基于單細(xì)胞RNA測序探討膀胱癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞特征的研究*

包夢穎，曾燕玉，代 艷，黃 榮，毛星寧，顏赟坤，張慶云，郭冰倩，葉 雨，莫曾南△

（廣西醫(yī)科大學(xué) 1.基因組與個(gè)體化醫(yī)學(xué)研究中心；2.廣西生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心廣西－東盟重大疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心；3.廣西基因組與個(gè)體化醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4.廣西基因組與個(gè)體化醫(yī)學(xué)研究協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530021；5.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南寧 530000；6.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧 530021）

膀胱癌是第五大常見的腫瘤，全球每年有超過43萬名患者被診斷為膀胱癌[1]。目前許多基因表達(dá)譜的研究是針對來自患者或健康人的活檢組織，在取材的過程中具有一定的損傷性。由于外周血取材簡單且不具有侵入性的損傷，因此外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）已經(jīng)成為了研究基因表達(dá)譜的重要樣本來源[2-4]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)術(shù)前中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比例（neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR）升高可預(yù)示可手術(shù)切除的泌尿系腫瘤（包括膀胱癌）預(yù)后較差[5]，這說明外周血在一定程度上能夠反映膀胱癌患者手術(shù)治療后的預(yù)后情況。但膀胱癌外周血的特征差異方面的研究較為欠缺。

單細(xì)胞RNA 測序（single cell RNA sequencing，scRNA-seq）技術(shù)是對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行RNA 測序，能夠在單細(xì)胞分辨率下生成單個(gè)細(xì)胞的獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄組并建立基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[6]。這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)在腫瘤免疫微環(huán)境[7-8]和細(xì)胞異質(zhì)性[9-10]研究方面得到廣泛應(yīng)用。Luo等[11]對終末期腎臟疾病患者的PBMC進(jìn)行scRNA-seq 技術(shù)研究，繪制了單細(xì)胞圖譜發(fā)現(xiàn)了8種新的細(xì)胞類型和揭示了細(xì)胞間的異質(zhì)性，并找到了驅(qū)動(dòng)終末期腎病的關(guān)鍵因素。

本研究的主要目的是基于scRNA-seq技術(shù)對膀胱癌患者與健康人中PBMC進(jìn)行分群，比較膀胱癌患者與健康人的PBMC中的特點(diǎn)和組成差異，為進(jìn)一步研究膀胱癌患者PBMC 提供了一個(gè)新的研究方案。

1 材料和方法

1.1 一般資料

為了反映健康人的普遍情況和腫瘤病人個(gè)體特征，收取2019 年11 月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院經(jīng)診斷為膀胱癌患者的術(shù)前肝素鈉抗凝外周血1例和收取3位健康人空腹肝素鈉抗凝外周血。

膀胱癌患者納入排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）泌尿系彩超，CT，膀胱鏡檢，病理活檢結(jié)果術(shù)前診斷為膀胱尿路上皮癌；（2）術(shù)后病理診斷為尿路上皮癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前接受過放化療治療；（2）患者有自身免疫性疾病，或腎功能不全等疾病。

健康人納入排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡在55～75歲；（2）既往未合并高血壓、糖尿病、痛風(fēng)、自身免疫性疾病、肝腎功能不全、傳染性疾病、高類固醇血癥和腫瘤疾病。

本研究中研究患者為男性，64 歲，病理結(jié)果診斷為膀胱尿路上皮癌T2aN0M0。健康人分別是男性，59歲；男性，68歲；女性，68歲。本研究通過了廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 試劑、儀器和分析軟件

1.2.1 試劑和儀器 人PBMC 分離液購于北京索萊寶科技有限公司；杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS）購于加拿大維森特公司；紅細(xì)胞裂解液購于美國Bio-Legend 公司；臺(tái)盼藍(lán)購于美國Gibco 公司。水平離心機(jī)購于湘儀離心機(jī)儀器有限公司；單細(xì)胞油包水制備和轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建試劑盒（Chromium Single Cell 3’GEM,Library&Gel Bead Kit v3、Chromium Chip B Single Cell Kit 和Chromium i7 Multiplex Kit）、Chromium Single Cell Controller 購于美國10X Genomics公司。

1.2.2 分析軟件 Cell ranger（version 3.1.0），R 語言（version 3.5.1），Rstudio，單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)分析Seurat包。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PBMC 制備 按照1∶1 比例用DPBS 稀釋肝素鈉抗凝血。按照分離液和血液2∶1的比例將稀釋后的血液緩慢滴加至人PBMC 分離液液面上。500 g，無剎車離心25 min。吸出離心后分離出的白膜層，用5倍的DPBS清洗后，350 g，離心5 min收集細(xì)胞。加入5 mL 紅細(xì)胞裂解液裂解10 min 后加入等量的DPBS 混勻后，350 g，離心5 min。棄去上清后，用DPBS 清洗一遍后，再加入適當(dāng)體積的DPBS重懸，臺(tái)盼藍(lán)染色鏡檢計(jì)數(shù)和計(jì)算細(xì)胞活率，要求細(xì)胞活率大于80%。

