HMGB1介導(dǎo)線粒體自噬參與糖尿病小鼠心肌缺血/再灌注損傷*

吳云嬌，黃 鋒，盧創(chuàng)宏，吳曉丹，曾志羽

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.心血管內(nèi)科；2.廣西心腦血管疾病防治精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.廣西心腦血管疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，南寧 530021）

心血管疾?。–VD）在我國的發(fā)病率和病死率不斷上升，每年約有300 萬人死于CVD，占中國死亡人數(shù)的40%[1]。缺血性心肌病（IHD）作為CVD的重要組成部分之一，已成為主要死亡原因之一。及時(shí)恢復(fù)血流進(jìn)行再灌注是治療心肌缺血的主要方式，然而隨之而來的再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致心肌發(fā)生功能紊亂和結(jié)構(gòu)損傷。糖尿病作為CVD 的主要獨(dú)立危險(xiǎn)因素，和非糖尿病人群相比，糖尿病患者發(fā)生IHD的患病率和風(fēng)險(xiǎn)均顯著升高[2]。中國更是全世界糖尿病患者最多的國家，2013年的調(diào)查顯示患病人數(shù)已達(dá)到1.14 億，約占總?cè)丝诘?1%[3]。而糖尿病讓心肌對(duì)缺血/再灌注（I/R）損傷的易損性增加[4]，糖尿病急性心梗患者接受再灌注治療后不良事件發(fā)生率較非糖尿病患者明顯增高[5]。

生理?xiàng)l件下，線粒體可被特異性包裹于自噬小體，經(jīng)溶酶體融合后降解、消化，即線粒體自噬，該途徑可消除受損或者過多的線粒體，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。然而過度的線粒體自噬會(huì)使得線粒體的絕對(duì)數(shù)量減少，進(jìn)而加劇細(xì)胞損傷[6]。缺血過程中增強(qiáng)的自噬往往起到保護(hù)作用，但在再灌注過程中過度的自噬會(huì)加重?fù)p傷[7]。高遷移率族蛋白1（HMGB1）對(duì)細(xì)胞自噬和線粒體自噬起重要調(diào)控作用[8-9]。HMGB1 參與糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展過程[10-11]，其通過與糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合，加重心肌損傷，在糖尿病I/R后心肌重塑中起重要作用[12]。因此，本研究通過使用HMGB1 中和抗體干預(yù)糖尿病心肌I/R 小鼠，觀察小鼠心肌組織中線粒體自噬水平，探索HMGB1 是否通過線粒體自噬途徑參與糖尿病小鼠I/R損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 雄性db/db 小鼠43 只，7 周齡，體重35～40 g，購于江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。MiniVent 845 型動(dòng)物呼吸機(jī)（Harvard 公司，美國）；HMGB1中和抗體及Ig-Y空載抗體（Shino test公司，日本）；阿佛?。暇圬惿锟萍加邢薰?，中國）；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液（Sigma 公司，美國)；伊文思藍(lán)（Evans blue）溶液（Sigma 公司，美國）；HMGB1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)試劑盒（IBL公司，美國）；肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）ELISA試劑盒（武漢華美，中國）；乳酸脫氫酶（LDH）ELISA 試劑盒（武漢華美，中國）；RIPA裂解液、BCA 試劑盒、4×上樣緩沖液（Solarbio 公司，中國）；兔抗HMGB1單克隆抗體（#HM-901）購于美國IBL 公司；兔抗LC3B 多克隆抗體(#ab51520)、兔抗P62單克隆抗體（#ab240635）、山羊抗兔IgG H&L（HRP）（#ab6721）均購于美國Abcam公司；兔抗GAPDH 多克隆抗體（#10494-1-AP）購于中國Proteintech 公司；兔抗HSP60 單克隆抗體（#GB11243）、Alexa Fluor488 標(biāo)記山羊抗兔（HRP）IgG（#GB25303）、CY3 標(biāo)記山羊抗兔（HRP）Ig G（#GB23303）均購于中國servicebio公司。

