柿的遺傳多樣性及育種研究進(jìn)展

羅正榮，張青林，徐莉清，郭大勇

(園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430070)

中國是柿(DiospyroskakiThunb.)的原產(chǎn)地，也是世界范圍內(nèi)柿樹栽培歷史最悠久、面積最大和年產(chǎn)量最高的國家[1]。中國大陸、日本、韓國和巴西是柿的傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)。近年來，西班牙的柿生產(chǎn)規(guī)模增長較快，年產(chǎn)量已躍居世界第2位。其他有商品生產(chǎn)的國家還有阿塞拜疆、烏茲別克斯坦、意大利、以色列、新西蘭、澳大利亞、智利及美國等。在部分國外尤其是日本學(xué)者的文獻(xiàn)中，柿被認(rèn)為是東亞原產(chǎn)[2]，其英文名稱常被寫成“Japanese persimmon”[3]，柿的原產(chǎn)地還存在著一些爭(zhēng)議。柿的園藝學(xué)分類始于19世紀(jì)末，日本學(xué)者藤井將其歸于仁果類[4]，后來菊池將其另立為假仁果類[5]。中國曾將其與棗單列為柿棗類[4]。此外，俞德浚根據(jù)果實(shí)結(jié)構(gòu)和利用特點(diǎn)將其歸為漿果類[5]。但歐美早期的園藝學(xué)分類體系，通常未包含柿、棗、楊梅等東亞果樹。柿的園藝學(xué)分類尚未取得完全一致意見。有關(guān)柿屬植物遺傳多樣性及其利用研究進(jìn)展，羅正榮等早期曾有論及[6]。筆者重點(diǎn)對(duì)柿的遺傳多樣性及育種研究中的若干問題進(jìn)行探討，以期引起相關(guān)專家或同行關(guān)注。

1 柿屬植物及其利用途徑的多樣性

柿屬植物數(shù)量較多，但不同時(shí)期和不同作者的報(bào)道很不一致。俞德浚認(rèn)為近200種，中國原產(chǎn)15種[5]；李樹綱則認(rèn)為共約500種，中國原產(chǎn)57種、6變種和1變型[7]。

柿屬植物用途廣泛、尤其適合加工。羅正榮等曾總結(jié)其作為木材(烏木和陰沉木)、果實(shí)(鮮食和加工)、藥用、觀賞以及茶飲等方面的應(yīng)用途徑[6]。王勇等總結(jié)柿單寧結(jié)合金屬和蛋白質(zhì)，抗氧化、抗菌，作為皮革鞣制劑，可用作生物降解材料的輔劑，以及改性聚丙烯酸系高分子吸水樹脂制備等新的應(yīng)用領(lǐng)域[8]。最近，以柿單寧為主要原料的除異味劑、護(hù)膚品和洗浴用品，如抗菌牙膏、美容香皂、保濕的洗發(fā)水和沐浴露等已經(jīng)上市[9]。此外，柿單寧在吸附和回收重金屬離子方面的效應(yīng)也引起廣泛關(guān)注[10]。

尤其值得注意的是，在中國長期存在爭(zhēng)議的柿“醉酒”(drunken sickness)或“醒酒”(dispel the effects of alcohol)問題最近有了新的進(jìn)展。日本島根大學(xué)Itamura教授團(tuán)隊(duì)證明，在飲酒前30 min食用脫澀后的西條果實(shí)(主產(chǎn)于日本島根縣一帶的完全澀柿地方品種，單果重約150～200 g)1個(gè)或柿餅(含水量32%)2個(gè)，可有效抑制飲用日本清酒后血液中酒精濃度的上升，具有防止醉酒或減輕“隔日醉”(宿醉)的作用[11]；基于該功能開發(fā)出的“晚夕飲力”(banyu-inryoku)清涼飲料產(chǎn)品(50 mL/瓶)已經(jīng)上市[9]。此外，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)李春美教授團(tuán)隊(duì)通過離體人工胃液模擬、活體動(dòng)物試驗(yàn)、志愿者試食及產(chǎn)區(qū)調(diào)查等系列研究發(fā)現(xiàn)，健康成人每日食用2個(gè)恭城水柿(鮮重約400～500 g)不會(huì)導(dǎo)致“結(jié)石”(gastric phytobezoar，又稱“胃柿石”)[12]。因此，食用脫澀后的澀柿及可自然脫澀的甜柿，對(duì)胃部無基礎(chǔ)性疾病的消費(fèi)者而言發(fā)生“胃柿石”風(fēng)險(xiǎn)極低。

