2-DG抑制糖酵解和線粒體自噬調(diào)控M1型巨噬細胞極化*

藍春花，陳成英，藍 利，2，王新航，2，常升搏小吉，2，袁江浪，孔星星，陸彩玲，李習(xí)藝，唐 深，2△

（廣西醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2.廣西高?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)研究重點實驗室；3.公共衛(wèi)生學(xué)院，南寧 530021）

2-脫氧-d-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）是一種葡萄糖類似物，可用作葡萄糖代謝的競爭性抑制劑，通過影響細胞的糖代謝發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞分化及周期等生物學(xué)作用[1-2]，具有抗炎、抗腫瘤等作用。有研究報道，2-DG和脂多糖（LPS）共刺激小鼠腹腔巨噬細胞，抑制己糖激酶（HK）的活性和下調(diào)M1分化過程中糖酵解信號通路Glut1 的質(zhì)子產(chǎn)生率，減少促炎因子的分泌[3]。

巨噬細胞是介導(dǎo)炎癥的關(guān)鍵細胞，通過趨化聚集在不同的炎癥微環(huán)境中，產(chǎn)生高度可塑性并極化誘導(dǎo)適宜的免疫反應(yīng)有效調(diào)控炎癥[4]。巨噬細胞極化是一個M1和M2雙向的復(fù)雜過程，受多種因素調(diào)控，巨噬細胞功能狀態(tài)與其代謝譜密切相關(guān)，如M1型巨噬細胞代謝主要以無氧糖酵解和磷酸戊糖途徑為主，這利于M1型巨噬細胞清除細菌感染[5]。線粒體是細胞內(nèi)有氧供能的主要細胞器，可調(diào)控細胞多種生理活動，其數(shù)量和功能失調(diào)會導(dǎo)致細胞內(nèi)異常的線粒體累積和活性氧（ROS）生成增加，誘導(dǎo)細胞凋亡和壞死[6]；線粒體自噬是細胞清除損傷線粒體，維持線粒體正常功能的主要途徑[7]。文獻報道，2-DG可誘導(dǎo)細胞自噬從而抑制嗜肺軍團菌的生長，有助于提高小鼠巨噬細胞抗嗜肺炎菌感染的保護作用[8]。上述研究提示2-DG 發(fā)揮抗炎作用的機制可能是調(diào)節(jié)巨噬細胞的炎癥極化，但具體分子機制仍未明確。本研究以人髓系白血病單核細胞（THP-1）構(gòu)建體外M1 型巨噬細胞極化模型，初步探討2-DG 通過糖酵解和線粒體自噬調(diào)控M1 型巨噬細胞炎癥極化的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 人急性單核細胞白血病細胞系THP-1細胞（中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫）。2-DG（中國MCE）；佛波酯（PMA，美國Sigma）；干擾素（IFN）-γ（北京Sino-Biological）；RPMI1640 培養(yǎng)液、胎牛血清（美國Gibco）；青霉素、鏈霉素、LPS、丙酮酸激酶（PK）、HK、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（索萊寶生物技術(shù)）；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑、TRIzol（日本TaKaRa）；實時熒光定量PCR（qPCR）引物由Invitrogen 公司合成；SYBR?Green Master（美國Roche）；蛋白裂解液、兔抗人微管蛋白（Tubulin）單克隆抗體購自碧云天公司；鼠抗人自噬啟動蛋白Beclin-1 抗體、PTEN 誘導(dǎo)激酶1（PINK1）抗體購自Santa Cruz 公司；HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組 THP-1 細胞用含10%胎牛血清、100 μg/mL 鏈霉素、100 IU/mL 青霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。按1×106個/孔的細胞密度接種于6 孔板，分為3 組：M0 組（100 nmol/L PMA 刺激48 h 極化為M0 型）、M1 組（M0 組基礎(chǔ)上用10 ng/mL LPS 和20 ng/mL IFN-γ共刺激48 h誘導(dǎo)極化為M1型）、M1+2-DG組（M1組基礎(chǔ)上加入10 mmol/L 2-DG）。