1.3.2 PBMC 單細(xì)胞RNA 測序 采用基于液滴的scRNA-seq 平臺(tái)，按照10X Genomics Single Cell 3'v3試劑盒的說明書中的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行油包水與文庫制備。其中1位膀胱癌患者的PBMC作為一例樣本上機(jī)，健康人PBMC 的樣本是由3 個(gè)健康人的PBMC懸液等比例均勻混合成一例PBMC的樣本上機(jī)。在芯片上分別加入樣本（每個(gè)樣本加載細(xì)胞數(shù)為22 000 個(gè)），Master Mix,Gel Beads 和Partitioning Oil，在Chromium Single Cell Controller 儀器中形成油包水GEMs (Gel Bead-in-Emulsions)。再進(jìn)行細(xì)胞裂解與RNA 逆轉(zhuǎn)錄后，將cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增純化，片段化，加接頭和Index 構(gòu)建文庫，最后用illumina測序儀進(jìn)行測序。

1.4 單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)分析

1.4.1 原始數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)質(zhì)控 首先將測序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成Fastq文件，并比對人類基因組序列對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理。然后用Cell Ranger V3.1.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步質(zhì)控和生成生成基因表達(dá)矩陣(matrix.mtx.gz)，基因表(genes.tsv.gz)和細(xì)胞條形碼表(barcodes.tsv.gz) 文件。然后使用R3.5.1 和Seurat3.1.1 對數(shù)據(jù)進(jìn)一步處理，過濾排除掉線粒體基因比例較高的細(xì)胞，通過設(shè)定閾值，過濾掉基因數(shù)小于200 或大于3 000 以及線粒體基因比例大于10%的低質(zhì)量細(xì)胞。然后將不同細(xì)胞之間變異差異系數(shù)較大的1 500個(gè)基因挑選出進(jìn)行后續(xù)的分析。

1.4.2 降維聚類和細(xì)胞注釋 根據(jù)MergeSeurat 功能將健康人PBMC 和膀胱癌患者PBMC 這兩例數(shù)據(jù)整合在一起，運(yùn)行主成分（principal component，PC）分析，用ElbowPlot 函數(shù)繪制所有PC 的分布點(diǎn)圖，取拐點(diǎn)處對應(yīng)的PC作為dim值。選擇合適的分辨率，用FindClusters 功能將細(xì)胞聚類。接下來，使用FindAllMarkers功能來查找每種類型細(xì)胞之間的差異基因。根據(jù)細(xì)胞差異基因和細(xì)胞類群特征基因的表達(dá)對細(xì)胞進(jìn)行注釋。

2 結(jié)果

2.1 單細(xì)胞測序分析膀胱癌外周血轉(zhuǎn)錄組特異性的流程

為了繪制膀胱癌患者和健康人PBMC 單細(xì)胞圖譜，探究PBMC細(xì)胞亞群之間的差異特征和發(fā)現(xiàn)特異類群。從1例膀胱癌確診患者的術(shù)前外周血和3 位健康人的外周血中分離出單個(gè)核細(xì)胞，制成PBMC 懸液，利用10X Genomics 單細(xì)胞RNA 測序平臺(tái)進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序，得到了1例膀胱癌患者和1例健康人的PBMC數(shù)據(jù)。利用Cell Ranger對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，從健康人的PBMC數(shù)據(jù)中獲得了11 602 個(gè)細(xì)胞，膀胱癌患者PBMC 中獲得了9 480 個(gè)細(xì)胞。再用R3.5.1 和Seurat3.1.0 對處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析過濾掉低質(zhì)量的細(xì)胞后進(jìn)行后續(xù)的生物信息學(xué)分析，見圖1。

2.2 健康人和膀胱癌患者PBMC scRNA-seq 數(shù)據(jù)分析

首先分別比較健康人和膀胱癌患者PBMC 單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)中每個(gè)細(xì)胞的基因數(shù)、count 數(shù)、線粒體分布和血紅蛋白基因分布情況（圖2A、圖2B），以及計(jì)算出每個(gè)細(xì)胞count 數(shù)分別與線粒體基因占比、基因數(shù)之間的關(guān)系（圖2C、圖2D）。根據(jù)圖中的基因數(shù)和線粒體數(shù)分別設(shè)置過濾參數(shù)，設(shè)定閾值，過濾掉基因數(shù)小于200 或大于3 000 以及線粒體基因比例大于10%的低質(zhì)量細(xì)胞。過濾掉低質(zhì)量數(shù)據(jù)后得到來自健康人PBMC的7 523個(gè)細(xì)胞和來自膀胱癌患者PBMC的5 289個(gè)細(xì)胞。

