檢測桑葉農藥殘留的酶抑制速測卡篩選與應用

孫海燕，陳偉國，張芬，楊一平

（海寧市蠶桑技術服務站，浙江海寧 314400）

檢測桑葉農藥殘留的酶抑制速測卡篩選與應用

孫海燕，陳偉國，張芬，楊一平

（海寧市蠶桑技術服務站，浙江海寧 314400）

采用農藥殘留速測卡檢測和養(yǎng)蠶生物試驗對比，篩選出適合桑葉農藥殘留快速檢測的酶抑制速測卡，并建立了10種有機磷和氨基甲酸酯類農藥的速測卡檢測校準參考值，為速測卡應用于養(yǎng)蠶生產中預防桑葉農藥殘留超標提供了參考。

酶抑制；速測卡；桑葉；農藥殘留

近年來，隨著農藥種類和使用量的不斷增多，農藥污染對養(yǎng)蠶危害的問題日趨凸顯。2006年海寧、桐鄉(xiāng)蠶區(qū)因收蟻期間稻田使用毒死蜱農藥污染桑園，造成近8萬張蠶種中毒；2007年春蠶期錢江生化生產阿維菌素污染海寧、嘉興和海鹽交界地區(qū)桑園，3齡蠶開始發(fā)生大面積中毒，損失6348張。零星或小范圍的養(yǎng)蠶農藥中毒更是數不勝數，程度輕的尚可挽回一些損失，中毒重的甚至出現絕收。要減少養(yǎng)蠶農藥中毒損失，除了有關部門加強農藥質量管理和規(guī)范使用指導外，對蠶桑技術部門來說，需要對桑葉進行必要的農殘監(jiān)測，以便于提早發(fā)現桑葉中是否含有較高的農藥殘留，避免家蠶因食用農殘超標的桑葉而引起中毒。

酶抑制法快速檢測技術是利用農藥殘留量對膽堿酯酶抑制率的相關性原理，通過顯色反應表現檢測結果，攜帶方便的快速檢測卡已在蔬菜、水果農藥殘留速測上應用較多，在國家標準GB/T 5009.199—2003《蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留量快速檢測》中明確了檢測方法［1-3］。酶抑制速測卡的檢測對象是目前使用量大、毒性較高的有機磷和氨基甲酸酯兩大類農藥。為將這一技術應用于養(yǎng)蠶生產預防農藥中毒事故，我們對多種農藥殘留速測卡檢測桑葉農殘反應進行了對比篩選，結合家蠶生物毒性試驗建立常用農藥在桑葉上殘留檢測反應校準參數，提高其實用性和可靠性，現將初步試驗結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

農藥速測卡：市場供應的5種酶抑制農藥殘留速測卡產品供試，見表1。

供試農藥：酶抑制法農藥殘留檢測對象是有機磷和氨基甲酸酯兩類農藥，從中選擇了在桑園和周圍其它農作物中常用的10種農藥，見表2。

供試桑樹：3年生盆栽桑，強桑1號和農桑14號，樹形矮小，方便農藥處理。

供試蠶品種：白玉×秋豐，3齡起蠶。

1.2 試驗方法

1.2.1 農藥處理

40%樂果乳油、45%馬拉硫磷乳油、77.5%敵敵畏乳油、40%辛硫磷乳油、20%亞胺硫磷乳油均為1000倍稀釋液，90%敵百蟲晶體、40%毒死蜱乳油、20%滅多威乳油、8%殘殺威可濕性粉劑、20%丁硫克百威乳油均為1500倍稀釋液。每種農藥處理濃度各噴于4株盆栽桑上，桑葉正反面完全噴濕為度。

1.2.2 農藥殘留速測卡檢測方法

上海捷門保林邁生物工程有限公司生產的農藥殘留快速測試卡使用方法：洗脫液滴于桑葉表面并輕輕摩擦，將桑葉上的液滴滴在加樣孔中，預反應10 min后將結果觀察孔中的保護片抽出，捏合速測卡上緣使酶片與底物反應，5 min后根據觀察孔顏色變化判讀檢測結果。其它4種農藥殘留速測卡的使用方法：洗脫液滴于桑葉表面并輕輕摩擦，將桑葉上的液滴滴在白色藥片上，10 min后對折速測卡，使紅色藥片與白色藥片疊合發(fā)生反應，用手捏緊3 min后根據白色藥片的顏色變化判讀結果。白色藥片變藍色為陰性，表明農藥殘留較量低于檢測限；不變色或變色不明顯為陽性，表明農藥殘留量達到了檢出范圍。每種速測卡每次檢測時均以洗脫液作空白對照。

