咖啡因?qū)V誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

干春霞，胡財江，王立甜，高梓琪，李 今， 徐 晶，王宣軍,3，盛 軍，徐歡歡,3*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)普洱茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，云南 昆明 650201；4.云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器設(shè)備

人永生化表皮角質(zhì)細(xì)胞(HaCaT)購于中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫；高糖培養(yǎng)基DMEM/HIGH GLUCOSE(Thermo)；FBS(Foetal Bovine Serum，胎牛血清)購于Biological Industries公司；胰蛋白酶—EDTA消化液(T1300)、青鏈霉素混合液(P1400)、高效RIPA裂解液(R0010)購于北京Solarbio Life Science公司。

咖啡因(Caffeine)、二甲基亞砜、組織固定液、結(jié)晶紫購于美國Sigma公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010)購于Beyotime生物技術(shù)公司；MMP9抗體(ab76003)、Acetyl-p53抗體(ab109396)購于Abcam公司；p-p38一抗(4511)、p-ERK一抗(4370)、p-JNK一抗(9255)、SIRT3一抗(5490)購于Cell Signaling Technology(CST)公司；二抗Anti-mouse IgG、Anti-rabbit IgG購于R&D Systems公司；細(xì)胞質(zhì)活性氧熒光染料CM-H2DCFDA(C6827)、特異性線粒體超氧化物熒光染料MitoSOX Red(M36008)購于Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)箱(BINDER)；移液器(Thermo)；倒置熒光顯微鏡(Leica)；Automated cell counter(C10281，Invitrogen)；酶標(biāo)儀(Thermo)；低速離心機(jī)(中佳 SC-3616)。

1.3 方法

1.3.1 氧化損傷細(xì)胞模型建立 復(fù)蘇人永生化表皮角質(zhì)細(xì)胞(HaCaT)，在含有10 %胎牛血清的高糖細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于含5 % CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中，連續(xù)傳代2次使得細(xì)胞生長活力一致且細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定。經(jīng)過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，使用功率為20 W的UVB紫外照射燈管對貼壁50 %左右的HaCaT細(xì)胞進(jìn)行照射，構(gòu)建UV誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷模型，輻射劑量為0.53 J·cm-2。實(shí)驗(yàn)設(shè)4組處理：處理1(咖啡因0 μg·mL-1、無UV照射)、處理2(咖啡因0 μg·mL-1、UV照射)、處理3(咖啡因50 μg·mL-1、UV照射)和處理4(咖啡因100 μg·mL-1、UV照射)。

1.3.2 結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn) 以建立的HaCaT細(xì)胞氧化損傷模型為基礎(chǔ)，通過結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)檢測咖啡因?qū)τ诩?xì)胞生長的影響。各組細(xì)胞以80萬每皿的細(xì)胞密度接種至60 mm培養(yǎng)皿中過夜，待細(xì)胞貼壁牢固且細(xì)胞密度為50 %左右時對各組細(xì)胞進(jìn)行咖啡因預(yù)處理1 h，然后進(jìn)行UV照射。24 h后緩慢吸除培養(yǎng)基，用PBS清洗2～3次，使用4 %多聚甲醛固定20 min，固定結(jié)束后用UP水清洗1次，使用0.1 %結(jié)晶紫染液染色10 min，用UP水小心清洗3次后拍照記錄。

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)活性氧含量測定 將各組細(xì)胞以10萬每孔的密度接種至已經(jīng)放入細(xì)胞爬片的12孔板，待細(xì)胞貼壁牢固且細(xì)胞密度為50 %左右時對各組細(xì)胞進(jìn)行咖啡因預(yù)處理及UV照射，24 h后去除培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，加入含有5 μmol/L熒光染料的無酚紅培養(yǎng)基1 mL，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育15 min。取出細(xì)胞爬片貼在載玻片上，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度并拍照記錄[25]。使用Image J軟件分析各組熒光強(qiáng)度的相對量。

1.3.4 線粒體內(nèi)活性氧含量測定 與細(xì)胞內(nèi)活性氧含量檢測方式一致，各組細(xì)胞分別經(jīng)過誘導(dǎo)處理24 h后，加入含有5 μmol/L熒光染料的無酚紅培養(yǎng)基1 mL，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育15 min。取出細(xì)胞爬片并貼在載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度并拍照記錄[25]。使用Image J軟件分析各組熒光強(qiáng)度的相對量。

