤殼屬的病原真菌，但以下問(wèn)題有待深入探討：從分子鑒定結(jié)果看，本研究分離到的土赤殼菌有6種，活體回接結(jié)果表明，除了I.destructans和I.liliigena外，剩余的菌也有一定致病性，不排除它們?cè)诨蛲蛔兒?，致病性增?qiáng)的可能。因此，后期我們將對(duì)土赤殼屬病原真菌基因突變前后的致病性、耐藥性、生物學(xué)特性變化等問(wèn)題開(kāi)展深入研究。

4 結(jié) 論

采用分子鑒定和形態(tài)鑒定相結(jié)合的方法，對(duì)近年來(lái)流行的黃連根腐病病原菌進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為Ilyonectriadestructans和I.liliigena，且這類土赤殼屬真菌基因易發(fā)生突變。