2.3 健康人和膀胱癌患者PBMC 單細(xì)胞圖譜聚類結(jié)果

隨后使用Seurat 包中的MergeSeurat 函數(shù)將過濾掉低質(zhì)量數(shù)據(jù)后的健康人PBMC 和膀胱癌患者PBMC數(shù)據(jù)整合在一起，應(yīng)用PC分析和基因表達(dá)的相似性評估，利用FindClusters功能，將PC分布中的拐點(diǎn)值20作為dim值，分辨率設(shè)置為0.28，最終整合后的PBMC 被細(xì)分為15 群（圖3A、圖3C）。健康人PBMC 和膀胱癌患者PBMC 有很強(qiáng)的重合性，基本每個(gè)類群的細(xì)胞在兩例PBMC數(shù)據(jù)中均能找到，僅第11群主要來自膀胱癌患者（圖3B）。

圖1 膀胱癌患者和健康人PBMC提取和單細(xì)胞RNA測序流程圖

圖2 健康人和膀胱癌患者PBMC數(shù)據(jù)質(zhì)控

圖3 健康人和膀胱癌患者PBMC的UMAP聚類圖

根據(jù)每個(gè)亞群特征基因表達(dá)情況來對各亞群進(jìn)行注釋命名（圖4A，表1），從整合后的外周血數(shù)據(jù)中鑒定出了T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞、髓系細(xì)胞和血小板。根據(jù)CD3D、CD3E、CD3G、CD4、CD8A和CD8B基因的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞被分成了7群，并且鑒定出0、6、12 群為CD8+T 細(xì)胞，2、4、8、13 群為CD4+T 細(xì)胞（圖4B）。根據(jù)T 細(xì)胞不同功能狀態(tài)的特征基因的表達(dá)（表1），分別定義出初始T 細(xì)胞（na?ve T cells）、效應(yīng)性T細(xì)胞（effector T cells）、細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）、中央記憶性T細(xì)胞（central memory T cells）、效應(yīng)記憶性T 細(xì)胞（effector memory T cells）和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）。

根據(jù)自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞的特征基因NCAM1(CD56)、FCGR3A(CD16)、NKG7的表達(dá)，將1、3群定義為NK細(xì)胞（圖4B）。第14群既表達(dá)NK 細(xì)胞基因又表達(dá)T 細(xì)胞基因，同時(shí)特異表達(dá)增殖性基因MKI67和TUBB（圖4A），將其定義為增殖性的NKT 細(xì)胞（proliferative NKT cells）。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了7、10、11 這三個(gè)亞髓系細(xì)胞群，分別是經(jīng)典單核細(xì)胞（classical monocytes）、非經(jīng)典單核細(xì)胞（non-classical monocytes）和粒細(xì)胞（granulocytes），見表1。

2.4 各類型細(xì)胞在外周血中分布和特征

在整合后的PBMC 數(shù)據(jù)中，T 細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的50%以上，其中CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞各占一半。NK 細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的26%，髓系細(xì)胞占7.5%，B細(xì)胞占6.4%，血小板占1.9%（圖5A左）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)占比最多的細(xì)胞亞群是CD8+效應(yīng)性T 細(xì)胞（19.6%），最少的細(xì)胞亞群是增殖性的NKT 細(xì)胞（0.4%）。

接著分別對膀胱癌患者和健康人的PBMC 中各個(gè)亞群細(xì)胞分布進(jìn)行研究（圖5A右）。對比發(fā)現(xiàn)健康人PBMC 中CD8+T 細(xì)胞占比更多（占比31.6%），特別是CD8+效應(yīng)性T 細(xì)胞（占比24.2%）。而CD4+T細(xì)胞在膀胱癌患者PBMC中占比更多，尤其是CD4+記憶性T細(xì)胞，CD4+初始T細(xì)胞和Treg細(xì)胞在患者PBMC 中占比顯著高于健康人。特別是發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者和健康人PBMC 中的髓系細(xì)胞類群也有較大的差異，健康人PBMC中經(jīng)典單核細(xì)胞和非經(jīng)典單核細(xì)胞均多于膀胱癌患者，但粒細(xì)胞幾乎完全來源于在膀胱癌患者。