1.3 qPCR法檢測M1型極化相關(guān)基因表達 TRIzol提取細胞總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用Step One熒光定量PCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火10 s，共40 個循環(huán)。引物序列如下：β-actin 上游：5’-TCCTCTCCCAAGTCCACACAGG-3，下游：5’-GGGCACGAAGGCTC ATCATTC-3’；白介素（IL）-6 上游：5’-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3’，下游：5’-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3’；腫瘤壞死因子（TNF）-α上游：5’-GAGGCCAAGCCCTGGTATG-3’，下游：5’-CGGGCCGATTGATCTCAGC-3’；環(huán)氧化酶（COX）-2 上游：5’-GCCATGGGGTGGACTTAAATCATA-3’，下游：5’-CAGGGACTTGAGGAGGGTAGATCA-3’；CXC 趨化因子配體10（CXCL-10）上游：5’-TCTCCCATCACTTCCCTACA-3’，下游：5’-CAGGGTCAGAACATCCACTA-3’。以β-actin 為內(nèi)參，采用2－△△Ct法計算目的基因相對表達量。

1.4 巨噬細胞內(nèi)糖酵解相關(guān)酶（PK、HK、LDH）活性 檢測棄去培養(yǎng)基后用預(yù)冷的PBS緩沖液洗2遍，每孔加入200 μL HK（PK或LDH）提取液，將細胞刮下并收集于1.5 mL EP 管內(nèi)，在冰浴條件下超聲裂解細胞，4 ℃離心10 min，取上清液。按照試劑說明書檢測PK、HK和LDH活性，酶標(biāo)儀檢測吸光值。

1.5 巨噬細胞溶酶體、線粒體熒光信號強度檢測按上述實驗分組，每組設(shè)6個復(fù)孔，極化完成后棄上清，加入100 μL/孔熒光探針工作液，置于細胞培養(yǎng)箱 孵育30 min，PBS 洗3 次，加入100 μL/孔Hank’s 溶液，熒光酶標(biāo)儀檢測熒光信號強度（溶酶體熒光信號：激發(fā)光525 nm，發(fā)射光590 nm；線粒體熒光信號：激發(fā)光490 nm，發(fā)射光535 nm）。

1.6 Western blotting 法檢測巨噬細胞線粒體自噬相關(guān)蛋白表達 提取細胞總蛋白，BCA 法蛋白定量；SDS-PAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h；一抗置于4 ℃冰箱孵育過夜：Tubulin（1∶2 000）、Beclin-1（1∶1 000）、PINK1（1∶1 000），TBST 洗膜3 次；二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜3次；暗室中電化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色，凝膠成像系統(tǒng)中曝光。Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.7 細胞內(nèi)ROS 檢測 按上述實驗分組，每組設(shè)6 個復(fù)孔，同時設(shè)置陽性對照組（陽性對照試劑為Rosup，于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)處理25 min）；極化完后用PBS 洗3 次，加入DCFH-DA 工作液100 μL/孔，置于細胞培養(yǎng)孵育20 min；PBS洗3次，加入100 μL/孔Hank’s 溶液，熒光酶標(biāo)儀檢測熒光信號強度（激發(fā)光490 nm，發(fā)射光535 nm）。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSDt檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2-DG 對M1 型巨噬細胞極化相關(guān)基因表達的影響 與M0 組相比，M1 組TNF-α、IL-6、CXCL-10和COX-2 mRNA表達升高（均P＜0.01）；與M1組相比，M1+2-DG 組TNF-α、IL-6、CXCL-10 和COX-2 mRNA表達降低（均P＜0.05），見圖1。

圖1 3 組TNF-α、COX-2、IL-6、CXCL-10 mRNA 表達水平比較

2.2 2-DG 對M1 型巨噬細胞糖酵解相關(guān)酶活性的影響 與M0 組相比，M1 組PK、HK 和LDH 活性增加（均P＜0.01），與M1組相比，M1+2-DG組PK、HK和LDH活性降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖2。

2.3 2-DG 對M1 型巨噬細胞極化過程中線粒體和溶酶體熒光信號的影響 與M0 組相比，M1 組溶酶體的熒光信號增強，線粒體熒光信號減弱（P＜0.01）；與M1組相比，M1+2-DG組溶酶體熒光減弱，線粒體熒光增強（P＜0.01），見圖3。