1.2.3 對家蠶殘毒試驗方法

用于農藥速測卡檢測的同一殘毒桑葉樣本同時進行家蠶生物試驗，以無毒桑葉為空白對照，重復4次，每個小區(qū)20頭3齡起蠶，48 h后調查各處理的中毒情況并計算死亡率。

2 試驗結果

2.1 農藥殘留測試卡的篩選

通過5種速測卡對10種農藥的檢測反應，與家蠶殘毒飼養(yǎng)試驗結果對比，不同速測卡對供試農藥的檢測反應存在較大差異。3號、4號、5號速測卡的靈敏度明顯低于養(yǎng)蠶生物試驗；2號速測卡對敵百蟲和丁硫克百威的檢測反應最強，但對其余8種農藥的測試反應低于1號測試卡；1號速測卡與養(yǎng)蠶生物試驗最為接近。根據檢測對比結果綜合評價，1號速測卡（上海捷門保林邁生物工程有限公司生產的農藥殘留快速測試卡）最佳，2號速測卡（廣州新原生物技術有限公司生產的高靈敏度農藥速測卡）次之。

表1 供試酶抑制農藥殘留速測卡Table 1 The pesticide residue fast detecting cards with enzyme inhibition

再從1號速測卡和2號速測卡的保存要求、包裝方式等進一步比較。由于酶抑制農藥殘留速測卡具有生物活性成份，忌光、熱、潮濕，要求在4℃冰箱中保存，拆開密封包裝袋后最好在1 W內用完。1號速測卡最小包裝為2片，恰好滿足一次使用，1片為農藥殘留樣本測試，1片為空白對照測試。而2號速測卡的10片包裝如短時間內不能用完，會產生不必要的浪費。據此，選定上海捷門保林邁生物工程有限公司生產的農藥殘留快速測試卡為桑葉農藥殘留檢測品種。

2.2 測試結果與校準

從表3可看出，40%樂果乳油、45%馬拉硫磷乳油、77.5%敵敵畏乳油、40%辛硫磷乳油、20%亞胺硫磷乳油的1000倍稀釋液噴于桑葉后，對3齡起蠶的殘毒期不超過5 d。采用上海捷門保林邁農藥殘留快速測試卡檢測同一桑葉樣本，陽性反應的間隔天數均大于對3齡起蠶的殘毒期，表明檢測靈敏度高于養(yǎng)蠶生物試驗；但對不同農藥品種的反應差異較大，其中40%樂果乳油1000倍和45%馬拉硫磷乳油1000倍噴藥后1 d對3齡起蠶無中毒反應，測試卡的陽性反應分別為噴藥后3 d和5 d；20%亞胺硫磷乳油1000倍噴藥后3 d對3齡起蠶無中毒反應，而速測卡陽性反應持續(xù)到噴藥后7 d，兩者的差值最大。

由表4可見，90%敵百蟲晶體1500倍噴藥后12 d的桑葉對3齡起蠶無急性毒性表現，速測卡檢測為陰性，兩者結果一致；20%滅多威乳油和8%殘殺威可濕性粉劑1500倍噴藥后13 d的桑葉，速測卡檢測結果均為陰性，對3齡起蠶無中毒癥狀分別在12 d和14 d，正負各差1 d；40%毒死蜱乳油1500倍噴藥后17 d的桑葉對3齡起蠶無急性毒性表現，速測卡的陽性檢測限為15 d；20%丁硫克百威乳油1500倍對3齡起蠶的殘毒期為21 d，速測卡檢測出陰性則在20 d。

表35 種短殘留農藥的速測卡檢測結果與生物毒性對照Table 35 short residual pesticide fast test card test results

表45 種中長殘留農藥的速測卡檢測結果與生物毒性對照Table 45 long residual pesticide fast test card test results