新型冠狀病毒肺炎發(fā)生后，抗病毒藥物篩選在世界范圍內(nèi)取得一定成效。據(jù)2020年9月15日《ANN》電視臺(tái)報(bào)道，日本奈良縣立醫(yī)科大學(xué)的研究者發(fā)現(xiàn)柿單寧具有使新冠肺炎病毒無害化的功能，在人類唾液和新冠病毒的混合液中加入高濃度柿單寧后，成功抑制了病毒活性(圖1)，可望開發(fā)出相關(guān)產(chǎn)品并用于新冠肺炎預(yù)防。推測(cè)其作用機(jī)制可能是柿單寧被吸附在新冠肺炎病毒表面蛋白質(zhì)上，從而使其喪失感染能力，但具體作用機(jī)制目前尚不完全明晰。

圖1 2020年9月15日ANN電視新聞畫面(截屏)

2 柿屬植物染色體倍性多樣性

柿屬植物主要分布在熱帶或亞熱帶。溫帶分布的除柿外，還有美洲柿(DiospyrosvirginaniaL.)、君遷子(DiospyroslotusL.)、油柿(DiospyrosoleiferaCheng)和老鴉柿(DiospyrosrhombifoliaHemsl.)等少數(shù)種類。柿屬植物染色體倍性已經(jīng)明確的約占10%，其中在熱帶或亞熱帶分布的多為二倍體(2n = 2X=30)；但其向北亞熱帶和溫帶的遷移過程中，染色體加倍后形成栽培柿(2n=6X=90，2n=9X=135)。盡管其細(xì)節(jié)尚不完全清楚，但其演化過程大概率地涉及2n配子參與。

通過2n花粉途徑形成合子胚后，由于胚乳平衡數(shù)不正常，必須幼胚搶救培養(yǎng)才能獲得雜交后代；而2n卵細(xì)胞與正?；ǚ凼芫罂僧a(chǎn)生種子而無需幼胚培養(yǎng)。因此，柿屬植物從2倍體向6倍體或9倍體的演化過程可能與2n卵細(xì)胞的參與有更加密切的關(guān)系。Zhuang等發(fā)現(xiàn)平核無和宮崎無核等品種為天然9倍體(2n=9X=135)，表現(xiàn)為3倍體的染色體行為和偽單性結(jié)實(shí)特性，且生長發(fā)育正常[13]。京都大學(xué)學(xué)者發(fā)現(xiàn)不完全甜柿品種禪寺丸含有2n花粉，采用細(xì)胞篩過濾出2n花粉并授粉次郎，采用幼胚搶救培養(yǎng)可獲得9倍體[14]；通過該途徑，日本福岡縣的科技人員成功獲得世界首例無核和大果的9倍體完全甜柿[15]。京都大學(xué)Tao教授團(tuán)隊(duì)證明日本原產(chǎn)完全甜柿品種藤原御所能產(chǎn)生未減數(shù)胚囊[16](圖2)。因此，以藤原御所為母本，以正常減數(shù)分裂的花粉供體為父本，可望在不需要幼胚搶救培養(yǎng)的前提下獲得9倍體無核甜柿新種質(zhì)。上述成果不僅為栽培柿起源和演化研究提供了新的科學(xué)依據(jù)，也為柿的遺傳改良奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

