紫杉醇對FLT3-ITD突變陽性急性髓系白血病細(xì)胞株MOLM-13增殖與凋亡的影響*

粟燕云，吳梅青，劉振芳，周寶文，白子文，龐如利，趙衛(wèi)華

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，南寧 530021）

急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia,AML)是一類起源于造血干細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，具有高度異質(zhì)性[1]。FLT3-ITD突變陽性AML患者的發(fā)生率高達(dá)30%[2]，且預(yù)后差，復(fù)發(fā)率高[3]。以FLT3為靶點(diǎn)的小分子抑制劑雖可達(dá)到完全緩解，但是FLT3 二次突變引發(fā)的獲得性耐藥易導(dǎo)致復(fù)發(fā)。因此，有必要為FLT3-ITD 突變陽性的AML 患者探尋更為經(jīng)濟(jì)有效的藥物。紫杉醇是一種具有獨(dú)特抗癌特性的化療藥物，可通過不同途徑誘導(dǎo)多種白血病細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是目前最有效的天然抗癌藥物之一[4]。但紫杉醇對FLT3-ITD 突變陽性AML 細(xì)胞株MOLM-13 是否具有抑制作用目前尚不清楚。因此，本研究旨在探討紫杉醇對FLT3-ITD突變陽性AML細(xì)胞株MOLM-13增殖與凋亡的影響，并初步探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物及主要試劑 AML細(xì)胞株MOLM-13 購自南京科佰生物科技有限公司。紫杉醇購自上海源葉生物科技有限公司。CCK8試劑盒購自日本同仁公司；凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；逆轉(zhuǎn)錄、RT-PCR試劑盒均購自大連Takara公司。引物由生工合成?？笰KT 抗體（4691）、抗磷酸化（p-）AKT抗體（4060）均購自CST 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) MOLM-13 細(xì)胞株生長于含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d 更換一次培養(yǎng)基。取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8 法檢測細(xì)胞活性 實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組（0 nmol/L紫杉醇）和不同濃度（2 nmol/L、4 nmol/L、6 nmol/L、8 nmol/L、10 nmol/L）紫杉醇組，每組設(shè)3個復(fù)孔。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，將細(xì)胞以2×105個/mL 密度接種至96 孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后加入10 μL的CCK-8溶液，孵育1～4 h，酶標(biāo)儀測定各孔450 nm處的吸光度(OD)值，取平均值，按以下公式計算細(xì)胞抑制率：抑制率=［（陰性對照孔OD 值－實(shí)驗(yàn)孔OD 值）/（陰性對照孔OD 值－空白孔OD 值）］×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，用Graphpad prism 8軟件計算IC50。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組（0 nmol/L紫杉醇）和不同濃度（2 nmol/L、4 nmol/L、8 nmol/L）紫杉醇組，干預(yù)48 h后，收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞，用1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞，混勻后，取200 μL細(xì)胞懸液加到流式管中，加入5 μL Annexin V，室溫下避光孵育15 min；加入5 μL PI 以及300 μL 1×Binding Buffer，混勻，5 min內(nèi)上機(jī)檢測。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）法檢測FLT3、PI3K、AKT、mTOR 基因表達(dá) 實(shí)驗(yàn)設(shè)對照組（0 nmol/L 紫杉醇）和10 nmol/L、20 nmol/L 紫杉醇組，干預(yù)48 h 后，采用Trizol 法提取各組細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2－ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。引物序列如下：GAPDH 上游：5’-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3’，下游：5’-TAAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3’?；FLT3 上游：5’-GCAATCATAAGCACCAGCCAGGAG-3’，下游：5’-TTCTGCGAGCACTTGAGGTTTCC-3’；PI3K 上游：5’-CTTTGCGACAAGACTGCCGAGAG-3’，下游：5’-CGCCTGAAGCTGAGCAACATCC-3’；AKT 上游：5’-ATGGAGTATGCCAACGGGGG-3’，下游：5’-TGTCGCGGTATACCACGTCC-3’；mTOR上游：5’-CTTGCTGAACTGGAGGCTGATGG-3’，下游：5’-CCGTTTTCTTATGGGCTGGCTCTC-3’。

1.6 Western blotting 法檢測AKT 和p-AKT 蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組同“1.5”，處理48 h后，收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS 洗滌細(xì)胞2 次，加入適量蛋白裂解液提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，加入適量蛋白上樣緩沖液并進(jìn)行蛋白變性；采用SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%封閉液封閉1 h；加入相應(yīng)一抗GAPDH（1∶10 000）、AKT（1∶1 000）、p-AKT（1∶1 000），4 ℃冰箱孵育過夜；加入二抗（1∶2 000）室溫下孵育1 h；ECL 顯影曝光。以GAPDH 為內(nèi)參，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值為目的蛋白表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫杉醇對MOLM-13細(xì)胞增殖的影響 隨著藥物濃度的增加以及作用時間的延長，紫杉醇對細(xì)胞的增殖抑制作用在一定范圍內(nèi)逐漸增強(qiáng)，見圖1。作用24 h、48 h、72 h 的IC50分別為14.19 nmol/L、4.73 nmol/L、3.39 nmol/L。