根據10種供試農藥的速測卡檢測結果與3齡起蠶生物毒性試驗對比值（表5），提出相應的校準參考值。由表5可見，速測卡檢測出轉陰性與對3齡起蠶無急性中毒間隔天數的差值表現出一定的規(guī)律性，對家蠶殘毒期短的農藥，速測卡檢測的靈敏度更高；對家蠶殘毒期較長的農藥，速測卡的檢測限則偏低；其原因既與速測卡對不同農藥的生物反應差異有關，也與不同農藥對家蠶的毒性差異有關。對于明確的單一農藥可參照表5校準速測卡檢測。

3 小結與討論

3.1 酶抑制速測卡的主要優(yōu)點

酶抑制法農藥殘留速測卡具有操作簡便、不需要配制試劑、不需要專業(yè)的技術培訓，方便貯存和攜帶等優(yōu)點。試驗結果表明，對生產中常用的有機磷和氨基甲酸酯兩類10種農藥都能夠進行有效檢測。而有機磷類和氨基甲酸酯類農藥是目前國內生產量最大、品種最多、使用頻率最高的農藥［2］。因此，測試卡的檢測應用范圍很廣，可用于養(yǎng)蠶生產中預防桑葉農藥殘留超標的現場快速初篩檢測，也可作為農藥中毒事故現場診斷的輔助手段。

3.2 酶抑制速測卡的限制因素

酶抑制檢測原理僅對有機磷和氨基甲酸酯兩類農藥有效，而且不同種類農藥對農藥速測卡的呈色反應靈敏度不同［4］。酶抑農藥殘留速測卡具有生物活性，一般要求在4～10℃條件下冷藏保存，否則因酶的活性降低而失效。由于農藥速測卡法顯色反應靈敏度與農藥的種類有關，檢測結果不能保證所檢桑葉樣本對家蠶安全，因此，最好配合生物試驗等措施來預防養(yǎng)蠶中毒事故。

3.3 酶抑制速測卡檢測桑葉農殘的應用評價

從本試驗結果看，酶抑制速測卡對短殘毒農藥的檢測靈敏度高于養(yǎng)蠶生物試驗，對養(yǎng)蠶安全是有利的，但也可能帶來不必要的誤測誤報；對中長殘毒農藥的檢測靈敏度與養(yǎng)蠶生物試驗相差約±1～2 d，表明兩者吻合度較高。再從生產實際分析，桑園施用短殘毒農藥往往在距蠶期較近，用藥謹慎度較高，安全間隔期相對穩(wěn)定可控，一般不須進行針對性檢測；而中長殘留農藥的殘毒期受多種因素影響表現出波動，是養(yǎng)蠶生產中導致中毒損失的主要素之一，因此，進行針對性的殘留毒性檢測十分必要，具有較高的實用價值。

［1］陳勝，劉立群，周輝棠，等.農藥速測卡的研制與應用［J］.檢驗檢疫科學，2000，10（2）：1～3.

［2］王多加，胡祥娜，周向陽，等.蔬菜農藥殘留快速檢測技術—膽堿酯酶速測卡法［J.食品科學，2003，24（6）：109～113.

［3］許美玲，劉仲昌.農藥速測卡與氣相色譜法測定蔬菜中有機磷農藥殘留量的比較［J］.臨床和實驗醫(yī)學雜志，2006，5（5）：576～577.

［4］張英，喬方，孔文，等.農藥速測卡法和氣相色譜——質譜聯用法分析蔬菜中有機磷農藥［J］.深圳職業(yè)技術學院學報，2003，2（4）：21～25.

Selection and Application of Pesticide Residue Fast Detecting Cards with Enzyme Inhibition for Mulberry Leaves

SUN Hai-yan,CHEN Wei-guo,ZHANG Fen,YANG Yi-ping
（Haining Sericultural Technics Service,Haining 314400 Zhejiang,China）

The detection results of pesticide residue fast detecting cards were contrasted with biological test results of silkworm rearing.And the pesticide residue fast detecting cards with enzyme inhibition especially suitable for mulberry leaves detection were chosen.And the calibration of reference value of 10 organophosphorus and carbamate pesticides were determined.

enzyme inhibition;fast detecting card;mulberry leaf;pesticide residue

S884.9

A

0258-4069［2014］03-012-04

浙江省重點科技創(chuàng)新團隊項目（2011R50028-19）

孫海燕（1980-），男，浙江海寧人，農藝師，從事蠶桑技術推廣工作。E-mail：sunhy123@hotmail.com