圖2 日本甜柿品種藤原御所具有未減數(shù)胚囊的形成能力[16]

中國中部大別山區(qū)原產(chǎn)的中國羅田甜柿鮮食口感佳，但其果小、籽多的缺陷限制其直接作為果實(shí)商品的應(yīng)用價(jià)值。利用2n配子的倍性操作途徑可望實(shí)現(xiàn)其定向遺傳改良，最終培育出具自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的大果、無核中國甜柿新品種。

3 柿品種脫澀類型多樣性與甜柿起源

柿在植物分類學(xué)上屬單一種，但其種下變異極為豐富[6]。首先，柿有完全甜柿(pollination constant & non-astringent persimmon，PCNA，簡稱甜柿)和非完全甜柿(non-PCNA，簡稱澀柿)之分，甜柿自然脫澀的程度，澀柿自然或人工脫澀的難易均有差異；其次，柿的果實(shí)形狀、大小、肉質(zhì)、果皮底色和面色、果肉褐斑有無和程度、種子有無與數(shù)量、單寧細(xì)胞大小與密度、果實(shí)成熟期，以及采后果實(shí)的加工適應(yīng)性等也呈現(xiàn)出明顯的差異；而且，柿既有只著生雌花或雄花的完全雌株或完全雄株，也有雌雄同株異花的雜性株，以及雌雄同花的完全花株。此外，柿與君遷子的嫁接親和性也存在從形態(tài)學(xué)到生理學(xué)的廣泛差異。

完全甜柿被認(rèn)為由完全澀柿(pollination constant & astringent persimmon，PCA)直接突變而成，且中國甜柿和日本甜柿為獨(dú)立起源。日本甜柿(JPCNA)和中國甜柿(CPCNA)自然脫澀受不同基因位點(diǎn)控制，前者為促進(jìn)單寧生物合成的A基因發(fā)生隱性突變而致，后者則與抑制單寧生物合成的B基因有關(guān)；非完全甜柿的果實(shí)脫澀與控制揮發(fā)性產(chǎn)物釋放的C基因相關(guān)[17]。

日本甜柿起源地狹窄，其遺傳一致度較高，長期的雜交育種已經(jīng)在單果重、產(chǎn)量和樹勢(shì)等方面表現(xiàn)明顯的近交退化現(xiàn)象[17]。而且日本甜柿自然脫澀性狀受隱性基因控制，其與非完全甜柿雜交F1單株均為非完全甜柿，即使與日本原產(chǎn)完全甜柿回交，其BC1代中僅出現(xiàn)15%完全甜柿(六倍體遺傳特點(diǎn))。因此，相對(duì)獨(dú)立起源且自然脫澀性狀受顯性單基因控制的中國甜柿在完全甜柿遺傳改良中具有重大的利用價(jià)值。

中國甜柿自然脫澀關(guān)鍵基因尚不完全清楚，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柿團(tuán)隊(duì)最近鑒定到一個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子DkMYB14，其既可作為轉(zhuǎn)錄抑制因子抑制單寧(原花青素)的生物合成，又可作為轉(zhuǎn)錄激活因子促進(jìn)乙醛的生物合成，從而促進(jìn)可溶性單寧向不溶性單寧的轉(zhuǎn)變。因此，DkMYB14具有轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制的雙重功能[18]。