1.2 心肌I/R 小鼠模型的建立 用1.25%阿佛?。?40 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，固定于小動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，行氣管插管，連接呼吸機(jī)（潮氣量250 mL/min；呼吸頻率120次/min）。酒精消毒后，沿小鼠左側(cè)胸大肌下緣作一斜向上的斜行皮膚切口，逐層鈍性分離肌層，暴露肋間隙。在第4 或第5 肋間隙處打開胸腔，開胸器固定后，剝離心包膜充分暴露左心耳及左心室。在左心耳下緣約2 mm處，用7-0無損傷縫合針線穿過心肌表層，于肺動(dòng)脈圓錐附近出針，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）缺血30 min 后，松開結(jié)扎線恢復(fù)血流再灌注3 h。左室前壁心肌顏色變蒼白或紫紺，心電圖顯示ST段弓背向上抬高視為缺血成功；開放LAD后左室前壁心肌顏色逐漸恢復(fù)紅色視為再灌注成功。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 將40 只雄性db/db 小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。另取3只雄性db/db小鼠加入假手術(shù)－生理鹽水（Sham-NC）組。（1）假手術(shù)－空載抗體（Sham-G）組：只穿線不結(jié)扎LAD，1 h后尾靜脈注射Ig-Y 空載抗體（2 mg/kg）；（2）假手術(shù)－中和抗體（Sham-A）組：只穿線不結(jié)扎LAD，1 h后尾靜脈注射HMGB1 中和抗體（2 mg/kg）；（3）I/R-A 組：心肌缺血30 min后恢復(fù)血流灌注30 min時(shí)，尾靜脈注射HMGB1 中和抗體（2 mg/kg），繼續(xù)灌注至3 h；（4）I/R-G 組：心肌缺血30 min 后恢復(fù)血流灌注30 min 時(shí)，尾靜脈注射Ig-Y 空載抗體（2 mg/kg），繼續(xù)灌注至3 h；（5）Sham-NC組：只穿線不結(jié)扎LAD，1 h后尾靜脈注射生理鹽水（2 mg/kg）

1.4 Evans blue-TTC 雙重染色法檢測(cè)心肌梗死面積 再灌注3 h 后，深度過量麻醉小鼠，打開胸腔，再次原位結(jié)扎小鼠LAD，經(jīng)主動(dòng)脈逆行注射Evans blue 溶液約0.75 mL，取出心臟，置于-20 ℃冰箱中冷凍30 min，心臟變硬后，自心尖處連續(xù)橫切厚度1 mm的切片（共5片），PBS清洗，放入1%TTC溶液中，37 ℃避光水浴15 min。染色成功后，用4%多聚甲醛溶液固定切片24 h。拍照，用Image J軟件分析染色面積。TTC 染色為紅色（梗死邊緣區(qū)）和白色（梗死區(qū)）的區(qū)域?yàn)槲ｋU(xiǎn)區(qū)（AAR），正常心肌經(jīng)Evans blue染色為深藍(lán)色。計(jì)算梗死區(qū)面積占AAR面積的百分比。

1.5 血漿HMGB1、LDH 水平檢測(cè) 再灌注3 h 后，再次麻醉小鼠，使用眼球采血法收集小鼠全血，置于1.5 mL 離心管中，室溫靜置15 min，4 ℃離心10 min后小心吸取上層血漿，采用ELISA法檢測(cè)血漿HMGB1、LDH 水平。檢測(cè)過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.6 免疫熒光法檢測(cè)線粒體自噬水平 取小鼠心前區(qū)心肌組織制作石蠟切片，PBS 洗滌，甩干后在3%雙氧水中室溫避光孵育約25 min封閉過氧化物酶；PBS 洗滌，滴入3%BSA 溶液，室溫下避光孵育約 30 min。加入LC3 一抗（1∶5 000），4°C 冰箱孵育過夜后加入對(duì)應(yīng)山羊抗兔HRP 二抗（1∶500），室溫孵育50 min，再于CY3-TSA孵育10 min。取出切片，放于EDTA抗原修復(fù)緩沖液（pH 8.0）中，置于微波爐內(nèi)中火8 min 后轉(zhuǎn)中低火7 min 進(jìn)行抗原熱修復(fù)。之后加入一抗HSP60（1∶800），4°C 冰箱孵育過夜后加入對(duì)應(yīng)山羊抗兔HRP二抗（1∶400）避光室溫孵育50 min。DAPI染核避光孵育10 min，PBS洗滌5 min，重復(fù)3次，滴加抗熒光猝滅封片液，蓋玻片封片，于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。可見呈點(diǎn)狀藍(lán)色的心肌細(xì)胞核和呈點(diǎn)狀綠色熒光的自噬泡以及呈紅色熒光的線粒體基質(zhì)蛋白。