2.4 2-DG 對M1 型巨噬細胞極化過程中線粒體自噬相關(guān)蛋白表達和胞內(nèi)ROS 的影響 與M0 組相比，M1 組胞內(nèi)ROS 升高，自噬啟動蛋白Beclin-1 表達升高，線粒體自噬啟動蛋白PINK1的表達也升高（P＜0.05）；與M1 組相比，M1+2-DG 組胞內(nèi)的ROS降低，Beclin-1 和PINK1 表達均下降（P＜0.05），見圖4。

圖2 3組巨噬細胞內(nèi)糖酵解相關(guān)酶活性比較

圖3 3組巨噬細胞內(nèi)溶酶體和線粒體熒光強度的比較

圖4 3組巨噬細胞胞內(nèi)ROS產(chǎn)生及線粒體自噬蛋白表達的比較

3 討論

巨噬細胞是先天免疫系統(tǒng)中最重要的免疫細胞，負責(zé)殺傷清除入侵機體的病原體，啟動炎癥、清除損傷組織和炎癥恢復(fù)的組織修復(fù)。巨噬細胞具有高度可塑性，通過在不同免疫微環(huán)境中極化為不同的活化亞群，主要為經(jīng)典激活的M1 型和交替激活的M2型巨噬細胞，由M1執(zhí)行殺傷，而M2執(zhí)行免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)功能。二者在執(zhí)行各自特定的功能時均需巨大的能量支持，糖酵解和氧化磷酸化是免疫細胞在免疫應(yīng)答中產(chǎn)生ATP 的重要代謝途徑。線粒體是真核生物細胞內(nèi)氧化磷酸化供能最重要的場所，對免疫細胞的分化有重要的調(diào)控作用[3,9]。

在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的小鼠模型中，2-DG可顯著減輕小鼠肺組織病理損傷，降低促炎因子TNF-α、IL-1β、NLRP3 的基因表達水平[10]。本研究中2-DG 可降低M1型巨噬細胞極化相關(guān)基因IL-6、TNF-α、CXCL-10 和COX-2 的mRNA 表達（均P＜0.05），提示2-DG能降低M1型巨噬細胞促炎性因子的表達。有研究報道，2-DG對人血單核細胞來源的巨噬細胞進行預(yù)處理后，堿性磷酸鈣(BCP)誘導(dǎo)的CXCL-9、CXCL-10、CD40、CD80 和CD86 的表面標(biāo)記表達顯著降低，提示2-DG 可抑制BCP 誘導(dǎo)巨噬細胞的促炎作用[11]，這與本研究結(jié)果相似。巨噬細胞極化時，通過糖代謝重新編程以滿足不同免疫應(yīng)答微環(huán)境的需求，適應(yīng)感染和腫瘤等不同性質(zhì)的炎癥中免疫反應(yīng)過程[12]。在LPS或IL-12刺激下，極化的巨噬細胞代謝主要以無氧糖酵解途徑為主[13]。本研究結(jié)果顯示，巨噬細胞在LPS和IFN-γ刺激下，由M0型極化為M1型后，糖酵解關(guān)鍵酶HK、PK、LDH活性均增加（均P＜0.05），提示細胞內(nèi)糖酵解水平增加。2-DG 是糖酵解抑制劑，可被HK 磷酸化為2-DG-磷酸，該產(chǎn)物不能進一步代謝，累積的2-DG-磷酸可抑制細胞糖酵解[14]。本實驗結(jié)果顯示2-DG 處理可以抑制M1型巨噬細胞HK、PK和LDH活性，降低M1型巨噬細胞的糖酵解水平，抑制M1型極化基因IL-6、TNF-α、CXCL-10、COX-2基因表達水平（均P＜0.05），這可能是2-DG抑制細胞糖酵解，改變M1型巨噬細胞代謝重編程，負調(diào)節(jié)M1 極化的重要途徑。