圖1 不同濃度紫杉醇作用不同時間對MOLM-13細(xì)胞增殖的影響

2.2 紫杉醇對MOLM-13細(xì)胞凋亡的影響 不同濃度紫杉醇（2 nmol/L、4 nmol/L、8 nmol/L）分別作用于MOLM-13 細(xì)胞48 h，其凋亡率分別為（24.63±1.02）%、（32.73±0.55）%、（63.2±0.87）%，其中濃度為4 nmol/L、8 nmol/L 的紫杉醇組凋亡率，與對照組（0 nmol/L 紫杉醇）相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見圖2。

2.3 紫杉醇對MOLM-13 細(xì)胞FLT3、PI3K/AKT/mTOR 通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響 10 nmol/L、20 nmol/L 紫杉醇分別作用于MOLM-13 細(xì)胞48 h，結(jié)果顯示：紫杉醇組FLT3、PI3K、AKT、mTOR mRNA相對表達(dá)量及p-AKT、AKT蛋白表達(dá)量顯著降低，與對照組（0 nmol/L紫杉醇）相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖3。

圖2 不同濃度紫杉醇作用48 h對MOLM-13細(xì)胞凋亡的影響

圖3 紫杉醇對MOLM-13細(xì)胞FLT3、PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響

3 討論

近年來，對于AML 的治療有所進(jìn)展，但是FLT3-ITD 突變陽性AML 患者的復(fù)發(fā)率仍較高，生存期短[5]。而針對FLT3 的小分子酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)的單藥治療臨床效應(yīng)小，可能是劑量毒性限制了其對FLT3 的抑制作用[6]。此外，大多數(shù)FLT3-ITD 突變陽性的AML 患者會很快復(fù)發(fā)[7-8]，小部分患者則由于FLT3繼發(fā)性TKD突變而發(fā)生獲得性耐藥[9]，故FLT3抑制劑難以滿足臨床需求,有必要為FLT3-ITD突變陽性的AML患者探尋更為經(jīng)濟(jì)有效的藥物。

紫杉醇是一種有效的抗癌藥物，主要通過促進(jìn)微管聚合，穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)，妨礙紡錘體形成，抑制細(xì)胞有絲分裂，將細(xì)胞阻滯在G2/M 期而發(fā)揮其抗癌作用，被廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤的治療，包括白血病[10]。近年來研究表明，除了上述抗癌機(jī)制，紫杉醇還可通過不同的途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，例如，通過激活JNK 信號通路，提高caspase-3、caspase-9 的活性進(jìn)而促進(jìn)白血病細(xì)胞株K562、U937 細(xì)胞凋亡[11-12]。本研究首次發(fā)現(xiàn)紫杉醇對FLT3-ITD突變陽性的AML 細(xì)胞株MOLM-13 也具有一定的增殖抑制作用，且呈典型的濃度、時間依賴性，作用24 h、48 h、72 h 的IC50分別為14.41 nmol/L、5.65 nmol/L、3.92 nmol/L。此外，紫杉醇還能誘導(dǎo)MOLM-13 細(xì)胞發(fā)生凋亡，作用48 h的凋亡率高達(dá)（63.2±0.87）%，明顯高于對照組（P＜0.01）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示紫杉醇對MOLM-13細(xì)胞株具有一定的抑制作用。

突變基因FLT3-ITD所編碼的FLT3受體能夠在非配體依賴性的情況下持續(xù)性自動磷酸化，異常激活下游多種與細(xì)胞的生存、增殖、凋亡等生物學(xué)特性相關(guān)的信號通路，如PI3K/AKT、MAPK、STAT5等，從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[13-15]。因此FLT3是一個較好的治療靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇不僅能在一定程度上抑制FLT3基因的表達(dá)，還能下調(diào)PI3K/AKT/mTOR 信號通路相關(guān)基因PI3K、AKT、mTOR 及AKT、p-AKT 蛋白的表達(dá)。其中，AKT 激酶是PI3K 最重要的底物，活化的AKT 既能夠使促凋亡蛋白Bad和caspase-9發(fā)生磷酸化失活，亦可磷酸化激活I(lǐng)κB激酶(IKK)，間接活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，然后啟動一系列抗凋亡基因的表達(dá),發(fā)揮其抗凋亡作用[16]。因此，筆者推測，紫杉醇對MOLM-13細(xì)胞的抑制作用可能與其下調(diào)FLT3基因的表達(dá)和抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的活性有關(guān)。但是，紫杉醇具體是否是通過抑制FLT3基因的表達(dá)進(jìn)而抑制其下游PI3K/AKT/mTOR信號通路的活性尚需要進(jìn)一步的研究。值得一提的是，以往的研究表明，約有50%～70%的AML 患者存在PI3K/AKT/mTOR信號通路的持續(xù)性異常激活[17]，并且與FLT3抑制劑索拉非尼耐藥密切相關(guān)，而抑制該通路的活性能夠誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞凋亡并抑制其克隆形成[18]。因此，結(jié)合上述研究結(jié)果，本組進(jìn)一步猜測將低劑量紫杉醇與索拉非尼聯(lián)合作用于MOLM-13細(xì)胞可能具有更好的抑制作用。

綜上，紫杉醇對FLT3-ITD 突變陽性的AML 細(xì)胞株MOLM-13具有明顯的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，其機(jī)制可能與下調(diào)FLT3 基因的表達(dá)，抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路的活性有關(guān)，本研究為將紫杉醇用于AML 患者的治療提供一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。