1.7 Western blotting 法檢測(cè)HMGB1、LC3、P62 蛋白表達(dá) 將心前區(qū)心肌組織按100 mg/mL 加入RIPA 裂解液，于超聲破碎儀中勻漿3次，冰上裂解30 min，離心，吸取上清。使用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，加入4×上樣緩沖液，煮沸6 min 使蛋白變性。SDSPAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入一抗HMGB1、LC3、P62、GAPDH（均為1∶1 000）4 ℃冰箱孵育過夜，TBST 洗膜3 次，5 min/次；加入二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h。ECL顯色，F(xiàn)luorChem FC3 成像系統(tǒng)（Proteinsimple 公司，美國）顯影、拍照，Image J 軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值為目的蛋白表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血漿HMGB1水平比較 與Sham-G組比較，Sham-A 組血漿HMGB1 水平顯著降低（P＜0.05），I/R-A組、I/R-G組血漿HMGB1水平明顯升高（P＜0.05）；與I/R-G 組比較，I/R-A 組血漿HMGB1水平顯著降低（P＜0.05）；Sham-G 組與Sham-NC 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 各組小鼠血漿HMGB1水平比較

2.2 4組小鼠心肌梗死面積及血漿LDH水平比較與Sham-G 組比較，I/R-A 組、I/R-G 組小鼠心梗面積顯著增加（P＜0.05）；與I/R-G組比較，I/R-A組小鼠心肌梗面積顯著減少，血漿LDH水平顯著降低（均P＜0.05），見圖2。

2.3 4 組心肌HMGB1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62 蛋白表達(dá)量比較 與I/R-G 組比較，I/R-A 組心肌組織HMGB1蛋白表達(dá)量和LC3-II/I比值明顯降低，而P62蛋白表達(dá)量顯著升高（均P＜0.05），見圖3。

2.4 4 組心肌組織線粒體自噬情況 I/R-A 組心肌組織中HSP60與LC3的共定位熒光強(qiáng)度較I/R-G組明顯減弱，見圖4。

圖2 4組心肌梗死及血漿LDH水平比較

圖3 4組HMGB1、P62、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)量比較

圖4 4組心肌組織線粒體自噬情況

3 討論

CVD 是全球最主要的死亡原因[13]。急性心肌梗死（AMI）則是不論在發(fā)展中國家還是發(fā)達(dá)國家中都被認(rèn)為是CVD 發(fā)病率和死亡率的主要原因[14-15]。早期成功進(jìn)行溶栓治療或直接接經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）恢復(fù)缺血心肌的血流量是治療急性心梗的最有效策略。然而再灌注會(huì)對(duì)心肌造成額外的損傷和并發(fā)癥，是CVD治療的主要障礙[16-18]。糖尿病被認(rèn)為是AMI 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[19]。糖尿病患者心肌梗死后的發(fā)病率、死亡率和再梗死率遠(yuǎn)高于非糖尿病患者[20-21]。有研究認(rèn)為，糖尿病增加了心肌對(duì)I/R損傷的易感性[22]。糖尿病I/R損傷加重的機(jī)制尚不清楚，但繼發(fā)于高血糖的增加的氧化應(yīng)激可能起到重要作用。

有研究表明，糖尿病患者氧化應(yīng)激增加的原因主要是內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)產(chǎn)生和清除活性氧（ROS）之間的失衡，這種失衡的程度與I/R 損傷的程度密切相關(guān)[23]。增高的氧化應(yīng)激會(huì)損害線粒體能力代謝，導(dǎo)致線粒體功能障礙，而損傷的線粒體又會(huì)產(chǎn)生更多的ROS，產(chǎn)生惡性循環(huán)[24]。