4 柿的花性多樣性及性別決定機(jī)制與單性結(jié)實(shí)品種培育

柿的花性非常復(fù)雜。從單花水平看，有雄花、雌花和完全花等3種類型。從個(gè)體水平看，可分為完全雄株(僅著生雄花)、完全雌株(僅著生雌花)、雌雄同株異花(雌花和雄花共存)、雌全同株(雌花和完全花共存)、雄全同株(雄花和完全花共存)、三全同株(雄花、雌花和完全花共存)和完全花株(僅著生完全花)等7種類型。最近，柿屬植物性別決定機(jī)理的研究取得突破性進(jìn)展[19]。二倍體的君遷子(2n=2x=30)Y染色體上包含有雄性性別決定區(qū)域，其中的1個(gè)性別決定基因OGI(Oppressor of MeGI)編碼小RNA并特異剪切MeGI(Male Growth Inhibitor)使植株表現(xiàn)雄性；在6倍體的栽培柿(2n=6x=90)中，OGI啟動(dòng)子區(qū)域的268 bp Kali片段插入可導(dǎo)致OGI沉默，并使MeGI啟動(dòng)子發(fā)生甲基化而促進(jìn)smMeGI產(chǎn)生，從而使MeGI表達(dá)受到抑制，最終表現(xiàn)為雄花發(fā)育。因此，雌雄同株異花栽培柿的性別表現(xiàn)在不同年份和單株間不太穩(wěn)定(圖3)。

Akagi利用君遷子F1代雄性/雌性性狀分離群體，通過集團(tuán)分離分析法-擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(BSA-AFLP)技術(shù)篩選到一個(gè)與雄性性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記DlSx-AF4S[20]。張平賢等發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記對(duì)已知性別試材的鑒別率達(dá)96.6%；在已知花性的F1代個(gè)體中的鑒別率可達(dá)90.2%[21]。Zhang利用君遷子的OGI 標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)其在50份已知性別基因型中的鑒別率為100%；在F1代單株中的鑒別率89.5%。說明DlSx-AF4S和OGI標(biāo)記在柿屬植物性別鑒定中具有較高的通用性[22]。利用上述兩個(gè)標(biāo)記，可望在早期篩選僅開雌花的F1單株，從而在選育單性結(jié)實(shí)的完全甜柿新種質(zhì)中應(yīng)用。

圖3 柿屬植物性別進(jìn)化模型圖[20]

5 小結(jié)

完全甜柿是世界范圍內(nèi)產(chǎn)業(yè)發(fā)展和品種選育的重點(diǎn)目標(biāo)，但其主栽品種均源自日本，與中國作為原產(chǎn)國和產(chǎn)業(yè)大國的地位不符。且日本甜柿的土壤適應(yīng)性較差，尤其是優(yōu)質(zhì)品種與中國傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)普遍采用的砧木君遷子嫁接親和性較差。而且，日本甜柿核心親本的遺傳一致度較高，長期的雜交育種已經(jīng)面臨近交退化的困境。此外，日本甜柿自然脫澀性狀受隱性基因控制，只有日本甜柿間相互雜交才能獲得完全甜柿后代。

中國甜柿包括羅田甜柿、鄂柿1號(hào)、小果甜柿、寶蓋甜柿和四方甜柿等多種類型，集中分布在中國中部的湖北、河南、安徽等三省交界的大別山區(qū)。中國甜柿與日本甜柿在果實(shí)發(fā)育的早期單寧細(xì)胞較小且果實(shí)成熟期均可在樹上自然脫澀的特點(diǎn)類似，但中國甜柿自然脫澀在果實(shí)成熟前才能完成。與日本甜柿僅靠“稀釋效應(yīng)”完成自然脫澀過程明顯有別，中國甜柿的自然脫澀過程可能與果實(shí)成熟前由乙醛介導(dǎo)的可溶性單寧的不溶化過程(簡稱“凝固效應(yīng)”)具有更直接的關(guān)系。因此，以優(yōu)質(zhì)日本甜柿或主栽非完全甜柿為母本，以中國甜柿為父本，通過常規(guī)雜交和分子標(biāo)記早期選擇可望快速獲得兼具兩者優(yōu)良性狀的甜柿新種質(zhì)。此外，選育與君遷子嫁接親和的優(yōu)質(zhì)甜柿品種,也是中國柿產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展亟待解決的關(guān)鍵問題。