通過研究健康人和膀胱癌患者PBMC 中CD8+效應(yīng)性T細(xì)胞的基因的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)患者的CD8+效應(yīng)性T 細(xì)胞和健康人CD8+效應(yīng)性T 細(xì)胞的基因具有很強(qiáng)的相關(guān)性。不同的是膀胱癌患者中高表達(dá)DUSP2、CXCR4等基因，而健康人高表達(dá)GNLY、IFITM2、IL7R和S100B(圖5B)，這提示著健康人PBMC中的效應(yīng)性T細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的殺傷功能。

圖4 特征基因在各類群細(xì)胞的表達(dá)情況展示

表1 各個(gè)類群定義細(xì)胞類型的特征基因

圖5 各細(xì)胞亞群在外周血中的占比

3 討論

膀胱癌是較為常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，具有易復(fù)發(fā)和預(yù)后較差的特點(diǎn)[16]。目前有關(guān)膀胱癌患者的外周血方面的研究并不是很多。之前有人對淺表非侵襲性和侵襲性尿路上皮癌患者的外周血中的髓系細(xì)胞進(jìn)行研究[17]，他們在膀胱癌患者的PBMC 中發(fā)現(xiàn)了粒細(xì)胞型和單核細(xì)胞型這兩類髓樣細(xì)胞亞群。Audenet 等[18]發(fā)現(xiàn)高危非肌層浸潤型膀胱癌（Non-muscle Invasive Bladder Cancer，NMIBC）患者的PBMC的免疫表型與健康人的有顯著差異，但是這項(xiàng)研究主要對PBMC中的T細(xì)胞和NK細(xì)胞進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)NMIBC患者中NK細(xì)胞的數(shù)量會(huì)顯著高于健康人。以上研究主要基于流式細(xì)胞術(shù)探討已知細(xì)胞標(biāo)志的類群，并且其結(jié)果與筆者scRNAseq結(jié)果有一定相似性。流式細(xì)胞術(shù)是利用已知的抗體標(biāo)記細(xì)胞，其參數(shù)有限，并且熒光通道間會(huì)有干擾，因此流式細(xì)胞術(shù)不利于發(fā)現(xiàn)罕見的或者新的細(xì)胞類群，對目的細(xì)胞的其他特點(diǎn)無法進(jìn)一步探索，更無法研究細(xì)胞間的異質(zhì)性。而scRNA-seq 是在單細(xì)胞水平上同時(shí)表征數(shù)千個(gè)細(xì)胞基因表達(dá)譜的最新方法[19]，能夠無偏倚的揭示每個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)譜，揭示每個(gè)細(xì)胞特點(diǎn)和特異的基因結(jié)構(gòu)，是發(fā)現(xiàn)新的免疫細(xì)胞群體和細(xì)胞間異質(zhì)性的好方法。

本研究利用scRNA-seq技術(shù)的優(yōu)勢對健康人和膀胱癌患者的PBMC做細(xì)致分群，比較來自不同樣本的各細(xì)胞亞群。結(jié)果顯示，筆者將健康人和膀胱癌患者的PBMC細(xì)分了15群，其中包括3個(gè)CD8+T細(xì)胞亞群，4 個(gè)CD4+T 細(xì)胞亞群。本研究還發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者PBMC 中以CD4+T 細(xì)胞為主，CD4+Treg細(xì)胞比率較健康人顯著增高。而CD8+T 細(xì)胞較健康人相比顯著減少，尤其是具有殺傷功能的效應(yīng)性T 細(xì)胞，同時(shí)健康人CD8+效應(yīng)性T 細(xì)胞中高表達(dá)顆粒溶素GNLY基因，提示著具有更強(qiáng)的殺傷性。以上這些結(jié)果表明膀胱癌患者中機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)受到抑制，可能與膀胱癌患者免疫功能低下以及跟腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。特別是筆者在膀胱癌患者的PBMC中發(fā)現(xiàn)了粒細(xì)胞，這一結(jié)果與Eruslanov 等[17]發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者中循環(huán)的粒細(xì)胞數(shù)量明顯增加的結(jié)果相一致。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與利用流式細(xì)胞術(shù)對PBMC的研究和既往對膀胱癌病人PBMC相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)相吻合且有新的發(fā)現(xiàn)，由此可以說明本研究利用scRNA-seq 技術(shù)成功建立了研究膀胱癌病人PBMC 的特征的方法，也為后續(xù)進(jìn)一步研究膀胱癌患者PBMC 的特征奠定了研究基礎(chǔ)和提供了一定的參考依據(jù)。但本研究也具有一定的局限性，由于研究的樣本量太少，發(fā)現(xiàn)的結(jié)果僅具有一定的提示性，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。