1.3.5 蛋白免疫印跡 以建立的HaCaT細(xì)胞氧化損傷模型為基礎(chǔ)，通過蛋白質(zhì)免疫印跡探究咖啡因?qū)V誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用機(jī)制。各組HaCaT細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)處理24 h后，消化、離心，收集細(xì)胞。用RIPA蛋白高效裂解液提取各組細(xì)胞中的總蛋白，用BCA蛋白定量法測得各組細(xì)胞總蛋白濃度。每組上樣20 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，2 h后轉(zhuǎn)PVDF膜，用5 %的脫脂奶粉封閉1 h后與p-p38、p-ERK、p-JNK、MMP9、SIRT3、Acetyl-p53及β-tubulin一抗孵育，4 ℃過夜。一抗回收后用TBST洗滌3次，室溫與兔抗或鼠抗IgG二抗孵育1 h。孵育結(jié)束后TSBT洗滌3次，利用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影檢測。使用AlphaView軟件分析各目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(X ± SEM)表示，兩組間差異采用t檢驗(yàn)。*表示與處理1相比，差異顯著(P<0.05)；**表示與處理1相比，差異極顯著(P<0.01)；***表示與處理1相比，差異高度顯著(P<0.001)；#表示與處理2相比，差異顯著(P<0.05)；##表示與處理2相比，差異極顯著(P<0.01)；###表示與處理2相比，差異高度顯著(P<0.001)。圖像采用 GraphPad Prism5.0軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡因?qū)V照射后HaCaT細(xì)胞存活率的影響

與處理1相比，處理2的HaCaT細(xì)胞經(jīng)過紫外線照射后，細(xì)胞存活率顯著降低(圖1)，說明造模成功；與處理2相比，處理3和處理4的細(xì)胞存活率顯著增加，并且呈現(xiàn)濃度依賴趨勢。由結(jié)晶紫染色結(jié)果可看出，咖啡因能增加UV照射后HaCaT細(xì)胞存活率。

2.2 咖啡因?qū)V照射后HaCaT細(xì)胞內(nèi)活性氧積累的影響

為明確咖啡因?qū)V誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，采用CM-H2DCFDA熒光染料對細(xì)胞內(nèi)活性氧含量進(jìn)行檢測。熒光染色結(jié)果顯示，咖啡因能顯著減少UV照射引起的HaCaT細(xì)胞內(nèi)的活性氧累積(圖2)。與處理1相比，處理2細(xì)胞經(jīng)紫外線照射后，細(xì)胞內(nèi)活性氧含量顯著增加(P<0.001)；與處理2相比，處理3細(xì)胞內(nèi)的活性氧的含量顯著降低(P<0.05)，處理4細(xì)胞內(nèi)的活性氧的含量極顯著降低(P<0.01)，表明咖啡因減少了UV照射引起的細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累。

2.3 咖啡因?qū)V照射后HaCaT細(xì)胞線粒體內(nèi)活性氧積累的影響

細(xì)胞內(nèi)活性氧增加的同時也伴隨著線粒體內(nèi)活性氧的增加。為研究UV照射對HaCaT細(xì)胞線粒體的損傷和咖啡因的保護(hù)作用，采用MitoSOX Red熒光染色檢測線粒體內(nèi)活性氧的含量。圖3顯示，與處理1相比，處理2 HaCaT細(xì)胞線粒體內(nèi)活性氧含量顯著增加(P<0.01)；而與處理2相比，處理3線粒體內(nèi)活性氧含量有下降趨勢，處理4線粒體內(nèi)活性氧含量極顯著降低(P<0.01)。表明咖啡因處理具有減少UV誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞線粒體內(nèi)活性氧積累的作用。

2.4 咖啡因?qū)V照射后HaCaT細(xì)胞內(nèi)SIRT3/MAPKs通路的影響

為明確咖啡因?qū)V誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)機(jī)制，采用Western blot評價了咖啡因?qū)V誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激重要信號通路的影響。結(jié)果如圖4所示，咖啡因能夠顯著降低UV照射引起的MAPKs的磷酸化水平升高，同時顯著上調(diào)SIRT3的蛋白表達(dá)水平。與處理1相比，處理2的HaCaT細(xì)胞經(jīng)過紫外線照射后，p-p38、p-ERK、p-JNK的磷酸化水平均有極顯著或高度顯著升高(P<0.01或P<0.001)；而與處理2相比，處理3和處理4的細(xì)胞內(nèi)p-p38、p-JNK、p-ERK蛋白表達(dá)顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

MMP9是降解細(xì)胞外基質(zhì)成分如彈性纖維等的重要蛋白酶。與處理1相比，處理2 HaCaT細(xì)胞內(nèi)MMP9蛋白的表達(dá)水平極顯著增加(P<0.01)；而與處理2相比，處理3和處理4的細(xì)胞內(nèi)MMP9蛋白顯著下降(P<0.05)。