線粒體是機體免疫應(yīng)答的關(guān)鍵角色，在調(diào)控巨噬細胞的功能和表型方面起到重要的作用。線粒體熒光探針是一類活細胞內(nèi)線粒體特異性熒光染料，溶酶體探針是一種帶有弱堿性的熒光探針，可以選擇性滯留在偏酸性的胞內(nèi)溶酶體中，特異性標(biāo)記溶酶體；二者分別能監(jiān)測巨噬細胞內(nèi)溶酶體和線粒體活性及數(shù)量的動態(tài)變化，線粒體自噬是細胞自噬中的一種選擇性自噬，可在一系列受體和適配器分子的調(diào)控下，對功能性損傷線粒體進行快速協(xié)調(diào)的清除，主要包括PINK1/Parkin 和線粒體外膜受體介導(dǎo)的線粒體自噬[15]。文獻報道小鼠巨噬細胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)分化通過Toll樣受體4激活PI3K/AKT/NFκB通路產(chǎn)生大量ROS，進而誘導(dǎo)細胞內(nèi)自噬及線粒體自噬的發(fā)生[16]。本研究結(jié)果顯示，M0 極化為M1型時，細胞ROS升高，線粒體數(shù)量減少，溶酶體增多（均P＜0.05），可能是M1極化過程中胞內(nèi)ROS引起線粒體損傷，溶酶體融合受損線粒體數(shù)量增多，同時檢測到M1 極化過程中線粒體自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、PINK1 的表達明顯升高（均P＜0.05），提示LPS和IFN-γ誘導(dǎo)的M1巨噬細胞代謝重編程后，糖酵解增強，伴隨細胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，功能性損傷線粒體增多，線粒體定位蛋白PINK1聚集在線粒體外膜上募集Pakin進行泛素化增加[17-18]，伴隨著自噬特異性Ⅲ類磷脂酰肌醇-3激酶復(fù)合物中的Beclin-1增加[19]，進一步促進損傷線粒體與自噬體結(jié)合，最終導(dǎo)致線粒體自噬水平增加，細胞內(nèi)線粒體數(shù)量明顯降低，巨噬細胞向M1型極化，啟動炎癥反應(yīng)。文獻報道在敲除轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2(TG2)的小鼠胚胎成纖維細胞和人胚胎腎細胞中，2-DG可以抑制細胞糖酵解活性，緩解羰基氰化物間氯苯腙誘導(dǎo)受損線粒體在細胞累積，促進細胞線粒體自噬[20]。這與本實驗研究模型不同，2-DG 干預(yù)LPS 和IFN-γ 誘導(dǎo)的M1型極化巨噬細胞后線粒體自噬蛋白Beclin-1 和PINK1 表達明顯降低，抑制M1 型極化過程中線粒體自噬（均P＜0.05）。以上結(jié)果表明2-DG 在不同的細胞模型中對線粒體自噬的調(diào)控不同，提示2-DG對線粒體自噬可能存在多種調(diào)控方式。研究發(fā)現(xiàn)受損的線粒體功能失調(diào)會產(chǎn)生大量ROS，過量的ROS 可以啟動線粒體自噬[18]。2-DG 可以激活A(yù)MPK 降低球形脂聯(lián)素誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞細胞系RAW 264.7細胞mTOR磷酸化，降低細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生[21]。結(jié)合本研究結(jié)果，提示2-DG可能通過抑制細胞內(nèi)糖酵解，降低LPS和IFN-γ誘導(dǎo)的M1極化過程產(chǎn)生的大量ROS，減輕線粒體的損傷，與溶酶體融合的受損線粒體減少，從而降低線粒體自噬水平，抑制M1型巨噬細胞的炎癥極化，防止過度極化造成的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，2-DG通過抑制M1型巨噬細胞糖酵解水平，引起細胞體內(nèi)代謝發(fā)生重編程，減少ROS生成，減輕線粒體的損傷，降低細胞線粒體自噬水平，抑制促炎性因子分泌，負調(diào)控M1型巨噬細胞炎癥極化，本研究為2-DG 作為新免疫調(diào)節(jié)劑治療炎癥性疾病和腫瘤提供新的理論依據(jù)。