線粒體自噬是一種選擇性自噬，可以清除細(xì)胞內(nèi)過多或損傷的線粒體。在心肌細(xì)胞中，線粒體自噬是否對(duì)應(yīng)激有保護(hù)作用一直存在爭(zhēng)議。有研究發(fā)現(xiàn)，無論是在由缺糖誘導(dǎo)的缺血心肌細(xì)胞系還是活體小鼠缺血模型中，自噬的減少會(huì)伴隨著心肌細(xì)胞存活率的下降以及心臟功能障礙，提示自噬有保護(hù)作用[8]。而在再灌注期間，自噬會(huì)進(jìn)一步加重。用3-甲基腺嘌呤或N-2-巰基丙酰甘氨酸、Beclin 基因敲除抑制自噬后，體外或體內(nèi)的I/R 心肌細(xì)胞存活率升高，心梗面積減少[25-26]。適度的自噬可以及時(shí)清除受損線粒體以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，而過度的自噬或者線粒體自噬發(fā)生缺陷會(huì)加重再灌注損傷。

HMGB1是一種染色質(zhì)相關(guān)的核蛋白和細(xì)胞外損傷相關(guān)模式分子（DAMP）?？蓮膲乃兰?xì)胞中被動(dòng)釋放，也可從激活的免疫細(xì)胞中主動(dòng)分泌至細(xì)胞外。作為促炎細(xì)胞因子在感染、損傷、炎癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[27]。HMGB1被證實(shí)在心肌I/R期間作為炎癥和細(xì)胞損傷的早期介質(zhì)來介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和器官損傷，加重了再灌注的損傷。MIRI模型中循環(huán)和心肌HMGB1 水平明顯增加，有助于再灌注期間梗死進(jìn)一步加重[28]。降低HMGB1表達(dá)或靶向缺失HMGB1 后，顯著減輕I/R 組織損傷，發(fā)揮保護(hù)作用[11,29]。此外，有研究表明，HMGB1 在促進(jìn)細(xì)胞自噬和線粒體自噬中作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，將氧化還原、生物能量學(xué)和新陳代謝與自噬調(diào)節(jié)聯(lián)系起來。靶向缺失HMGB1后自噬顯著下降[9]。HMGB1在糖尿病心肌病的發(fā)展中起著重要作用，持續(xù)激活促炎途徑和增強(qiáng)心肌損傷[11,30]。

目前研究認(rèn)為，糖尿病心肌I/R 和氧化應(yīng)激ROS 升高相關(guān)。這些機(jī)制大部分與線粒體障礙密切相關(guān)。糖尿病心臟病更是被有些學(xué)者認(rèn)為是線粒體疾[31-32]。而HMGB1 是線粒體自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，氧化還原誘導(dǎo)HMGB1易位，可與晚期糖基化終產(chǎn)物結(jié)合導(dǎo)致持續(xù)的促炎途徑激活和增強(qiáng)的心肌損傷，還可調(diào)控?zé)嵝菘说鞍爪?（HSPB1）維持線粒體形態(tài)和掌控線粒體自噬[33]。有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病心肌I/R 大鼠經(jīng)藥物治療后其心功能顯著改善，同時(shí)HMGB1 表達(dá)明顯下降[34]。本研究結(jié)果提示HMGB1可促進(jìn)糖尿病小鼠心肌I/R損傷，其機(jī)制與其介導(dǎo)線粒體自噬密切相關(guān)。

本研究結(jié)果表明，HMGB1 中和抗體能夠有效抑制心肌I/R誘導(dǎo)糖尿病小鼠心肌釋放HMGB1，且Ig-Y 空載抗體對(duì)db/db 小鼠的HMGB1 水平?jīng)]有影響，排除了空載抗體本身的影響（P＜0.05）。LC3蛋白是自噬體形成的關(guān)鍵蛋白，自噬過程中胞質(zhì)型的LC3-I被自噬相關(guān)蛋白切割后與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ，后者被招募至自噬體膜上，故一般用LC3Ⅱ/Ⅰ的比值來反應(yīng)自噬程度[35]。LC3Ⅱ/Ⅰ上升提示自噬增強(qiáng)或者自噬清除障礙。P62是自噬底物的標(biāo)志，P62 下降提示自噬增加。本研究中，I/R-G組相較于I/R-A組HMGB1明顯增加，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增加，P62 蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）。LC3 與線粒體共定位免疫熒光染色同樣顯示I/R-G組自噬與線粒體共定位強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，自噬發(fā)生在線粒體上。

綜上，HMGB1 可促進(jìn)糖尿病小鼠心肌I/R 損傷，其機(jī)制與其介導(dǎo)線粒體自噬密切相關(guān)。今后將就其具體機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。