SIRT3是線粒體抗氧化相關(guān)信號通路的重要調(diào)節(jié)蛋白。實(shí)驗(yàn)顯示，與處理1相比，處理2 HaCaT細(xì)胞內(nèi)SIRT3蛋白表達(dá)極顯著降低(P<0.01)，Acetyl-p53蛋白高度顯著增加(P<0.001)。與處理2相比，處理3和處理4的細(xì)胞內(nèi)SIRT3蛋白表達(dá)極顯著增加(P<0.01)；與處理2相比，Acetyl-p53蛋白表達(dá)水平處理3顯著降低(P<0.05)、處理4高度顯著降低(P<0.001)。據(jù)此表明，咖啡因可通過影響SIRT3/MAPKs信號通路，對UV誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷起保護(hù)作用。

3 討 論

長期過量的日光照射是引起多種皮膚疾病的基本原因，也是誘發(fā)多種惡性或良性腫瘤的重要因素之一。研究表明日光中UVB引起的表皮細(xì)胞損傷與氧化應(yīng)激有關(guān)，當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時會引起HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和積累，導(dǎo)致皮膚外觀損傷甚至皮膚病[26]。過多的ROS是導(dǎo)致氧化損傷的主要原因，它可以直接或間接作用于細(xì)胞內(nèi)的大分子或細(xì)胞器致使細(xì)胞損傷[27-28]。

通過UV照射HaCaT細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型。結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，UV照射能降低HaCaT細(xì)胞的存活率。在UV照射前1 h對HaCaT細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，考察不同濃度的咖啡因?qū)V誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，咖啡因能增加UV照射后HaCaT細(xì)胞的存活率。

正常生理情況下，活性氧的含量與機(jī)體抗氧化能力處于平衡，但在UV刺激狀態(tài)下，HaCaT細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)被打破，細(xì)胞質(zhì)和線粒體內(nèi)活性氧含量增加，引起氧化損傷。通過實(shí)驗(yàn)顯示，咖啡因可降低HaCaT細(xì)胞內(nèi)和線粒體中活性氧的積累，顯現(xiàn)咖啡因可在通過減少細(xì)胞內(nèi)ROS的積累、緩解氧化應(yīng)激增強(qiáng)細(xì)胞的存活率起到對UV誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，這對咖啡因在皮膚抗氧化產(chǎn)品中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

活性氧在細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程中具有重要作用，正常狀態(tài)下活性氧可以促進(jìn)細(xì)胞增殖更新，而氧化應(yīng)激狀態(tài)下，過多的活性氧使胞內(nèi)許多大分子物質(zhì)發(fā)生過氧化，激活下游信號通路造成細(xì)胞損傷[29-31]。已有研究表明，咖啡因能夠通過調(diào)節(jié)SIRT3/MAPK信號通路，緩解APPH誘導(dǎo)的氧化損傷[15]。為了探究咖啡因?qū)V誘導(dǎo)的氧化損傷的作用機(jī)制，通過蛋白質(zhì)免疫印跡檢測了MAPKs通路中p-p38、p-JNK以及p-ERK的磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紫外線照射后，處理2的HaCaT細(xì)胞內(nèi)MAPKs(p-p38、p-JNK和p-ERK)的磷酸化水平升高；使用不同濃度的咖啡因?qū)?xì)胞進(jìn)行處理后，p-p38、p-JNK和p-ERK蛋白表達(dá)降低，說明咖啡因?qū)V誘導(dǎo)的HaCaT氧化損傷的保護(hù)作用是通過降低MAPKs的磷酸化完成的。同時，UV照射會引起HaCaT細(xì)胞線粒體內(nèi)SIRT3蛋白的表達(dá)降低，Acetyl-p53蛋白增加；處理3和處理4的細(xì)胞內(nèi)SIRT3蛋白表達(dá)高于處理1，Acetyl-p53蛋白表達(dá)水平則降低。此外，與處理2相比，處理3和處理4的HaCaT細(xì)胞中，MMP9的蛋白表達(dá)水平降低。這些結(jié)果表明，咖啡因可以影響氧化應(yīng)激過程中SIRT3/MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而對UV照射的HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。

4 結(jié) 論

咖啡因可以保護(hù)UV誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞，減少其氧化損傷，這是通過調(diào)節(jié)SIRT3/MAPKs/ROS途徑完成的。該研究結(jié)果為含咖啡因的植物資源的綜合開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為咖啡因通過抗氧化機(jī)制來緩解UV誘導(dǎo)的損傷奠定了理論基礎(chǔ)。